低氧环境诱导外泌体源性miR‑141‑3p调控滋养细胞生物学功能的研究

Hypoxic environment induces exosome‑derived miR‑141‑3p to regulate the biological function of trophoblast cells

摘要

目的 研究低氧环境诱导外泌体释放miR‑141‑3p，并调控滋养细胞的生物学功能，为进一步研究miR‑141‑3p在子痫前期发病机制中的作用提供理论基础。 方法 采用体外培养人绒毛膜滋养细胞HTR‑8/SVneo，并将其分为常氧组和低氧组。通过使用CCK‑8实验、克隆形成实验评估各组细胞的增殖活性；使用Transwell实验评估各组细胞侵袭和迁移能力；使用Western blot技术检测外泌体的存在；使用透射电镜技术观察分离得到的外泌体的分子形态；通过纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体的粒径和浓度；使用qRT‑PCR检测各组细胞和外泌体中miR‑141‑3p的表达水平。 结果 对比常氧组，低氧组的HTR‑8/SVneo细胞和外泌体中的miR‑141‑3p表达量升高，细胞的增殖活性和迁移、侵袭能力下降。而常氧组细胞的miR‑141‑3p表达量下降，增殖活性增加，侵袭细胞数量增多（P<0.01）；使用Western blot检测外泌体标志蛋白呈强阳性表达。 结论 低氧条件下，外泌体中的miR‑141‑3p的表达水平上调，抑制细胞的增殖和侵袭、迁移能力。外泌体源性miR‑141‑3p可以调节滋养细胞的生物学功能。

Abstract

Objective To study that the hypoxic environment induces the release of miR‑141‑3p from exosomes and regulates the biological function of trophoblast cells， as well as to provide a theoretical basis for further studies on the role of miR‑141‑3p in the pathogenesis of preeclampsia. Methods Human chorionic trophoblast cells HTR‑8SVneo were cultured in vitro and divided into a normoxic group and a hypoxic group. The proliferative activity of the cells in each group was assessed by using the CCK‑8 assay and clone formation assay； the invasive and migratory abilities of the cells in each group were assessed by using the Transwell assay. Western blot was used to detect the presence of exosomes. Transmission electron microscopy was used to visualize the molecular morphology of the isolated exosomes. The particle size and concentration of exosomes were detected by nanoparticle tracking analyzer. qRT‑PCR was used to detect the expression level of miR‑141‑3p in each group of cells and exosomes. Results Compared to the normoxic group， the miR‑141‑3p expression in HTR‑8/SVneo cells and exosomes was elevated， and the proliferative activity and migration and invasive abilities of the cells in the hypoxic group were decreased， while the miR‑141‑3p expression was decreased， the proliferative activity was increased， and the number of invasive cells was increased in the normoxic group （P<0.01）； Western blot showed a strong positive expression of exosome marker proteins. Conclusion The expression level of miR‑141‑3p in exosomes is up-regulated under hypoxic conditions， inhibiting cell proliferation and invasive and migratory abilities. Exosome‑derived miR‑141‑3p can regulate the biological functions of trophoblast cells.

Graphical abstract

关键词

子痫前期 / 低氧 / 外泌体 / 滋养细胞 / miR‑141‑3p

Key words

Preeclampsia / Hypoxia / Exosomes / Trophoblast / miR‑141‑3p

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的常见并发症^［1］，其特征是血压升高，并伴有蛋白尿、水肿，甚至脏器损伤^［2］，其发病率3%~8%^［3］，是孕产妇及胎儿死亡的重要原因^［4］，目前PE病因及发病机制仍不清楚。近年，有研究发现，PE的发病基础是滋养细胞侵袭不良导致螺旋动脉重塑不足导致胎盘形成异常^［3］。胎盘氧化应激增加并刺激胎盘合胞层释放细胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）^［5，6］。EVs分为3个主要群体：凋亡小体、微泡和外泌体。外泌体通过体内依赖途径释放，传递核酸、蛋白质、脂质等代谢产物，参与细胞间通讯、细胞迁移等过程^［7］。miRNA主要通过外泌体途径从滋养层细胞释放到母体循环，细胞外的miRNA被证明是稳定的，并且不受RNase降解的保护，这意味着它们可以作为潜在的生物标志物^［8］。课题组前期研究发现miR‑141‑3p与PE密切相关^［9，10］，缺氧会刺激滋养细胞入侵母体子宫内膜，并影响子宫动脉重塑^［6］。缺氧是PE发病的中心环节，目前鲜有研究低氧外泌体miR‑141‑3p与PE。本研究观察低氧条件下细胞及外泌体中miR‑141‑3p表达水平的变化，以及绒毛外滋养细胞生物学的改变，以期为PE的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养条件

人滋养层HTR‑8/SVneo细胞株，购自雅吉生物（上海，中国），培养于含10%胎牛血清和1%青/链霉素（P/S）的RPMI‑1640（以上产品均购自于Gibco公司）培养基中。将其分为常氧组（37 ℃、5% CO₂、21% O₂）；低氧组（37 ℃、5% CO₂、1% O₂）。

1.2 CCK‑8实验

采用CCK‑8（碧云天，中国）测定HTR‑8/SVneo细胞增殖能力。细胞增殖活性可能受时间的影响，将HTR‑8/SVneo细胞2×10³个/孔数量接种到96孔板，分别培养培养12、24、48、72 h。为了评估细胞增殖情况，在每板加入10 μL CCK‑8试剂孵育1 h，然后用酶标仪评估450 nm处的光密度（OD）值。

1.3 细胞克隆形成实验

取对数生长期的HTR‑8/SVneo细胞，胰蛋白酶充分消化成单细胞并稀释后在6孔培养板中培养，各实验组每孔接种500个细胞数量。每3~4 d观察细胞生长情况并更换1次完全培养基。当培养板中出现肉眼可见的细胞团块时，大约为14 d左右，停止培养，随后使用PBS试剂洗涤3次，每孔加入适量 4%多聚甲醛固定细胞15 min，弃去固定液后加入结晶紫染液染色30 min；PBS洗涤染色液，室温风干，最后使用常规数码相机拍照，计数。

1.4 Transwell实验

Transwell实验分为侵袭及迁移。Transwell侵袭实验用Matrix‑Gel™基质胶（C0372‑碧云天‑中国）铺在细胞培养小室（14341 PC膜，6.5 mm，孔径8.0 μm，ABSELECT‑中国）大约风干4 h，基础培养基细胞悬液200 μL加入Transwell小室，同时将600 μL完全培养基添加到下腔室。Transwell迁移实验则是使用不加基质胶的细胞培养小室，其余同侵袭实验。测定在37 ℃下培养。孵育后，用4%多聚甲醛固定迁移的细胞，然后用1%结晶紫染色（赛维尔‑中国）。200倍显微镜下随机选5个视野观察细胞，进行计数。

1.5 细胞上清液提取及纯化外泌体

HTR‑8/SVneo细胞使用无外泌体的培养基分别培养12、24、48 h，试剂盒法提取外泌体（宇玫博‑上海‑中国），取各时间点的细胞上清液20 mL细胞上清液，在4 ℃条件下以3 000×g离心10 min，然后将离心后的上清液转移到新的50 mL离心管中，加入exosome concentration solution试剂5 mL，涡旋振荡器震动1 min将其混匀，随后放置于4 ℃冰箱静置至少2 h，取出混合液的离心管在4 ℃条件下以10 000×g离心60 min，弃去上清液，取200 μL的1×PBS均匀吹打离心沉淀物，待其混匀后，再将重悬液移至新的1.5 mL离心管中，随后将其于4 ℃条件下以12 000×g离心2 min，保留上清液（其中富含外泌体颗粒），将外泌体颗粒粗品转入exosome purification filter上室中，再于4 ℃条件下以3 000×g离心10 min，最后收集离心后的EPF柱管底的液体，以50~100 μL进行分装保存，然后进行鉴定。

1.6 外泌体通过透射电子显微镜鉴定

将10 μL新制备的外泌体悬液加入等体积4%多聚甲醛混合液移到200目的铜网上静置，1 min后用滤纸将铜网上的外泌体混合液样品吸干，然后用加入约10 μL 3%醋酸铀染色液，在室温下进行1 min染色。若铜网可见较明显吸附物，可用纯水滴加表面，快速吸去，反复几次清洗。使用滤纸将铜网上的外泌体样本吸干，然后风干，置于透射电子显微镜（TEM，HT‑7800，日本东京）下观察外泌体的形态并拍照。

1.7 纳米颗粒粒径分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）

打开仪器（ZetaView^® PMX120）电源、电脑软件，确认状态框内系统连接正常。使用注射器（10 mL）匀速注射至少5 mL蒸馏水（0.5~1 mL/s）后，注射5 mL校准溶液（1∶250 000）将样品池洁净并安装至激光模块上，仪器检验校准合格后，进行聚焦优化，最后执行对称性测试，生成一条抛物线。如这条抛物线自动出现在analysis菜单中，表明样品池很干净，将提取的外泌体样本1 μL加入到新的1.5 mL EP管中，再加入999 μL DPBS尝试稀释1 000倍，用1 mL注射器将稀释后的溶液上样，避免产生气泡并观察屏幕中颗粒画面，调整焦距，点击OK后，就可以进行样品测试、结果分析及数据处理。

1.8 Western blot

将制备的外泌体样本加入等体积外泌体蛋白专用裂解液（宇玫博‑上海‑中国），混匀后置于冰上裂解10 min，在4 ℃条件下以12 000×g离心5 min取其上清液，用BCA试剂盒（赛维尔‑中国）检测时，将样品稀释5倍，在减小试剂对OD值影响条件下测定蛋白浓度，取30 μL的外泌体蛋白在10% SDS‑PAGE变性丙烯酰胺彩色凝胶电泳上进行层析后，湿转法转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜‑赛维尔‑中国），采用快速封闭液（碧云天‑中国）封闭15 min，加入一抗TSG101（1∶2 000）、CD9（1∶2 000）、CD63（1∶1 000）和CD81（1∶2 000）（以上抗体均购自碧云天‑中国），4 ℃摇床过夜，然后在孵育辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）前后使用TBST（赛维尔‑中国）洗3次，每次10 min，在室温摇床状态下孵育二抗1 h后滴加增强型化学发光检测试剂（碧云天‑中国）使用全自动化学发光图像分析仪（4600SF）进行显色、成像，Adobe Photoshop 2022软件进行作图分析。

1.9 qRT‑PCR检测细胞及外泌体miR‑141‑3p的表达

使用细胞RNA提取专用试剂盒（普洛麦格‑上海‑中国）和外泌体RNA提取专用试剂盒（EZB‑exo‑RN1‑美国）提取总RNA，加尾法进行逆转录（microRNA reverse transcription kit）（EZB‑miRT2‑美国），然后用2×qPCR mix for microRNA（ROX2 plus）（EZB‑miQP2‑美国）进行RT‑qPCR检测，引物序列如下：miR‑141‑3p Forword：CTGGGTCCATCTTCCAGTACA；Reverse：GGGAGCCATCTTTACCAGACA；U6作为内参，引物序列由试剂盒里提供，然后行2^-△△CT方法分析miR‑141‑3p的表达，GraphPad Prism 8作图分析。

1.10 统计学处理

本研究采用GraphPad Prism 8.0进行数据的统计分析和数据可视化处理；计量资料采用（\overline{x}\pm s）表示，两组数据之间的统计学分析采用t检验，多组数据之间的统计学分析采用one‑way ANOVA检验。RT‑qPCR荧光定量数据使用2^-△△CT方法计算；NTA检测使用Origin 2021作图与分析，Western blot使用ImageJ分析，使用Excel归一化数据处理。P<0.05为差异具有统计学意义。以上实验均重复3次。

2 结果

2.1 常氧组及低氧组HTR‑8/SVneo细胞增殖情况

本研究使用CCK‑8法检测对照组和低氧组HTR‑8/SVneo细胞12、24、48、72 h，结果显示HTR‑8/SVneo细胞在低氧条件下的细胞相对活力在12 h和24 h无明显变化，从低氧48 h开始降低（P<0.05），在72 h的细胞相对活力最低（P<0.0 001），差异均具有统计学意义，见图1。细胞克隆形成实验显示，HTR‑8/SVneo细胞在低氧条件下克隆形成能力明显降低，见图2A、B。

2.2 常氧组及低氧组HTR‑8/SVneo细胞侵袭和迁移情况

Transwell实验结果显示，低氧组HTR‑8/SVneo细胞侵迁移和侵袭能力均降低，差异均具有统计学意义（P<0.01），见图3。

2.3 外泌体鉴定结果

NTA检测与透射电镜TEM检测结果显示，使用NTA检测外泌体的粒径和浓度，常氧组的颗粒直径大约为135 nm，浓度大约为6.590×10⁶/mL，见图4A；而低氧组的颗粒直径大约为165 nm，浓度大约为4.059×10⁸/mL，见图4B；TEM检测分离的外泌体在常氧组与低氧组的外泌体均具有典型的双层膜结果，见图4C、D；Western blot检测结果显示，TSG101、CD9、CD63和CD81在外泌体中均强阳性表达，在细胞中表达不稳定，见图5。上述结果符合外泌体的基本特征，确定分离外泌体，在同等条件下分离出的外泌体，低氧组的浓度与粒径高于常氧组。

2.4 常氧组及低氧组中细胞和外泌体中miR‑141‑3p的相对表达量

细胞miR‑141‑3p与外泌体miR‑141‑3p的表达结果显示：与常氧相比，低氧条件下外泌体miR‑141‑3p和细胞miR‑141‑3p的表达升高，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图6。

3 讨论

PE是妊娠20周以后发生的妊娠期特有的以高血压、蛋白尿为特征，多系统受累的孕期综合征，是导致孕产妇及围产儿死亡率高的重要原因之一^［11］。世界范围内，PE的发病率可达3%~8%^［12］。高龄是PE的独立危险因素^［13］，目前尚无有效的治疗方法^［14］，其发病机制仍不清楚^［15］。

外泌体是胞间信息交流的重要载体，它是胞内多泡体与细胞膜融合后释放至细胞外的一种膜性小囊泡，其内含物包括蛋白、脂质和核酸（如microRNA，miRNA）等，外泌体不仅能够定向运输各种活性分子传递信号，也能够通过受体介导的交互作用调控靶细胞的生理活动。可以说，外泌体在细胞‑细胞及细胞‑胞外环境之间的交流过程中发挥重要的信号传递功能^［16］。越来越多的研究表明，外泌体源性miRNA具有相对的稳定性，这意味着它可以作为潜在的生物标志物^［17］。鉴于其稳定的信息载体功能及运输能力，外泌体miRNA有望成为PE新的诊断依据^［18］。

慢性缺氧会诱发胎盘的形态、分子和功能变化，这些变化与在患有PE的妇女的胎盘中观察到的变化非常相似^［19］。缺氧对HTR‑8/SVneo细胞 miRNA的调控作用已有报道，而外泌体与细胞miR‑141‑3p相关研究还鲜有报道，miR‑141‑3p的表达及含量的改变与缺氧微环境关系密切。低氧环境可能对滋养细胞和外泌体miR‑141‑3p的表达有影响，本研究在常氧和低氧条件下分别培养HTR‑8/SVneo细胞，并提取细胞上清液的外泌体，基于前期工作的基础，在缺氧条件下从细胞和外泌体中筛选、鉴定miR‑141‑3p等关键调控因子，从细胞和分子层次探讨低氧对滋养细胞生物学行为的影响。

本研究首先以1%氧浓度在体外进行PE发病机制的探索，在常氧和低氧条件下分别培养HTR‑8/SVneo细胞，通过CCK‑8检测细胞的增殖能力，结果显示HTR‑8/SVneo细胞在低氧条件下的细胞相对活力在12 h和24 h无明显变化，从低氧48 h开始降低（P<0.05），在72 h的细胞相对活力最低（P<0.000 1），差异均具有统计学意义。细胞克隆形成实验验证的细胞增殖能力的结果与CCK‑8检测结果相符。通过Transwell检测细胞的侵袭和迁移能力，结果发现低氧条件下细胞侵袭和迁移能力均降低（P<0.01），CCK‑8实验、细胞克隆形成实验、Transwell实验验证滋养细胞增殖活性、侵袭和迁移能力，发现低氧对滋养细胞增殖活性及侵袭和迁移能力有抑制作用。此外，本研究提取了上述细胞的上清液，并用试剂盒提取、纯化外泌体，经透射电镜检测分离的外泌体的分子形态，纳米颗粒示踪分析检测外泌体的粒径及浓度，结果提示低氧条件下外泌体的粒径和浓度高于常氧条件。经过3次实验，结合透射电镜与纳米颗粒示踪分析考虑低氧条件下促进外泌体的释放并且促进外泌体之间的聚集。Western blot检测TSG101、CD9、CD63和CD81的表达，结果确认分离外泌体成功，并显示低氧促进外泌体的释放。本研究还检测了两组滋养细胞和外泌体的miR‑141‑3p的表达，结果显示低氧组滋养细胞和外泌体miR‑141‑3p具有高表达。随着低氧条件的进行，出现部分细胞的坏死，但低氧条件下48 h后细胞miR‑141‑3p仍具有高表达，而外泌体中其表达量随着时间推移逐渐增加，可能是外泌体miRNA具有稳定性，并且不受RNase降解的保护原因。

综上所述，低氧影响滋养细胞和外泌体miR‑141‑3p表达水平，可能对滋养细胞增殖、侵袭和迁移功能具有抑制作用。低氧环境下外泌体miR‑141‑3p表达上调抑制滋养细胞增殖活性及侵袭、迁移能力，进而影响胎盘发育参与PE的发病。本研究为研究PE的发病机制提供了理论基础。

作者贡献度说明：

周波：设计论文框架、实施研究过程、整理数据、撰写并修改论文；王玲、窦永超：论文评阅与意见；吴栋才：论文选题、实验过程中问题解惑、参与论文修订、审核论文、论文最终版本修订。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82060285)