肠安康治疗溃疡性结肠炎的作用机制研究

Effect of ChangAnKang on ulcerative colitis based on network pharmacology

摘要

目的 应用网络药理学与分子对接研究肠安康对溃疡性结肠炎的疗效及机理。 方法 基于 TCMSP数据库，对肠道安康的药效物质基础进行筛选，采用 Pubchem、 Swisstarget prediction及 Uniprot等数据库，获得药效物质基础。利用 Genecards， DisGeNET， OMIM等数据库获得 UC相关靶基因。使用String及Cytoscape3.9.1构建肠安康治疗溃疡性结肠炎的蛋白‑蛋白相互作用网络，通过 GO、 KEGG等生物信息学分析，利用 Autodock软件对其关键靶标进行分子对接，预测其作用机制。建立小鼠溃疡性结肠炎模型，通过HE染色检测肠安康对溃疡性结肠炎的影响，并验证网络药理学信号通路预测结果。 结果 本研究共筛选出93个活性成分、227个作用靶点、2 545个疾病相关靶点，“药物‑活性成分‑作用靶点”共有333个节点和1 078条边。利用 GO、 KEGG等方法，对上述20个基因进行了初步的生物学功能及信号途径的筛选。分子对接结果表明，核心组分与核心靶标之间存在良好的结合能。 结论 肠安康有效改善溃疡性结肠炎形态学结构。肠安康通过其主要活性成分槲皮素，刺芒柄花素，山柰酚等，调节 RXRA， AR，RB1，IL6等靶基因的表达。尤其在调节细胞自噬、炎症反应和巨噬细胞极化等生物学过程上发挥关键作用，从而发挥治疗溃疡性结肠炎的作用。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of ChangAnKang in treating ulcerative colitis. Methods Using TCMSP database， we identified the active components of ChangAnKang. Using Pubchem， Swisstarget forecast and Uniprot database， we got the potential action targets of TCM active ingredients.Target genes of ulcerative colitis were acquired by Genecards， DisGeNET and OMIM. Using STRING and Cytoscape 3.9.1， the protein‑protein interaction network for treating ulcerative colitis was constructed， and then analyzed with GO and KEGG. Finally， by using Autodock， the binding probability of the core chemical composition with the core target was predicted. A model of ulcerative colitis was established to detect the effect of intestinal health on ulcerative colitis by HE staining and to verify the prediction results of the network pharmacological signaling pathway. Results A total of 93 active ingredients， 227 targets and 2 545 disease‑related targets were identified in this study， and the "drug‑active ingredient target" network had 333 nodes and 1 078 edges.The enrichment of GO and KEGG was used to identify the first 20 biological functions and signaling pathways. It was found that there was good binding probability of the core chemical composition with the core target. Conclusion ChangAnKang effectively improves the morphological structure of ulcerative colitis. ChangAnKang may regulate cancer pathway， hepatitis B， MAPK signaling pathway， PI3K‑AKT signaling pathway， human cytomegalovirus infection， chemical carcinogenesis‑receptor‑initiated， Toll‑like receptor signaling pathway through the main active ingredients， quercetin， prickly aristolochicin， kaempferol and other signaling pathways， exerting a therapeutic effect on ulcerative colitis.

Graphical abstract

关键词

溃疡性结肠炎 / 信号通路 / 炎症因子 / 网络药理学 / 分子对接验证

Key words

Ulcerative colitis / Signaling pathways / Inflammatory factors / Network pharmacology / Molecular docking validation

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以直肠和结肠黏膜为主要病变的炎症性肠道疾病，95%的患者可累积直肠，并可持续发展至结肠。主要表现为黏液脓血便，腹痛，腹泻，或上腹痛，下腹部疼痛；具有全身性症状、持续时间长、易复发的急危重症患者的治疗困难^［1］。其中80%以上的病人在患病过程中会感觉到疲惫、乏力，其中半数以上的病人都会因病情发作而对工作、学习造成影响，即使是一些女性病人，也会因为病情的发展而影响到她们的生育能力^［2，3］。虽然对溃疡性结肠炎的认知和治疗已有很大进展，然而，在临床使用中，一些病人仍然对其无应答或不耐受，但也有一定的风险和毒副作用。中医认为，UC的发生与感受外邪，饮食失调，情绪紊乱有密切关系。中医药治疗溃疡性结肠炎有其独到之处，可采用中药内服法，临床上根据患者的病情变化进行灵活诊治、随证加减用药。此外，穴位埋线、中药灌肠、针刺、艾灸等外治法通过不同的途径以达到治疗疾病的目的。因此，对UC的治疗药物进行研究和创新，以管理和治疗这一复杂的难治性疾病是十分重要的。

目前，国内许多脾胃学者已将 UC患者的临床症状、体征归入“久痢”一类，但其发病机制尚不明确。另外，在治疗 UC的过程中，也要针对病情的不同阶段进行针对性的用药，如果是活跃期的 UC，应该在清热毒、凉血化瘀的基础上，在缓解期，应该使用祛湿、补虚等药物来维持治疗。肠安康是在《伤寒论》白头翁汤合，《外台秘要》黄连解毒汤的基础上加减而成，由白头翁，黄连，黄柏，焦白术，黄芪，茯苓，三七，赤石脂组成，具有清热利湿健脾之功效。对千余例来自海内外的活动期UC患者的临床治疗发现，肠安康能够消除肠道炎症，改善肠道微循环，快速愈合溃疡面，有良好的临床治疗效果。然而，肠道安康对消化道疾病具有良好的疗效，但其抗溃疡性结肠炎的药效物质基础及作用机理尚不清楚。因此，本项目拟采用网络药理学、分子对接等手段，从体内、体外两个层面，系统地研究肠安抗 UC的药效物质及可能的作用机理。

1 材料与方法

1.1 肠安康活性成分及相关性靶点筛选

本项目拟采用 TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/），以口服生物利用度（OB）30%、类药性（DL）不低于0.18为筛选指标，通过检索，确定肠安康中的药效物质基础。对于在TCMSP数据库中未能检索的药物，可借助ETCM（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）数据库进行查询，并结合查阅已发表的文献来收集药物成分。利用SwissADME平台（http：//www.swissadme.ch/index.php）进行活性成分筛选，从而确定药物有效活性成分。通过SwissTargetPrediction平台（http：//swisstargetprediction.ch/）做靶点预测。为确保规范化蛋白质作用靶点，利用Uniprot资料库（https：//www.uniprot.org/）对筛选后的蛋白质作用靶点信息进行标准化统一。

1.2 溃疡性结肠炎疾病靶点筛选

以“Ulcerative colitis”为关键词，检索Genecards（https：//www.genecards.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、OMIM（https：//omim.org/）数据库找到治疗 UC的新靶标。进入DRUGBANK数 据 库（https：//www.drugbank.ca）寻找西药治疗溃疡性结肠炎的一线作用靶点^［4］。在Genecards数据库中，Score的数值越大，说明这个靶标和疾病的相关性就越强。以 Score高于中位数的靶点及 DisGeNet数据库中 Score>0.1的靶标作为治疗 UC的潜在靶标。整合数据库中的靶标信息，剔除重复数值，获得 UC发病靶标。

1.3 肠安康主要活性成分‑溃疡性结肠炎疾病靶点PPI网络构建、功能与通路富集分析

在此基础上，采用 R语言画出交集靶向 Venny图谱，以明确肠安康治疗 UC的作用靶标与靶标之间的交互作用。向 String数据库提交交集靶标信息（https：//string-db.org/）建立蛋白质互作网络图^［5］，在隐藏自由节点的情况下，设置“Homo sapiens”的生物类别，设置“highest confidence”的最小交互阈值。其他的设定都是默认的，得到 PPI网路。同时，利用CytoScape3.9.1中的 MCODE plugin，对蛋白互作网络进行深入解析，获得可能的蛋白功能模块，并结合所涉及的生命过程来阐述其功能。

利用Metascape平台（https：//www.metascape.org/gp/index.html）获取全面基因注释功能数据资料^［6，7］。在此基础上，以肠道安康为研究对象，在 Metascape平台中，设定 P<0.01，对干预前后的主要生物进程及代谢途径进行富集分析，并对数据进行可视化处理。

1.4 肠安康主要活性成分‑溃疡性结肠炎疾病靶点‑信号通路网络图构建

运用CytoScape3.9.1构建肠安康主要活性成分‑溃疡性结肠炎疾病靶点‑信号通路网络图，并采用内置软件，对中药药效物质基础和靶点进行网络拓扑结构特征（如连接度、中介度、紧密性等）的分析，确定其关键靶标和发挥功效的物质基础。

1.5 分子对接验证

通过对肠道安康的有效组分‑ UC靶点网络图谱的中等值排序，寻找对应的 PDB，登入Systems Dock Website（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/ home/index），5个靶标与肠安康的主要有效组分对接^［8］，以 Docking Score评分为依据，对 UC发病靶标与肠道安康药效物质的结合强度和活性进行评价。最后，将计算得到的结合能进行可视化。

1.6 实验动物及试剂

40只SPF级雄性Wistar大鼠，体质量（220±20） g，生产批号： SYXK （黑）2016‑008，黑龙江省中医研究院试验动物研究所生产。碧云天生物技术有限公司生产的苏木素伊红染色试剂盒。本研究由黑龙江省伦理委员会审查黑龙江省中医药科学院（编号：2015‑64）。

1.7 受试药及制备

肠安康由黄连（批号：23010501，四川），黄柏（批号：22090406，四川），白头翁（批号：23020509，黑龙江），焦白术（批号：22030615，浙江），黄芪（批号：23010609，内蒙古），茯苓（批号：22061116，云南），三七（批号：22090106，云南），赤石脂（批号：23030126，甘肃）组成，由黑龙江省中医药科学院提供。肠安康由黄连6 g，黄柏10 g，白头翁10 g，焦白术10 g，黄芪20 g，茯苓15 g，三七5 g，赤石脂15 g。将中药浸提2次，滤去残渣，在旋转蒸发器中进行浓缩（浓度2 g/mL），放入已消毒的玻璃瓶内，置4 ℃冰箱待用。柳氮磺胺吡啶（SASP），上海三维药厂生产，批号：22201203。

1.8 建立UC模型、分组及给药

大鼠实验室常规条件饲养，按体质量随机分为空白对照组、模型对照组、SASP组、肠安康组。除空白对照组大鼠外，各组均以10%硫酸镁溶液为饲料，3 mL/头，2次/日，3 d后，24 h不能进食。将2%戊巴比妥钠麻醉大鼠体内固定，直灌胃针在离肛管8 cm左右（结肠）位置，并用注射器慢慢注射2 mL 6 mL的冰醋酸，空白对照组注入等体积生理盐水。再注入0.3 mL空气，封闭大鼠肛门1.5 h^［7，8］。大鼠自然清醒后，灌胃给予空白对照组和模型对照组大鼠生理盐水（10 mL/kg，1次/d），给予SASP组大鼠柳氮磺胺吡啶（0.5 g/kg，1次/d）^［9］，给予肠安康组大鼠中药肠安康（5.98 mL/kg，2次/d）^［10］，连续处理21 d，实验期间各组大鼠自由饮食。

1.9 结肠组织形态

制备结肠组织石蜡切片：末次给药后大鼠禁食24 h，大鼠麻醉处死后迅速截取全段结肠（距肛门处2~10 cm），生理盐水除去肠内容物，PBS水洗2遍，10%甲醛溶液固定24 h，用酒精梯度法将石蜡包埋，每5 μm厚的石蜡切片，干燥后，放置在切片盒中，待用。用二甲苯 Ⅰ~15 min，二甲苯 Ⅱ 15 min，100%乙醇Ⅰ 15 min，100乙醇Ⅱ 15 min，95%乙醇Ⅰ5 min，95%酒精Ⅱ5 min，80%乙醇Ⅱ5 min，80%乙醇Ⅱ5 min，30%乙醇5 min，去离子水10 min，苏木素染色4 min，1%盐酸水溶液5 min，2次洗涤后弱氨水变为蓝色。用伊红染12 min，再用80%乙醇5 s、95%乙醇5 s、100%酒精Ⅰ5 min、100%酒精Ⅱ10 min、二甲苯Ⅰ10 min、二甲苯 Ⅱ 10 min。用中性树胶封片法，在显微镜下进行观察。

1.10 统计学处理

使用 SPSS26.0软件对所有资料进行了统计处理，全部资料以均值±标准差（\overline{x}\pm s）来表达，用one‑way ANOVA及 Tukey多项比较，用 P值来判断两组资料间的差别，P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 获取肠安康主要活性成分及靶点

通过TCMSP数据库搜索并筛选初步得到黄连、白头翁、黄柏、白术、黄芪、茯苓、三七、赤石脂主要活性成分共有112种，其中白头翁11种、茯苓15种、黄柏37种、黄连14种、黄芪20种、白术7种、三七8种。根据TCMSP数据库所得黄连、白头翁、黄柏、白术、黄芪、茯苓、三七靶点共240个，通过Uniprot数据库添加靶点的基因名称，得到具有基因名称的靶点234个。见表1。

2.2 溃疡性结肠炎疾病相关靶点获取

Genecards数据库中获取溃疡性结肠炎疾病靶点，并通过Score值大于中位数的目标靶点条件筛选得到疾病靶点2 426个。OMIM数据库筛选得到疾病靶点30个靶点，DisGeNET数据库筛选得到疾病靶点308个，DrugBank数据库筛选得到疾病靶点60个，以上疾病靶点去除重复值后共计获得2 545个。

2.3 肠安康主要活性成分‑溃疡性结肠炎疾病靶点PPI网络构建

将筛选出的靶点与 UC发病靶标进行交叉，用 R语言作 Weiss绘图，获得 UC共有靶标149个，见图1。通过 STRING数据库，构建了“肠道安康‑ UC”靶点蛋白互作网络，如图2。在蛋白质相互作用的复杂网络中，有一个高度偏密度的区域叫做模块。鉴于 Module是一类重要的生物活性成分，本项目拟在构建肠道安康‑ UC蛋白互作网络的基础上，深入解析肠道安康‑溃疡性结肠炎蛋白互作网络。利用CytoScape3.9.1中的 MCODE插件，对蛋白互作关系进行了解析，得出了模型，如图3所示。以 P值为基础，将 PPI网络和模块中3个得分最好的生物过程进行了功能说明。见表2。

2.4 肠安康主要活性成分‑溃疡性结肠炎疾病靶点功能与通路的富集分析

采用 Metascape数据库技术，对肠安康干预 UC的作用靶标和信号通路进行分析，并结合 OriginLab软件进行验证。由此可以看出，在 UC发病过程中，多个靶标的作用是密切相关的。本项目拟以肠道安康为研究对象，以 RNA聚合酶 Ⅱ为研究对象， 正向调控 RNA聚合酶 II的表达，负向调控 RNA聚合酶 Ⅱ启动子，负性调节凋亡，正向调节细胞增殖、信号传导、分化和凋亡等过程。胞内组分有核，核，质，胞质，胞浆，染色质，线粒体，胞外区，转录因子复合物等；其分子作用包括结合蛋白质，结合酶和转录因子，通过序列特异性结合、 RNA聚合酶Ⅱ（RNase Ⅱ）的近端序列与 DNA结合、 RNA聚合酶 Ⅱ转录调控区的序列特异性结合和转录调节区域的序列特异性结合。主要参与的信号通路包括癌症途径、乙型肝炎通路、化学致癌—受体激活、人类巨细胞病毒感染、丙型肝炎、脂质和动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路、癌症中的蛋白聚糖、MAPK信号通路、非酒精性脂肪性肝病、冠状病毒病、新型冠状病毒肺炎、结核、PI3K‑Akt信号通路、人T细胞白血病病毒1型感染，结果见图4。靶点通路富集结果见表3。

2.5 肠安康主要活性成分‑溃疡性结肠炎疾病靶点‑信号通路网络图构建

运用CytoScape3.9.1软件构建肠安康主要活性成分‑溃疡性结肠炎疾病靶点‑信号通路网络，见图5。利用CytoScape3.9.1内建的 Network Analyzer，对肠安康治疗 UC的网络拓扑结构进行分析，获得其核心组分和核心靶标。通过 Cytoscape网络分析，发现其药效物质主要为槲皮素、山柰酚。槲皮素的结合度为115，其中心性和均匀度分别为0.553 776和0.715 681；山奈酚连接度41，中心度0.376 361，紧密度0.079 981。次要成分可能有刺芒柄花素、异鼠李素、黄麻苷A、β‑谷甾醇、毛异黄酮、吴茱萸次碱、噢弄斯定等。见表4。靶点RXRA连接度为25，中心度为0.421 603，紧密度为0.044 965；AR连接度19，中心度为0.417 241，紧密度为0.025 555，两者可能为主要靶点，其余相对重要的靶点为RB1、IL6、MAPK14、IL10、FOS、TNF等。见表5。

2.6 分子对接验证

利用蛋白质组学技术，将 PPI网络中 degree高的靶标与肠安康的主要有效组分进行分子对接，受体分别为：RXRA（PDB ID：7A77）、AR（PDB ID：4OHA）、ESR1（PDB ID：5FQV）、F2（PDB ID：6O39）、RB1（PDB ID：7D0E）。通过结合能、氢键数等指标评价其与有机小分子的结合能力，发现其结合能越低，氢键数越多，结合能力越强。受体蛋白与配体小分子的成对结合能的结果如图6所示。图表中的标记是最小的结合能，都低于-5 kJ/mol在所有的结构中，最小的分子对接结合能的 RMSD是最低的，说明对接的结果是可信的。选择具有2个或更多个氢键的结合构型的交互作用。见图7。

2.7 对结肠组织病理形态学的影响

与空白对照组比较，实验组大鼠的结肠组织出现了明显的肿胀和病变。SASP、肠安康对上述各项指标均有不同程度的提高，尤以肠安康更为显著。光镜下观察，空白对照组大鼠结肠黏膜上皮结构基本正常，腺管排列整齐，形态清晰。模型组大鼠结肠上皮的剥离、破裂、糜烂、炎症粒细胞浸润、纤维素样物质渗出、坏死、溃疡。结果： SASP治疗组肠上皮损伤明显减轻，炎症粒细胞明显减少；肠安康组大鼠肠黏膜上皮缺失程度明显降低，溃疡周肠黏膜被上皮细胞增殖修复，溃疡面积减小，肉芽组织增生，有较好的疗效。得到的结果如图8所示。

3 讨论

UC隶属于祖国中医“腹痛”、“泄泻”、“肠风下血”、“脏毒”、“肠风”、“便血”等诸类，其病因病机复杂多样，其中以湿热、疫、寒、食、情志等最为重要。除此之外，如果受到邪毒的侵袭，饮食和情绪的影响，都会对肠道造成伤害，导致肠络不通，气血壅滞，气滞血瘀，瘀血生湿；或者是因为脾胃损伤，导致升降不畅，导致气血不畅，湿热滞留于大肠，导致肠络受损，导致痢疾、白带增多。气不畅则腹痛，里急后重^［9］。由此可见，湿热为疾病的根本，长期下去，会影响到脾肾，伤气，伤阴，伤阳，再加上饮食不当，复感外邪，就会发生本虚标实、寒热错杂的症状^［10］。所以治疗UC主要为清热化湿，调和气血，调和肝脾等治疗方法，但清肠化湿法需要贯穿始终。近年来，中医药在 UC防治中已显现其独特优势，已成为 UC的主要治法之一，其药效稳定、副作用少、复发率低，而中西医结合则能显著改善 UC的临床效果，是我国特色治法，在临床上被广泛使用。

UC的发生、发展是一个非常复杂的过程，涉及到多个基因的共同参与和交互作用。研究AR信号通路，对明确UC的发病机制提供了大量有利而可靠的依据^{［11，12］}。干预AR信号传导通路的关键因子进而阻断UC过激的炎症反应，已成为治疗UC的热点方向。在UC炎症的过程中，AR的激活都受细胞外各种信号的刺激，抑制其负反馈调节通路。最新研究表明，AR在转录水平上参与了对UC起主要致病作用的细胞因子如TNF‑α、IL‑6、IL‑10、IL‑17等的调控^{［13，14］}。IL‑6是UC发病机制中的主要促炎因子，是一种多功能，多效能的糖化蛋白因子，具有特异性结合靶细胞表面受体的特点，参与局部炎症反应过程，同时调节免疫反应^{［15，16］}。可通过AR通路诱导细胞黏附分子（ICAM‑1）的极化表达，在细胞受到外界刺激后， STAT蛋白会脱离受体，以二聚体或多聚化的方式进入细胞核，特异性地结合 DNA靶标，调控相关基因的表达，从而实现整个信号传导过程。白介素‑6 （IL‑6）是一种重要的免疫调控分子，能促进多种细胞的炎症反应，促进肝内炎症因子的释放，并促进肠上皮细胞的电解质分泌，使其通透性增加，使中性粒细胞游离于炎症部位，诱发疾病^［17］。IL‑10是一种由单核巨噬细胞和单核细胞释放的抗炎因子，而TNF‑α则是单核巨噬细胞和激活 T淋巴细胞所分泌的一种多功能细胞因子^［18］。IL‑10具有降低炎性因子TNF‑α、抑制抗原递呈等多种生物学功能，是维持肠道非炎性免疫状态、防治过度免疫应答的关键。文献报道，IL‑10基因敲除可诱发自发 UC，且IL‑10表达下调，并伴有炎性因子IL‑6、TNF‑α表达增高。IL‑17可通过激活天然免疫炎性因子、急性反应蛋白、G‑CSF及前列腺素E2等因子的表达，并与TNF‑α等存在协同效应，增强它们的炎性作用^{［19，20］}。IL‑17可诱导与炎症相关的多个基因表达（包括IL6、细胞黏附分子等）^［21］。有研究表明IL‑17不但在活动期 UC病人的肠道和血液中的表达明显高于正常人，并随着病情的加重而逐渐升高^［22］。

本课题通过研究肠安康对AR靶点的影响，揭示了肠安康治疗UC的机制可能是调控了AR信号通路异常激活，保持促炎因子和抑炎因子动态平衡，从而控制及减轻结肠黏膜炎症，保护结肠黏膜，为临床应用提供理论基础。总结来看，网络药理学的分析表明，肠安康治疗溃疡性结肠炎机制涉及其多成分、多靶点和多途径的特性，尤其在调节细胞自噬、炎症反应和巨噬细胞极化等生物学过程上发挥关键作用。分子对接验证结果证明靶点间具有较强的关联性。本研究的存在局限性，未对网络药理学所预测的关键靶点进行全面的验证，网络药理学的结果仍可以为未来深入的机制性研究提供坚实的理论基础。

作者贡献度说明：

陆振华和张国帅：实验设计与实施和数据收集与分析。范明明和张琳：文献综述和论文撰写。吕波和邱冰：论文编辑与校对。李阳光和李慧：图表制作。王欣：经费申请与管理。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

黑龙江省中医药科研项目(ZHY2020‑050)