不同多孔菌多糖对变应性鼻炎模型小鼠的作用研究

Study on the effects of polysaccharides from different polyporous fungi on allergic rhinitis model mice

摘要

目的 探讨不同多孔菌多糖对变应性鼻炎模型小鼠的作用。 方法 试验从紫芝、桑黄、茯苓3种多孔菌中提取多糖，纯化后获得紫芝多糖（GSP）、桑黄多糖（SVP）、茯苓多糖（PCP）。选取60只BALB/c雌性小鼠，使用卵清蛋白构建变应性鼻炎小鼠模型，设立空白组、模型组、阳性对照组（0.084 1 mg/kg盐酸氮卓斯汀滴鼻）、GSP组（200 mg/kg GSP灌胃）、SVP组（200 mg/kg SVP灌胃）、PCP组（200 mg/kg PCP灌胃），各组小鼠每日干预1次，持续2周。观测各组小鼠鼻部过敏症状并进行行为学评分，H&E染色法观察小鼠鼻黏膜病理学改变，ELISA法检测血清中总IgE和OVA‑sIgE含量，qRT‑PCR法检测鼻黏膜中炎症因子IL‑1β、IL‑4、IL‑6、TNF‑α相对表达水平，称量胸腺、脾脏质量，计算胸腺及脾脏指数。 结果 3种多孔菌多糖均可以缓解小鼠鼻部炎症症状，其中SVP效果最佳；SVP能够促使鼻黏膜组织恢复正常状态，降低IgE和OVA特异性IgE含量。此外，SVP可以提高胸腺指数，平衡炎症相关细胞因子相对表达水平，稳定免疫系统功能。 结论 SVP可以改善变应性鼻炎模型小鼠的疾病症状。

Abstract

Objective To investigate the effects of polysaccharides from different polyporus fungi on allergic rhinitis model mice. Methods Three kinds of polysaccharides， named GSP， SVP， and PCP respectively， were obtained from Ganoderma sinensis， Sanghuangporus vaninii and Poria cocos after purification and deproteinization. A total of 60 female BALB/c mice were utilized to establish the allergic rhinitis （AR） mouse model through the administration of ovalbumin （OVA）， and divided into the control group， the model group， the positive control group （0.084 1 mg/kg of azelastine hydrochloride nasal spray）， the GSP group （200 mg/kg of GSP i.g.）， the SVP group （200 mg/kg of SVP i.g.）， and the PCP group （200 mg/kg of PCP i.g.）. Each group of mice was intervened once every day for two weeks. Nasal allergy symptoms of mice were observed and scored. Pathological changes of nasal mucosa were detected by H&E staining， concentration of serum total IgE and OVA specific IgE were detected by ELISA. The relative expression levels of inflammatory factors IL‑1β， IL‑4， IL‑6， and TNF‑α were determined using qRT‑PCR assay. The mass of thymus and spleen was measured and the index of thymus and spleen was calculated. Results Three polysaccharides all could alleviate the nasal inflammation symptoms of AR mice， and SVP was the best. SVP could restore the nasal mucosa and reduced the concentration of serum IgE and OVA specific IgE. In addition， SVP could increase the index of thymus， balance the relative expression level of inflammation-related cytokines， and stabilized immune system function. Conclusion SVP can improve the symptoms of AR model mice.

Graphical abstract

关键词

多糖 / 变应性鼻炎 / 鼻黏膜

Key words

Polysaccharides / Allergic rhinitis / Nasal mucosa

变应性鼻炎（allergic rhinitis， AR）是一种慢性炎症疾病，主要见于机体接触变应原后造成鼻腔黏膜过敏，是全球最常见的慢性病之一，严重影响患者的生活、学习和工作，降低患者的生活质量^［1，2］。国内流行病学调查显示，AR在我国成人中的发病率已从2005年的11.1%上升到17.6%^［3］。而由于对AR的定义不同，不同调查人群会导致调查统计的患病率不同^［4］，所以在全球范围内不同的流行病学调查显示出AR患病率存在差异，其中亚洲的AR患病率约为5%~35%，具体的数值取决于对AR的定义和诊断，欧洲的患病率为25%，而全球的患病率在5%~50%之间^［5］。轻度或中度AR患者可能只有典型的鼻部症状，如鼻痒、鼻塞、打喷嚏等，但是随着病情加重，可能会进一步导致焦虑、抑郁、记忆力减退等脑功能类并发症^［6，7］。目前，AR治疗的一线用药只能缓解症状，无法根治^［8-11］。因此寻找能够调节免疫系统并改善过敏性炎症反应的药物成为研究的热点之一。

多糖是菌物的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、调节免疫等多重药理学功能，在疾病的预防和治疗中有重要作用^［12-14］。研究表明，多糖可以与巨噬细胞表面的模式识别受体结合，调控炎症因子表达，进而调节机体免疫功能^{［15，16］}。本研究选取3种经报道具有抗炎活性的食药两用多孔菌——紫芝、桑黄、茯苓，探究其多糖在体内对AR模型小鼠的作用效果，并探讨其可能的作用机制，为AR治疗药物及菌物多糖资源利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c小鼠，SPF级，雌性，体质量（20±2） g，6~8周龄，60只购买自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产合格证号：SCXK（辽）2020‑0001。

1.2 药品

紫芝、桑黄、茯苓购于阿里健康大药房；卵清蛋白（批号：C14203053）和Al（OH）₃（批号：C14645847）均购于上海麦克林生化科技股份有限公司；盐酸氮䓬斯汀鼻喷雾剂（批号：F2203855）由德国Madaus GmbH公司生产。

1.3 主要试剂

苏木素伊红（H&E）染色试剂盒（批号：2311007）购于北京索莱宝有限公司；小鼠IgE ELISA试剂盒（批号：202405）和小鼠OVA‑sIgE ELISA试剂盒（批号：202405）均购于上海优选生物科技有限公司；RNA提取试剂盒（批号：23OA0020）、逆转录试剂盒（批号：23TA0075）、qRT‑PCR试剂盒（批号：23EA0120）均购于赛文创新（北京）生物科技有限公司。

1.4 主要仪器

旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、磁力搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、超低温保存箱（海尔集团公司）、倒置显微镜（卡尔蔡司光学-中国-有限公司）、高速台式低温离心机（德国艾本德股份公司）、酶标仪（瑞士帝肯公司）、PCR仪（德国耶拿公司）、实时荧光定量PCR仪（美国安捷伦公司）。

1.5 多孔菌多糖的制备与纯化

分别对紫芝、桑黄、茯苓进行粉碎干燥处理，获得菌粉。称取菌粉500 g，90 ℃水浴提取3.5 h，浓缩提取液。在浓缩液中缓慢加入3倍体积的95%乙醇，充分搅拌后，4 ℃静置24 h。离心收集沉淀物并烘干至恒重，获得粗多糖。利用Sevage法^［17］获得纯化多糖。利用苯酚硫酸法测定菌物多糖含量，以葡萄糖作为标准品，绘制标准曲线，计算多糖含量。

1.6 试验动物分组、造模及处理

BALB/c小鼠饲养在吉林农业大学实验动物中心，许可证号：SYXK（吉）2023‑0021。经吉林农业大学实验动物福利与伦理委员会审查后认为本实验项目符合实验动物伦理要求，伦理审查受理号：20240322008。60只小鼠在温度为23~25 ℃和湿度为50%的条件下自由获得食物和水。适应性喂养1周后随机将小鼠分为空白组（Control）、模型组（Model）、阳性药物治疗组（AZE）、紫芝组（GSP）、桑黄组（SVP）、茯苓组（PCP），每组10只。按照图1所示实验流程，进行动物试验。第1天开始，每隔一日对除Control组外的每只小鼠腹腔注射30 μg OVA+3 mg Al（OH）₃，注射7次后完成试验动物基础致敏，Control组注射等量生理盐水。第14天开始对完成基础致敏的小鼠鼻腔每天每侧滴入2% OVA溶液1 μL进行滴鼻激发，Control组使用等量生理盐水滴鼻。持续激发7 d后，对小鼠进行行为学观察，确定模型成功。第21天开始使用AZE、SVP、GSP、PCP对造模成功的AR小鼠进行干预，共持续14 d。根据其他对紫芝、桑黄、茯苓多糖对小鼠使用剂量的研究分析，发现最小值均为200 mg∙kg^－1∙d^－1。因此综合了对实验安全性和有效性的考虑，确定多糖组的剂量均为200 mg∙kg^－1∙d^{－1［18-20］}。AZE组则根据人与小鼠给药剂量换算方法计算出用药剂量为0.084 1 mg∙kg^－1∙d^－1［21］。期间除Control组外其他组继续保持每天的OVA滴鼻激发，Control组使用等量生理盐水滴鼻。第35天进行行为学观察并评分。在第36天对小鼠麻醉，眼眶采血（提取血清）后，脱颈处死小鼠，并取得小鼠胸腺、脾脏、鼻黏膜组织等以备完成后续实验。

1.7 行为学评价

通过统计治疗前后，末次OVA激发后15 min内打喷嚏和抓鼻的次数计算评分来进行行为学评价。评分方法如下：打喷嚏次数，1~3次为1分，4~10次为2分，10次以上为3分。抓鼻次数：1~4次为1分，4次以上为4分。

1.8 小鼠取材方法

小鼠称重后麻醉，眼眶静脉丛取血制备血清，将小鼠处死，取下小鼠头部，除去头部皮毛，下颌骨及眼球。于头部正中冠状位切开得到完整的鼻组织，部分鼻组织液氮速冻后-80 ℃冰箱保存，为qRT‑PCR准备材料。另一部分鼻组织置于4%多聚甲醛固定48 h，10% EDTA脱钙液脱钙后供制备组织切片使用。

1.9 脾脏及胸腺指数计算

称量每组小鼠的脾脏/胸腺质量与体质量，计算脾脏/胸腺指数，比较组间差异。计算公式如下：

\frac{\mathrm{脾脏}\mathrm{质量}\left(\mathrm{m}\mathrm{g}\right)}{\mathrm{体质}\mathrm{量}\left(\mathrm{g}\right)}\times \mathrm{10}=\mathrm{脾脏}\mathrm{指数}\left(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{10}\mathrm{g}\right)

\frac{\mathrm{胸腺}\mathrm{质量}\left(\mathrm{m}\mathrm{g}\right)}{\mathrm{体质}\mathrm{量}\left(\mathrm{g}\right)}\times \mathrm{10}=\mathrm{胸腺}\mathrm{指数}\left(\mathrm{m}\mathrm{g}/\mathrm{10}\mathrm{g}\right)

1.10 病理学组织观察

小鼠鼻组织脱钙后，按常规方法将组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片、脱蜡。按照H&E染色试剂盒说明进行H&E染色。显微镜下观察各组小鼠鼻黏膜组织的变化情况。

1.11 血清IgE及OVA⁃sIgE含量测定

血清中IgE，OVA‑sIgE含量均按照相对应的ELISA试剂盒说明进行检测。

1.12 鼻黏膜组织中炎症因子相对表达量测定

取出冻存的鼻组织，提取组织RNA，逆转录后获得cDNA。以cDNA为模板，按照qRT‑PCR试剂盒说明中的体系与方法进行qRT‑PCR。PCR引物由库美生物公司合成，具体序列见表1。使用2^-△△CT法计算mRNA相对表达量。

1.13 统计学处理

结果以（\overline{x}\pm s）表示，使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析及绘制图形，one‑way ANOVA检验进行多组间比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3种多糖的制备与纯化

通过提取、纯化、冻干后，获得紫芝多糖（GSP），糖含量67.43%；桑黄多糖（SVP），糖含量63.4%；茯苓多糖（PCP），糖含量44.55%。

2.2 3种多糖对AR小鼠模型行为学的影响

造模结束之后，多糖干预之前，本课题组对所有小鼠进行了行为学评价，与Control组相比，造模小鼠均出现打喷嚏、抓鼻子的现象，评分显著升高，AR小鼠模型构建成功。3种多糖干预后，再次通过行为学实验评价了多糖对于AR模型小鼠的治疗效果，与Model组小鼠比较，AZE组、SVP组、PCP组小鼠抓鼻和打喷嚏次数以及行为学评分显著下降（P<0.05），GSP组与Model组比较打喷嚏次数显著下降（P<0.05），抓鼻次数和行为学评分无显著性差异，见图2。

2.3 3种多糖对AR小鼠模型鼻黏膜组织病理变化的影响

获取小鼠鼻黏膜组织，并使用H&E染色法观察其形态学变化。可见Control组小鼠鼻黏膜组织结构完整，细胞排列整齐，未见炎性细胞浸润。模型组小鼠鼻黏膜的结构较为紊乱，部分上皮不完整，基底有明显增厚，出现大量炎性细胞浸润的情况。GSP治疗组小鼠鼻黏膜组织呈现与模型组小鼠相似的状态，而相比于模型组和GSP组，AZE、SVP、PCP组小鼠鼻黏膜炎症反应减轻，炎症细胞数量减少，鼻黏膜上皮结构趋于完整。结果表明，SVP和PCP能够改善AR模型小鼠的鼻腔炎症情况，对于鼻黏膜组织具有一定的保护作用，见图3。

2.4 3种多糖对AR小鼠模型血清IgE及OVA⁃sIgE含量的影响

与Control组比较，Model组血清中IgE及OVA‑sIgE含量显著增高（P<0.001）。与Model组比较，AZE、GSP、SVP、PCP组血清中总IgE及OVA‑sIgE含量均有所下降（P<0.01），见图4。

2.5 3种多糖对AR模型小鼠鼻黏膜组织中炎症因子相对表达量的影响

通过检测AR小鼠鼻黏膜组织中IL‑1β和IL‑6的表达水平，判断AR模型小鼠鼻腔炎症的发展程度。如图5A、5B所示，与Control组比较，Model组IL‑1β、IL‑6相对表达量显著升高（P<0.001），与Model组比较，AZE、GSP、SVP、PCP组中的IL‑1β、IL‑6相对表达量显著降低（P<0.001）。为了判断Th1/Th2细胞亚群是否失衡，检测了各组小鼠鼻黏膜组织中TNF‑α和IL‑4的表达水平，如图5C、5D所示，与Control组比较，Model组TNF‑α、IL‑4相对表达量显著升高（P<0.001），与Model组比较，AZE、GSP、SVP、PCP组中的TNF‑α、IL‑4相对表达量显著降低（P<0.001）。计算了TNF‑α/IL‑4的比值，Control组：0.96，Model：0.57，AZE组：1.7，GSP组：0.56，SVP组：0.85，PCP组：1.24。表明在AR模型小鼠鼻黏膜组织中，Th1和Th2细胞亚群处于失衡状态。SVP干预后，比值最接近Control。

2.6 3种多糖对AR模型小鼠脾脏指数及胸腺指数的影响

各组小鼠的脾脏指数并无显著性差异。对于胸腺指数，与Control组比较，Model组胸腺指数显著降低（P<0.05）。与Model组比较，只有SVP组的胸腺指数有显著性提高（P<0.01），见图6。

3 讨论

AR影响我国将近2亿人口，更是东北地区春秋季节高发疾病，患者饱受煎熬。目前，过敏性鼻炎的一线治疗方案多为鼻用糖皮质激素以及口服抗组胺药物，虽然能够较好地缓解症状，但复发率高，不能根治。这主要是由于过敏性鼻炎的病因不仅涉及遗传与环境因素，更与患者自身的免疫系统功能息息相关，而传统的化学药物很难起到免疫调节的作用，作用效果有限^［22-24］。菌物多糖具有广泛的生理学活性，不仅具有抗炎作用^{［25，26］}，还具有免疫调节功能^［27-29］。因此，作为AR治疗药物，多糖具有独特的优势。

本研究通过分离纯化获得了3种多孔菌多糖GSP、SVP和PCP，并利用3种多糖对AR模型小鼠进行了治疗，探究其对AR的作用。研究结果表明，在3种多糖中，SVP能够显著缓解AR模型小鼠过敏性鼻炎的相关症状，减轻AR模型小鼠鼻黏膜组织损伤，减少炎症浸润，并能够下调AR模型小鼠血清中总IgE和OVA‑sIgE含量。此外，对多糖对于AR模型小鼠免疫系统的作用进行了初步的检测，研究结果表明，SVP能够调节鼻黏膜组织中炎症相关因子IL‑1β、IL‑4、IL‑6以及TNF‑α的表达，在平衡Th1/Th2细胞亚群的同时，也提高了胸腺指数。这样的结果显示，SVP可能通过对免疫系统的调节以及对模型小鼠炎症的干预对AR起到治疗效果。

目前公认的AR发病机制是Th1/Th2失衡理论。Th1和Th2细胞亚群通过各自的转录因子和细胞因子介导的正反馈环受到交叉抑制，从而实现免疫系统的稳定状态^{［30，31］}。当Th1/Th2细胞亚群失衡时会诱发过敏反应，确切地说变应原进入机体被树突状细胞捕获呈递给Th0细胞时，Th0通过识别抗原而分化为Th2细胞，Th2细胞过多时，会分泌过量的IL‑4，IL‑4的过表达会导致B细胞合成过量的IgE，IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和力IgE受体结合，形成致敏状态^［32］。而口服多糖SVP可以被肠粘膜中免疫细胞上的Toll样受体中的TLR2、TLR4识别，并抑制由TLR2、TLR4介导的过度激活的炎症因子，调控相应的免疫基因的表达和mRNA的转录，发挥免疫调控作用^{［33，34］}，从而平衡Th1/Th2细胞亚群，对AR起到免疫修复作用。此外，多糖也可以通过与巨噬细胞膜表面受体相结合如补体受体、甘露糖受体等，提高巨噬细胞免疫活性，增强机体免疫功能^{［35，36］}。还有研究表明多糖可以对肠道菌群进行调节，通过其代谢产物干预机体免疫系统^［37］。

鉴于多糖结构较为复杂，其具体的作用机制还有待于更为深入地探究。菌物多糖已被证明具有多种生物学活性，并在药品和功能性食品的开发中显示出了巨大的潜力，对于多糖结构和作用机制的研究任重而道远。本研究为过敏性鼻炎药物的研发以及菌物多糖的应用提供了进一步的理论基础。

作者贡献度说明：

郝薛宇、张文慧：实验设计及构思；王嘉璇：实验操作、统计分析及撰写文章；季虹、金禹迪：实验操作；张林波：文章审阅及项目经费资助；付璐：文章审阅、修改及校稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

中国工程院战略研究与咨询项目(JL2022⁃01)