基于网络药理学和实验验证探究肉苁蓉治疗阿尔茨海默症作用机制

Mechanism of Cistanche deserticola treating Alzheimer's disease based on network pharmacology and experimental validation

摘要

目的 通过网络药理学及动物实验研究，探讨肉苁蓉对阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）的潜在作用靶点及最佳给药剂量。 方法 将40只雄性7月龄SAMP8小鼠随机分为模型对照组（Model），肉苁蓉总苷低剂量（L-GCs）、中剂量（M-GCs）和高剂量给药组（H-GCs），10只雄性同月龄抗老化SAMR1小鼠作为SAMR1对照组。GCs灌胃给药30 d后，采用Morris水迷宫，Y迷宫实验检测各组小鼠学习和空间记忆与探索能力，尼氏染色观察各组小鼠海马神经元的数量和形态。免疫组化染色和Western blot实验检测小鼠海马中PI3K、Akt、P-Akt、Tau和P-Tau的表达情况。 结果 从肉苁蓉中筛选出8个有效成分，核心基因有Akt1、TNF、CASP3等；与肉苁蓉治疗AD相关的信号通路有PI3K-Akt、TNF和AGE-RAGE等；动物实验表明：与Model组相比，GCs组在Morris水迷宫的定位航行实验中的逃避潜伏期和总路程显著下降（P<0.05）、空间探索实验中小鼠的穿越平台次数显著增加（P<0.05）；免疫组化染色和Western blot实验中，GCs组的PI3K和P-Akt/Akt的表达有显著增高（P<0.05），而P-Tau/Tau的表达显著降低（P<0.05）。 结论 GCs可能通过PI3K-AkT信号通路及调节P-Tau蛋白表达以改善SAMP8小鼠的学习认知能力。

Abstract

Objective To explore the potential action targets and optimal dosage of Cistanche deserticola on Alzheimer's disease （AD） through network pharmacology and animal experiments. Methods A total of 40 male 7-month-old SAMP8 mice were randomly divided into the model control group （Model）， the low-dose （L-GCs）， the medium-dose （M-GCs）， and the high-dose （H-GCs） treatment group， and 10 male anti-aging SAMR1 mice of the same age were used as the SAMR1 control group. After 30 d of intragastric administration of GCs， the Morris water maze and Y maze experiments were used to test the learning and memory abilities of each group of mice. Nissl staining was used to observe the number and morphology of neurons in the hippocampal CA1 region of the mice. Immunohistochemical staining and Western blot experiments were used to detect the expression of PI3K， P-Akt， and P-Tau in the hippocampus of mice. Results A total of 8 effective components were screened from Cistanche deserticola， and the core genes involved in AD treatment were Akt1， TNF， CASP3， etc. The signaling pathways related to AD treatment by Cistanche deserticola included PI3K-Akt， TNF， and AGE-RAGE pathways. Animal experiments showed that compared to the model group， the escape latency and total distance in the Morris water maze navigation test of the GC groups were significantly decreased （P<0.05）， and the number of platform crossings were significantly increased （P<0.05） in the spatial exploration test of the GCs group. In the immunohistochemical staining and Western blot experiments， the ratio of PI3K and P-Akt/Akt in the GCs group were significantly increased （P<0.05）， while the expression of P-Tau/Tau were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion GCs may improve the learning and cognitive abilities of SAMP8 mice by regulating the PI3K-AkT signaling pathway and regulating the expression of P-Tau protein.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 阿尔茨海默症 / 肉苁蓉 / SAMP8小鼠 / 凋亡

Key words

Network pharmacology / Alzheimer's disease / Cistanche deserticola / SAMP8 mice / Apoptosis

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）是一种慢性，快速进展的的神经系统退行性疾病，以记忆力下降、认知功能障碍、视觉空间损害、执行功能障碍、人格和行为改变等特点为临床特征，是导致痴呆最常见的原因^［1］。1906年德国医生Alois Alzheimer在调查女性患者Auguste Deter时首次描述此疾病，并在显微镜下观察到大脑中出现淀粉样β蛋白（amyloid beta protein，Aβ）的斑块与神经元纤维缠结，此两点至今作为AD的主要病理特征^［2］_。数据表明，AD仍是世界上老年痴呆症的主要原因，2050年全球的痴呆症患病率将翻两番，世界上患痴呆症的人数可能达到1.315亿；而根据AD的生物学特征，其患病率估计要高出3倍^［3］。然而，目前尚无针对AD的疾病缓解疗法^［4］。针对单一蛋白质的药物的高成本开发可能不会达到预期的治疗效果，多靶点、多药理作用相结合的中医药治疗AD具有明显优势^［5，6］。

肉苁蓉被列当科植物肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C. Ma）或管花肉苁蓉（Cistanche tubulosa Wight）的干燥带鳞叶的肉质茎^［7］，具有补肾阳，益精血，润肠通便的作用，可用于肾阳不足，精血亏虚，筋骨无力，肠燥便秘^［8］。现有多篇文献表明：肉苁蓉的主要提取物肉苁蓉总苷（glycosides of cistanche， GCs）具有广泛的生物学活性，因其具有抗氧化应激、抗细胞凋亡、抗炎症等多种功效，故在炎症性肠病、肝损伤，特别是神经保护领域中的帕金森疾病，脑缺血再灌注和阿尔茨海默病等疾病起到重要影响^［9-11］。

鉴于肉苁蓉在多个疾病领域展现出显著疗效，而其多靶点，多成分，多途径的共同作用特点，令肉苁蓉在改善以阿尔茨海默症为主的神经退行性疾病过程中，尚未能明确其主要有效成分和发挥作用的信号通路^［12］。网络药理学是一门综合生物信息学，生物化学，药理学和计算机学等多个领域的交叉学科，利用大数据，信息学和计算科学来建立中药成分-靶向药物网络方法，研究和模拟生物体内的药物代谢，作用机制和药效预测，并期待为传统中药的转化研发和应用发挥极大作用^{［10，13］}。本文旨在研究借助网络药理学和动物实验验证探究肉苁蓉总苷治疗阿尔茨海默症的主要有效成分和关键机制及最佳给药剂量，为肉苁蓉的药理研究和临床应用提供一定的参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 数据库及分析平台

本研究所使用主要数据库及分析平台（表1）。

1.1.2 实验动物

本实验采用的实验动物为雄性SPF级快速老化小鼠（senescence-accelerated mouse prone 8，SAMP8）小鼠，从2月龄饲养至7月龄后纳入实验，所有动物饲养于内蒙古科技大学包头医学院动物实验中心SPF级动物房［SYXK（蒙）2018-0001］，温度（24.0±1.0）℃，湿度控制在（62%±3%），提供足够的饲料和饮用水，小鼠自由进食进水。光照/黑暗周期为12 h /12 h，以保证小鼠正常的昼夜节律。本实验涉及的所有动物操作及试验方案均按照包头医学院实验动物伦理委员会（包医伦理2018第011号）批准的方案进行。

1.1.3 主要试剂与仪器

高效RIPA裂解液（R0010）、ECL Plus超敏发光液（PE0010）、电泳缓冲液（T1070）、转膜液（D1060）、蛋白上样缓冲液（P1015）等均购自北京索莱宝；免疫组化试剂盒（PV-9000）购自北京中杉金桥；BCA蛋白检测试剂盒（23227）购自美国Thermo Scientific。

磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase， PI3K）抗体、蛋白激酶B（protein kinase B，AkT）抗体（AF0016）、p-AkT抗体（AF6261）均购自武汉亲科生物研究中心有限公司、β-actin（52901）购自美国SAB；羊抗兔二抗（SA00001-2）购自美国Proteintech。

石蜡切片机（德国Leica公司）、光学显微镜（德国Leica公司）、旷场实验箱（上海欣软）、Morris 水迷宫-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher公司）、电泳仪（北京六一生物科技有限公司）、脱色摇床（北京六一生物科技有限公司）、蛋白凝胶成像分析系统（上海Tanon科技）、酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学分析

1.2.1.1 肉苁蓉活性成分和成分靶点的筛选

肉苁蓉作用靶点筛选：在TCMSP数据库（https：//www.tcmsp-e.com）以肉苁蓉为关键词，查找所有的化学活性成分，后将口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18作为限定条件对所收集到的化合物进行筛选；借助Swiss ADME平台以胃肠道吸收得分为“high”，类药性至少通过2个“Yes”为标准作为TCMSP平台未找到的化学成分的补充，并与文献查询收集到的常见肉苁蓉活性成分一起，通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）获取靶点的标准名称^［10］。

1.2.2.2 AD疾病靶点的获取

以“Alzheimer's disease”为检索词，在OMIM、GeneCards、NCBI数据库中寻找疾病靶点。

1.2.2.3 韦恩图的制作和蛋白质‑蛋白质相互作用网络（PPI）构建

在Venn图网址输入药物靶点和疾病靶点，制作韦恩图，并获得靶点的交集，导入STRING数据库进行蛋白质相互作用网络的构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，得到蛋白质相互作用网络图。利用Cytoscape软件将靶点的Degree，Closeness和Betweenness数值筛选出核心靶点，使用Analyse插件绘图。

1.2.2.4 GO和KEGG分析

使用DAVID在线平台和metascape在线平台对上述获得的相关核心靶点进行GO及KEGG富集分析，对P≤0.05的项目进行筛选。运用在线绘图平台微生信绘制GO及KEGG富集分析的气泡图。

1.2.2 实验动物分组及模型制备

40只SAMP8小鼠随机分为模型组、肉苁蓉低剂量给药组（L-GCs）、肉苁蓉中剂量给药组（M-GCs）、肉苁蓉高剂量给药组（H-GCs），每组10只；10只等同性别及体重的SAMR1小鼠为SAMR1对照组。L-GCs组、M-GCs组、H-GCs组分别以25、50、100 mg·kg^-1·d^-1的剂量灌胃GCs。SAMR1组和Model组给予同等剂量的生理盐水，所有组均连续灌胃30 d。

1.2.3 行为学实验

1.2.3.1 Morris水迷宫实验

定位航行实验：在GCs给药第24~30天时，前1~5 d采取定位航行实验。将水迷宫分为4个象限，平台置于第三象限内，高度略高于水面2 cm。将小鼠头朝池壁入水，观察其是否能在规定60 s时间内寻找平台，并在平台上停留2~3 s。每只小鼠训练频率为每日4次，每次出发起点为不同象限，每两个训练之间时间间隔不得少于15 min。若小鼠在60 s内没有找到平台，则需引导其在平台上停留3~5 s。实验过程中记录各组小鼠的逃避潜伏期和上台前总路程；后6~7 d采用空间探索实验：即将第三象限的平台撤掉，小鼠从第一象限开始探索实验，探索时间为60 s，记录各组小鼠的穿越平台次数、目标象限停留百分比。

1.2.3.2 Y迷宫实验

Y迷宫由初始臂，新异臂和其他臂3个大小形状相同的臂构成。在实验开始前将新异臂的入口封堵，使小鼠在剩余两臂中自由探索，持续时间为10 min。探索完成1 h后打开新异臂入口，将小鼠放在初始臂起始处，记录5 min内小鼠探索新异臂的时间，并计算小鼠成功进出新异臂的次数，计算小鼠的自发交替率［交替率（%）=成功交替次数/（总进臂次数-2）×100%］^［14］。

1.2.4 尼氏染色

将小鼠给药30 d后，麻醉后使用生理盐水灌注小鼠心脏，排尽血液后处死取脑组织，使用4%多聚甲醛浸泡24~48 h以固定小鼠脑组织，上行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片厚度为5 μm。常规脱蜡至水、亚甲蓝染液染色、分化、乙醇脱水、二甲苯透明、树脂封片。于显微镜200倍下观察小鼠海马CA1区神经细胞的形态和数量变化。

1.2.5 免疫组织化学染色

脑组织切片常规脱蜡至水，置于枸橼酸钠抗原修复液内高压微波加热，PBS缓冲液冲洗切片5 min×3次，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，PBS冲洗5 min×3次，一抗孵育，4 ℃过夜。次日PBS缓冲液冲洗5 min×3次后滴加反应增强液，PBS复洗5 min×3次，37 ℃下二抗孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次后DAB染液显色，苏木精复染细胞核，上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明。

1.2.6 蛋白免疫印迹实验（Western blot）

取部分小鼠海马组织加入蛋白RIPA裂解液，研磨棒充分研磨，冰浴环境下超声匀浆，冰上静置30 min。后使用低温超速离心机离心12 000 r/min，离心15 min，取上清，采用BCA法测定其蛋白浓度。取20 μg蛋白加入蛋白上样缓冲液，100 ℃高温变性5 min，将提前配置好的浓缩胶和分离胶安装在电泳槽内，上样后进行80 V恒压电泳60 min，后调整为120 V恒压电泳80 min。后用300 mA恒流，转膜130 min。脱脂牛奶室温封闭2 h，以1∶1 500倍稀释一抗，置入冰箱4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育2 h。利用成像分析系统显影后进行各组条带灰度值分析。

1.3 统计学处理

所有数据均采用均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，并用SPSS 25.0和Graphpad Prism9.5软件进行数据分析和绘图。两两比较采用SNK-q检验，多样本比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肉苁蓉的主要活性成分和成分靶点的筛选

肉苁蓉通过TCMSP数据库以及Swiss ADME平台检索，加上文献查询，共得到主要活性成分8种，分别为：脱水内脂、丁香树脂二甲醚、槲皮素、花生四烯酸、枫马京、毛蕊花糖苷、松果菊苷、β-谷甾醇，成分靶点共307种。

2.2 疾病靶点的筛选和韦恩图制作，PPI构建和GO和KEGG富集分析

通过OMIM、GeneCards、NCBI数据库检索，筛选后得出AD相关靶点共2 013个。将肉苁蓉成分靶点和AD相关靶点导入Venn图在线网址，获得药物与疾病交集靶点共207个，并得出韦恩图（图1A）。将207个交集靶点导入STRING数据库，分析药物-疾病之间的相互作用。后将数据文件导入Cytoscape 软件，经Degree，Closeness和Betweenness数值筛选后，得到42个靶点，593条边。根据Degree大小排序，选出TNF、Akt1、CASP3、PPARG、EGFR、MMP9、ESR1、HIF1A为关键靶点基因，并绘制蛋白质-蛋白质相互作用网络图（图1B）。

为阐述肉苁蓉治疗AD中参与靶点的生命过程，使用metascape数据库对上述获得的42个靶点进行GO富集分析，共包括细胞组成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）3部分。以P≤0.05的标准对项目进行筛选，将排名前十的细胞组成、分子功能、生物过程利用微生信在线绘图网站绘制气泡图（图1C）；利用DAVID在线工具对42个疾病与药物共同关键靶点进行KEGG富集分析，对P≤0.05的项目进行筛选，结果显示，共富集到172条信号通路。根据P值选取排名前20的通路，利用微生信在线平台绘制气泡图（图1D）。富集结果表明肉苁蓉治疗AD机制可能与PI3K-Akt通路，癌症途径，粘着斑等途径密切相关。

2.3 药物‑成分‑疾病‑通路‑靶点总图制作

将KEGG富集结果与PPI网络构建结果合并，可绘制药物-成分-疾病-通路-靶点网络（图2）。

2.4 GCs对各组小鼠空间认知和学习记忆的影响

2.4.1 Morris 水迷宫实验

2.4.1.1 定位航行实验

随着实验的进展，可见各组的逃避潜伏期和上台前总路程均有所下降。与SAMR1组相比，自第3天开始，Model组的逃避潜伏期和上台前路程较高（P<0.05）；与Model组相比，第3天起L-GCs组、M-GCs组和H-GCs组的逃避潜伏期和上台前总路程明显缩短（P<0.05），第4天起M-GCs给药组相比于L-GCs给药组和H-GCs给药组，逃避潜伏期和上台前总路程在第4天和第5天明显减少（P<0.05），见表2、3。

2.4.1.2 空间探索实验

与SAMR1组相比，Model组的穿越平台次数和目标象限停留时间显著减少（P<0.05）；与Model组相比，GCs给药组的穿越平台次数和目标象限停留时间均显著升高（P<0.05）其中M-GCs给药组的空间探索实验目标象限停留百分比和穿越平台次数相较于其他两组显著升高（P<0.05），见图3。

2.4.2 Y迷宫实验

Y迷宫实验结果表明：与SAMR1组相比，Model组探索新异臂的时间和交替率均显著下降（P<0.05）；与Model组比，M-GCs组与H-GCs组的新异臂探索时间明显增高（P<0.05）；GCs给药组的新异臂自发交替率与Model组相比明显增高（P<0.05），其中M-GCs组自发交替率高于其他给药组（P<0.05），见图4。

2.5 GCs对小鼠海马神经元数目和形态的影响

尼氏染色结果表明：SAMR1组神经元锥体细胞呈圆形或椭圆形，形态完整，排列整齐，胞内尼氏体深染，且数量较多；与SAMR1组相比，Model组神经元锥体细胞形态破碎，排列散乱，并有尼氏体着色较浅，完整锥体细胞数量显著减少（P<0.05）；与Model组相比，GCs给药组的锥体细胞形态较为完整，排列较为整齐，完整锥体细胞个数显著增加（P<0.05），其中M-GCs组多数锥体细胞形态完整，排列更为整齐，完整锥体细胞数量与其他给药组相比数量显著增加（P<0.05），见图5。

2.6 GCs对小鼠海马PI3K‑AKT通路相关蛋白及Tau蛋白表达的影响

免疫组织化学染色结果显示：与SAMR1组相比，Model组在海马CA1区表达PI3K、P-Akt的阳性细胞数量明显减少（P<0.05）、表达P-Tau的阳性细胞数量显著增高（P<0.05）；与Model组相比，GCs组的PI3K、P-Akt的海马CA1区的阳性细胞数量显著升高（P<0.05）、表达P-Tau的阳性细胞数量明显减少（P<0.05）；其中M-GCs组与其他GCs给药组相比，表达小鼠海马CA1区PI3K与P-Akt阳性细胞数量明显增高（P<0.05），见图6。

Western blot实验结果表明：与SAMR1组相比，Model组海马区的PI3K、P-Akt/Akt的吸光度比值明显减少（P<0.05），P-Tau/Tau的比值显著增高（P<0.05）；与Model组相比，GCs组海马区的PI3K、P-Akt/Akt的比值显著升高（P<0.05），P-Tau/Tau的比值明显减少（P<0.05）；其中M-GCs组与其他GCs给药组相比，PI3K、P-Akt/AKT蛋白表达明显增高（P<0.05），P-Tau/Tau的蛋白表达情况明显减少（P<0.05），见表4、图7。

3 讨论

阿尔茨海默病是一种常见的神经系统退行性疾病，该病作为一种起病隐匿、持续进展的慢性疾病，具有记忆、语言、认知，人格和行为功能异常等临床表现特点^{［15，16］}。目前，阿尔茨海默症发病机制复杂，Aβ淀粉样蛋白沉积、神经细胞的氧化应激、神经炎症、Tau蛋白异常磷酸化以及肠道菌群失调等理论众说纷纭，其中由Tau蛋白磷酸化引起的神经细胞的炎症凋亡作为AD引发认知功能减退的重要机制^{［17，18］}。Tau蛋白是一种与神经元轴突的微管相关蛋白，主要功能为促进微管蛋白形成，保持其稳定和调节轴突运输^{［19，20］}。Tau蛋白的过度磷酸化会丧失其与微管结合的能力，使微管解聚、轴突运转障碍并产生神经纤维缠结，导致神经元变性和凋亡^［21］。研究发现，多种相关的信号通路与Tau蛋白的磷酸化密切相关，其中胞内磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路在Tau蛋白磷酸化中发挥关键作用，其表达异常可对神经细胞的生长，发育，凋亡过程产生显著影响^［22］。

在上述的网络药理学研究中，通过GO和KEGG富集分析得出，PI3K/Akt通路在肉苁蓉发挥对AD的改善过程中起到关键作用，并与细胞凋亡，老年斑生成和神经元缠结的生成关系密切；通过STRING数据库对GCs与AD的共同靶点进行筛选，其中Akt1作为重要关键靶点，且是PI3K/Akt通路中的关键蛋白。PI3K作为Akt的上游分子，是一种特异性胞内磷脂酰肌醇激酶^［23］。在哺乳动物体内，PI3K家族有Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型同工酶，其中Ⅰ型同工酶则是PI3K-Akt通路中主要的调节靶点，PI3K的ⅠA类型同工酶与酪氨酸受体激酶等蛋白相结合时，PI3K可被磷酸化激活，使位于细胞膜外的PIP2靶点磷酸化激活为PIP3靶点，后者的作用是吸引Akt的亚型Akt1并使其磷酸化^［24-26］。Akt家族成员具有调节生物功能，包括细胞存活、增殖、代谢和生长的功能。磷酸化后的Akt1一方面可与丝氨酸残基136处磷酸化与β-细胞CLL/淋巴瘤（Bcl-2）相关的细胞死亡激动剂，从而产生抑制细胞凋亡的作用^［27］，另一方面可调节下游蛋白mTOR、GSK3β与FOXO，进而减少P-Tau蛋白的产生^［28-30］。因P-Tau蛋白的增多可作为AD的标志性病理特征，被认为与认知衰退和突触丢失密切相关，为此PI3K/Akt信号通路的激活，可能在改善阿尔茨海默症领域方面发挥重要作用。

肉苁蓉是植物肉苁蓉干燥带鳞叶的肉质茎，性温，味甘、咸归肾、大肠经，为补肾壮阳、润肠通便之药^［31］。具有抗细胞凋亡、抗氧化、调节细胞自噬和神经内分泌、增强体力以及改善学习认知等作用，对中枢神经系统疾病的防治具有重要价值^［32］。多篇文献记载：肉苁蓉可对脑缺血再灌注损伤的神经细胞自噬起到保护和兴奋氨基酸作用、兼有改善痴呆大鼠神经元氧化应激、保护脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应、及提升衰老大鼠的免疫功能等多种功效^［33-36］。通过上述行为学实验表明：相较于Model组，GCs给药组的小鼠在学习认知方面有显著提高（P<0.05）；尼氏染色实验发现：GCs给药组的锥体细胞相较于Model组数量显著增多，形态完整，排列整齐（P<0.05）；免疫组化和Western blot实验中发现，GCs可以使SAMP8小鼠海马区PI3K、P-Akt蛋白表达显著增高而P-Tau蛋白表达显著降低（P<0.05），这表明肉苁蓉可能通过调节PI3K-Akt信号通路，并影响P-Tau的产生而发挥改善阿尔茨海默症的作用。

本研究采用SAMP8小鼠构建阿尔茨海默症模型，通过网络药理学探寻了肉苁蓉治疗阿尔茨海默症的主要作用机制并进行了初步的作用机制探讨和最佳药物剂量探索，后续将继续探索肉苁蓉改善AD模型动物学习认知功能的作用机制和效用机制，以期为肉苁蓉防治AD产品开发更多现代科学依据。

作者贡献度说明：

步润峰：实验设计，文章撰写；张浩然：动物饲养、组织形态学实验；龙思雨：动物饲养、组织形态学实验；季书妍：动物饲养、组织形态学实验；吕雪：Western blot实验；杨占君：行为学实验；贾建新：文章撰写、行为学实验。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] 邓婷， 余志杰， 徐颖， 等. AD细胞模型的建立及评价方法研究进展［J］. 中国药理学通报， 2020， 36（4）： 470-475.

[2] Deng T， Yu ZJ， Xu Y， et al. Research progress on establishment and evaluation methods of AD cellular models［J］. Chin Pharmacol Bull， 2020， 36（4）： 470-475.

[3] Grøntvedt GR， Schröder TN， Sando SB， et al. Alzheimer's disease［J］. Curr Biol， 2018， 28（11）： R645-R649.

[4] Gavrilova SI， Alvarez A. Cerebrolysin in the therapy of mild cognitive impairment and dementia due to Alzheimer's disease： 30 years of clinical use［J］. Med Res Rev， 2021， 41（5）： 2775-2803.

[5] Liu Y， Chu J， Yan T， et al. Short-term resistance exercise inhibits neuroinflammation and attenuates neuropathological changes in 3xTg Alzheimer's disease mice［J］. Neuroinflammation， 2020， 17（1）： 4.

[6] Huang Q， Zhang C， Qu S， et al. Chinese herbal extracts exert neuroprotective effect in Alzheimer's disease mouse through the dopaminergic synapse/apoptosis signaling pathway［J］. Front Pharmacol， 2022， 13： 817213.

[7] Nogales C， Mamdouh ZM， List M， et al. Network pharmacology： Curing causal mechanisms instead of treating symptoms［J］. Trends Pharmacol Sci， 2022， 43（2）： 136-150.

[8] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典： 一部［M］. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 140-142.

[9] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China： Part Ⅰ［M］. Beijing： China Medical Science Press， 2020： 140-142.

[10] 徐万爱， 杨丹阳， 吴静雨， 等. 肉苁蓉的主要化学成分及生物活性研究进展［J］. 中华中医药学刊， 2024， 42（10）： 163-170.

[11] Xu WA， Yang DY， Wu JY， et al. Research progress on main chemical components and biological activities of Roucongrong （Cistanches Herba）［J］. Chin Arch Tradit Chin Med， 2024， 42（10）： 163-170.

[12] Khan S， Barve KH， Kumar MS. Recent advancements in pathogenesis， diagnostics and treatment of Alzheimer's disease［J］. Curr Neuropharmacol， 2020， 18（11）： 1106-1125.

[13] 闫文杰， 冯朵， 张绍时， 等. 基于网络药理学与动物实验探究肉苁蓉总苷对炎症性肠病的作用机制［J］. 中国食品学报， 2023， 23（10）： 1-11.

[14] Yan WJ， Feng D， Zhang S， et al. The mechanism of total glycosides of Cistanche deserticola Y. Ma on inflammatory bowel disease based on network pharmacology and animal experiments［J］. J Chin Insti Food Sci Technol， 2023， 23（10）： 1-11.

[15] 樊燕燕， 张石在. 肉苁蓉总苷通过调控lncRNA GAS5保护神经细胞缺血再灌注损伤［J］.中成药， 2022， 44（7）： 2320-2324.

[16] Fan YY， Zhang SZ. Total glycosides of cistanche protects neuronal cells from ischemia-reperfusion injury by regulating lncRNA GAS5［J］. Chin Tradit Patent Med， 2022， 44（7）： 2320-2324.

[17] 张石蕾， 刘佳丽， 龚福恺， 等. 基于网络药理学和实验验证探讨肉苁蓉防治癌因性疲劳的作用机制研究［J］. 中国中药杂志， 2023， 48（5）： 1330-1342.

[18] Zhang SL， Liu JL， Gong FK， et al. Mechanism of Cistanches Herba in treatment of cancer-related fatigue based on network pharmacology and experimental verification［J］. Chin J Chin Mater Med， 2023， 48（5）： 1330-1342.

[19] 姚春， 林龙， 王萌， 等. 基于生物信息学、网络药理学与分子对接研究八桂天龙散治疗阿尔茨海默病的机制［J］. 中华中医药学刊， 2023， 41（6）： 1-5， I0011-I0015.

[20] Yao C， Lin L， Wang M， et al. Mechanisms of Bagui Tianlong Powder treating Alzheimer's disease based on bioinformatics， network pharmacology and molecular docking［J］. Chin Arch Tradit Chin Med， 2023， 41（6）： 1-5， I0011-I0015.

[21] 汪静， 张庆国. 基于SIRT1/STAT3通路探讨盐酸戊乙奎醚对小鼠学习记忆能力的影响［J］. 中国临床药理学杂志， 2024， 40（10）： 1473-1477.

[22] Wang J， Zhang QG. Effects of penehyclidine hydrochloride on learning and memory in mice based on SIRT1/STAT3 pathway［J］. Chin J Clin Pharmacol， 2024， 40（10）： 1473-1477.

[23] Association Alzheimer's. 2022 Alzheimer's disease facts and figures［J］. Alzheimers Dement， 2022， 18（4）： 700-789.

[24] 李志茹， 师建平， 麻春杰， 等. 基于网络药理学和分子对接技术探讨洗心汤治疗阿尔兹海默症的潜在作用规律［J/OL］. 辽宁中医药大学学报， 1-15.

[25] Li ZR， Shi JP， Ma CJ， et al. Investigating the potential curative effects of Xixin Tang on Alzheimer's disease through the utilization of network pharmacology and molecular docking technology［J/OL］. J Liaoning Univ Tradit Chin Med， 1-15，.

[26] 朱梓强， 陆韫青， 郑嘉妮， 等. 杞参益智方改善Aβ1-42海马区注射小鼠学习与记忆能力的效用评价与作用机制研究［J］. 世界科学技术-中医药现代化， 2024， 26（1）： 40-47.

[27] Zhu ZQ， Lu WQ， Zheng JN，et al. Efficacy evaluation and mechanism research of Qishen Yizhi Formula in improving the learning and memory ability of Aβ1-42 hippocampus injection mice［J］. Mod Tradit Chin Med Mater Med World Sci Technol， 2024， 26（1）： 40-47.

[28] 肖志强， 杨柳， 黄睿， 等. 1-磷酸鞘氨醇受体2通过AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ25-35诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤［J］. 中国生物化学与分子生物学报， 2024， 40（10）： 1453-1461.

[29] Xiao ZQ， Yang L， Huang R， et al. S1PR2 regulates mitochondrial function through the AKT/mTOR pathway to promote Aβ25-35 damage of SH-SY5Y cells［J］. Chin J Biochem Mol Biol， 2024， 40（10）： 1453-1461.

[30] 张雷， 范占芳， 张作鹏， 等. 阿尔兹海默症发病机制及相关治疗药物的研究进展［J］. 中国药物化学杂志， 2021， 31（6）： 438-446， 469.

[31] Zhang L， Fan ZF， Zhang ZP， et al. Research progress on pathogenesis and therapeutic drugs of Alzheimer′s disease［J］. Chin J Med Chem， 2021， 31（6）： 438-446， 469.

[32] 原野， 余姊阳， 邵思迈， 等. 星形胶质细胞对阿尔兹海默病的双向作用［J］. 中国比较医学杂志， 2021， 31（6）： 133-138.

[33] Yuan Y， Yu ZY， Shao SM， et al. Bidirectional effect of astrocytes on Alzheimer's disease［J］. Chin J Comp Med， 2021， 31（6）： 133-138.

[34] 李苏垚， 王玉银， 魏文悦， 等. 阿尔兹海默病的发病机制及其先天免疫性/适应性免疫研究［J］. 山西大同大学学报（自然科学版）， 2021， 37（6）： 86-89.

[35] Li SY， Wang YY， Wei WY， et al. The pathogenesis of Alzheimer's disease and its innate immunity/adaptive immunity［J］. J Shanxi Datong Univ （Nat Sci Ed）， 2021， 37（6）： 86-89.

[36] 谢沛俊， 郝彦伟， 郭静， 等. 基于PI3K/AKT/GSK-3β通路探讨远志散调控阿尔兹海默病大鼠Tau蛋白磷酸化的研究［J］. 中华中医药学刊， 2020， 38（11）： 167-170， I0034-I0040.

[37] Xie PJ， Hao YW， Guo J， et al. Yuanzhi Powder regulates phosphorylation of Tau protein through PI3K/AKT/GSK-3β pathway in Alzheimer's disease model rats［J］. Chin Arch Tradit Chin Med， 2020， 38（11）： 167-170， I0034-I0040.

[38] Yang W， Liu Y， Xu Q， et al. Sulforaphene ameliorates neuroinflammation and hyperphosphorylated Tau protein via regulating the PI3K/Akt/GSK-3β pathway in experimental models of Alzheimer's disease［J］. Oxid Med Cell Longev， 2020， 2020： 4754195.

[39] Zhang L， Gong Y， Zhang L， et al. Gou Qi Zi inhibits proliferation and induces apoptosis through the PI3K/AKT1 signaling pathway in non-small cell lung cancer［J］. Front Oncol， 2022， 12： 1034750.

[40] 王雪梅. PRMT7通过甲基化修饰PTEN调控PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞的增殖和迁移［D］. 承德：承德医学院， 2023.

[41] Wang XM. PRMT7 inhibits the proliferation and migration of gastric cancer cells by suppressing the PI3K/AKT pathway via methylation PTEN［D］. Chengde： Chengde Medical University， 2023.

[42] 王如烨， 章勤， 方晓红. 何氏育麟方通过调控PI3K/Akt信号通路对卵巢储备功能下降大鼠颗粒细胞的影响［J］. 中成药， 2024， 46（7）： 2382-2389.

[43] Wang RH， Zhang Q， Fang XH. Effects of He's Yulin Formula on granulosa cells of rats with decreased ovarian reserve function by regulating PI3K/Akt signaling pathway［J］. Chin Tradit Patent Med， 2024， 46（7）： 2382-2389.

[44] Henshall DC， Araki T， Schindler CK， et al. Activation of Bcl-2-associated death protein and counter-response of Akt within cell populations during seizure-induced neuronal death［J］. J Neurosci， 2002， 22（19）： 8458-8465.

[45] Mueed Z， Tandon P， Maurya SK， et al. Tau and mTOR： The hotspots for multifarious diseases in Alzheimer's development［J］. Front Neurosci， 2019， 12： 1017.

[46] Lauretti E， Dincer O， Praticò D. Glycogen synthase kinase-3 signaling in Alzheimer's disease［J］. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res， 2020， 1867（5）： 118664.

[47] Sajan M， Hansen B， Ivey R， et al. Brain insulin signaling is increased in insulin-resistant states and decreases in FOXOs and PGC-1α and increases in Aβ1-40/42 and Phospho-Tau may abet Alzheimer development［J］. Diabetes， 2016， 65（7）： 1892-1903.

[48] Song Y， Zeng K， Jiang Y， et al. Cistanches Herba， from an endangered species to a big brand of Chinese medicine［J］. Med Res Rev， 2021， 41（3）： 1539-1577.

[49] 王璐， 吴丽娥， 贾建新. 肉苁蓉的药理作用及其在中枢神经系统疾病中的研究进展［J］. 中华中医药学刊， 2024， 42（3）： 50-54.

[50] Wang L， Wu LE， Jia JX. Pharmacological effects of Roucongrong （Cistanches Herba） and its research progress in central nervous system diseases［J］. Chin Arch Tradit Chin Med， 2024， 42（3）： 50-54.

[51] 张廷辉, 任晓丽, 裴飞翔. 肉苁蓉总苷对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织兴奋性氨基酸作用及海马脑区NF-κB、蛋白表达影响实验研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2022, 24(5): 42-45.

[52] Zhang TH, Ren XL, Pei FX. Effects of total glycosides of cistanche on excitatory amino acids and expression of NF-κB and protein in hippocampus of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. J Liaoning Univ Tradit Chin Med, 2022, 24(5): 42-45.

[53] 王璐, 白雨朦, 李晓宇, 等. 肉苁蓉总苷对阿尔茨海默病模型大鼠学习认知功能和氧化应激的影响[J]. 解剖学杂志, 2020, 43(3): 194-199, F0003.

[54] Wang L, Bai YM, Li XY, et al. Effects of glycosides of cistanche on cognitive function and oxidative stress in rats with Alzheimer's disease[J]. Chin J Anat, 2020, 43(3): 194-199, F0003.

[55] 谢乾. 肉苁蓉总苷对脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应的保护作用[D]. 乌鲁木齐: 新疆医科大学, 2021.

[56] Xie Q. Protective effects of glycosides of cistanche on lipopolysaccharide-induced inflammatory response on microglia cells[D]. Urumqi: Xinjiang Medical University, 2021.

[57] 范亚楠, 黄玉秋, 贾天柱, 等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响[J]. 中华中医药学刊, 2017, 35(11): 2882-2885, I0010-I0011.

[58] Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, et al. Effects of Cistanches Herba before and after processing on anti-aging function and immune function of D-galactose-induced aging rats[J]. Chin Arch Tradit Chin Med, 2017, 35(11): 2882-2885, I0010-I0011.

基金资助

国家自然科学基金资助项目(81860215)

内蒙古自然科学基金资助项目(2018MS08141)