电针血清对氧糖剥夺／复氧糖后HT22神经元铁死亡的影响

Effects of electroacupuncture serum on ferroptosis in HT22 neurons after oxygen‑glucose deprivation / reoxygenation

摘要

目的 观察电针血清对氧糖剥夺/复氧糖（OGD/R）后HT22神经元铁死亡的影响，以探讨电针血清对脑缺血后海马神经元潜在的保护机制。 方法 将20只雄性SD大鼠随机分为正常组和电针组，每组10只。电针组采用线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注（MCAO/R）模型，随后进行为期14 d的电针治疗。治疗结束后，从腹主动脉采血并制备不同浓度的电针血清，同时收集正常组大鼠血清作为对照。以海马神经元HT22细胞为实验对象，将其随机分为5组：正常组、模型组、电针血清组、诱导剂组、电针血清+诱导剂组。除正常组外，其余各组经历4 h的氧糖剥夺后，再进行24 h的复氧复糖处理，并在复氧复糖期间给予相应的血清处理。诱导剂组和电针血清+诱导剂组在氧糖剥夺前24 h加入10 μmol/L的铁死亡诱导剂Erastin。采用CCK‑8和LDH试剂盒评估细胞活力和毒性；流式细胞术检测细胞凋亡情况；透射电镜观察线粒体结构；荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）含量；比色法试剂盒检测细胞内Fe²⁺、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量；Western blot检测细胞内转铁蛋白受体1（TFR1）、铁蛋白重链多肽1（FTH1）、核受体共激活剂4（NCOA4）、转运蛋白溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）和脂氧合酶（LOX）的相对表达量。 结果 不同浓度的电针血清（5%、10%、15%、20%）能改善细胞形态并降低细胞毒性（P<0.01），其中10%的浓度效果最佳。与正常组相比，模型组细胞活力降低（P<0.01），细胞毒性和凋亡情况增加（P<0.01），透射电镜显示线粒体肿胀明显，嵴断裂甚至消失，Fe²⁺、MDA、ROS含量升高（P<0.01），GSH含量降低（P<0.01），FTH1、SLC7A11、GPX4表达降低（P<0.05），TFR1、NCOA4、ACSL4、LOX表达升高（P<0.05）。与模型组相比，电针血清组细胞活力升高（P<0.01），细胞毒性以及凋亡情况减少（P<0.05），线粒体形态相对完整，Fe²⁺、MDA、ROS含量下降（P<0.01），GSH含量升高（P<0.05），FTH1、SLC7A11、GPX4表达升高（P<0.05），TFR1、NCOA4、ACSL4、LOX表达降低（P<0.05）。与模型组相比，诱导剂组细胞活力降低（P<0.01），细胞毒性和凋亡情况增加（P<0.01），线粒体肿胀更为明显，结构进一步破坏，Fe²⁺、MDA、ROS含量升高（P<0.01），GSH含量降低（P<0.01），FTH1、SLC7A11、GPX4表达降低（P<0.05），TFR1、NCOA4、ACSL4、LOX表达升高（P<0.05）。与抑制剂组相比，针刺血清+诱导剂组细胞活力升高（P<0.01），细胞毒性以及凋亡情况减少（P<0.01），线粒体形态结构有所改善，Fe²⁺、MDA、ROS含量下降（P<0.01），GSH含量升高（P<0.01）；FTH1、SLC7A11、GPX4表达升高（P<0.05），TFR1、NCOA4、ACSL4、LOX表达降低（P<0.05）。 结论 电针血清能有效抑制OGD/R后HT22神经元的铁死亡，从而在改善脑缺血后海马神经元损伤方面发挥重要作用。

Abstract

Objective To observe the effect of electroacupuncture serum on ferroptosis in HT22 neurons after oxygen‑glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） and to investigate the potential protective mechanisms of electroacupuncture serum on hippocampal neurons following cerebral ischemia. Methods A total of 20 male Sprague‑Dawley （SD） rats were randomly divided into two groups： A normal group and an electroacupuncture group， with 10 rats in each group. The electroacupuncture group underwent middle cerebral artery occlusion/reperfusion （MCAO/R） modeling using the suture method， followed by 14 days of electroacupuncture treatment. After treatment， blood was collected from the abdominal aorta， and electroacupuncture serum was prepared at different concentrations. Serum from the normal group was also collected as a control. HT22 hippocampal neurons were used as experimental subjects and were randomly divided into 5 groups：A normal group，a model group，an electroacupuncture serum group，an inducer group， and an electroacupuncture serum + inducer group. Except for the normal group， all the other groups underwent 4 hours of OGD， followed by 24 hours of reoxygenation and glucose replenishment， during which they were treated with the corresponding serum. The inducer group and the electroacupuncture serum + inducer group received 10 μmol/L of the ferroptosis inducer Erastin 24 hours before OGD. Cell viability and cytotoxicity were assessed using the CCK‑8 and LDH assays， while apoptosis was evaluated via flow cytometry. Mitochondrial structure was observed under a transmission electron microscope， reactive oxygen species （ROS） levels were measured using a fluorescence probe， and intracellular Fe²⁺， glutathione （GSH）， and malondialdehyde （MDA） levels were detected using colorimetric kits. Western blot analysis was employed to detect the relative expression of transferrin receptor 1 （TFR1）， ferritin heavy chain polypeptide 1 （FTH1）， nuclear receptor coactivator 4 （NCOA4）， solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11）， glutathione peroxidase 4 （GPX4）， acyl‑CoA synthetase long‑chain family member 4 （ACSL4）， and lipoxygenase （LOX）. Results Electroacupuncture serum at concentrations of 5%， 10%， 15%， and 20% improved cell morphology and reduced cytotoxicity （P<0.01）， with 10% yielding the best results. Compared to the normal group， the model group exhibited decreased cell viability （P<0.01）， increased cytotoxicity and apoptosis （P<0.01）.Transmission electron microscope showed remarkable mitochondrial swelling， cristae disruption or disappearance， elevated Fe²⁺， MDA， and ROS levels （P<0.01）， reduced GSH level （P<0.01）， decreased expressions of FTH1， SLC7A11， and GPX4 （P<0.05）， and increased expressions of TFR1， NCOA4， ACSL4， and LOX （P<0.05）. Compared to the model group， the electroacupuncture serum group showed increased cell viability （P<0.01）， reduced cytotoxicity and apoptosis （P<0.05）， relatively intact mitochondrial structure， decreased Fe²⁺， MDA， and ROS levels （P<0.01）， increased GSH level （P<0.05）， elevated expressions of FTH1， SLC7A11， and GPX4 （P<0.05）， and reduced expressions of TFR1， NCOA4， ACSL4， and LOX （P<0.05）. The inducer group， compared to the model group， exhibited decreased cell viability （P<0.01）， increased cytotoxicity and apoptosis （P<0.01）， more pronounced mitochondrial swelling and structural damage， elevated Fe²⁺， MDA， and ROS level （P<0.01）， reduced GSH levels （P<0.01）， decreased FTH1， SLC7A11， and GPX4 expressions （P<0.05）， and increased TFR1， NCOA4， ACSL4， and LOX expressions （P<0.05）. Compared to the inducer group， the electroacupuncture serum + inducer group showed increased cell viability （P<0.01）， reduced cytotoxicity and apoptosis （P<0.01）， improved mitochondrial morphology， decreased Fe²⁺， MDA， and ROS levels （P<0.01）， increased GSH level （P<0.01）， elevated FTH1， SLC7A11， and GPX4 expressions （P<0.05）， and reduced TFR1， NCOA4， ACSL4， and LOX expressions （P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture serum effectively inhibits ferroptosis in HT22 neurons following OGD/R， thereby playing a significant role in mitigating hippocampal neuronal damage after cerebral ischemia.

Graphical abstract

关键词

电针血清 / 氧糖剥夺／复氧糖（OGD）/R / HT22神经元 / 铁死亡

Key words

Electroacupuncture serum / OGD/R / HT22 neurons / Ferroptosis

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是指由脑部血管阻塞或供血不足而使缺血区脑组织损伤并导致严重神经功能缺损的疾病。临床以高发病率、高死亡率和高致残率为主要特征，现已成为我国乃至全球疾病致残、致死的主要原因^［1，2］。据报道约三分之二的卒中幸存者会出现不同程度的认知障碍，持续性和进展性的认知障碍严重影响患者日常生活自理能力，阻碍患者康复进程。更棘手的是，现阶段临床上治疗认知障碍的药物选择有限且有益效果尚未明确^［3，4］。因此，揭示卒中后认知障碍相关病理机制、积极寻找安全有效的干预措施，是目前临床亟待解决的问题。尽管卒中后认知障碍的发病机制复杂，但究其根本，各种病理过程引起的海马神经元的过度死亡是导致认知障碍的主要原因^［5］。铁死亡作为近年来新发现的一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，已被证实与多种神经退行性疾病的产生和发展密切相关^［6］。一项基于阿尔兹海默病（AD）患者的定量磁化率结果显示，AD患者海马尾状核壳下和皮层下的脑铁积累与AD 疾病严重程度呈正相关^［7］。基础研究进一步表明，缺血和缺氧可导致海马区铁和活性氧（ROS）的过度积累，而丹参可逆转这一变化进而改善大脑中动脉缺血再灌注（MCAO/R）大鼠的记忆缺陷^［8］。因此，如何有效干预大脑认知相关脑区神经元铁死亡或许是今后卒中认知障碍治疗急需攻克的难题。

本课题组前期临床研究已证实电针“神庭”“百会”可有效提高中风患者的认知功能^［9，10］，但其具体的治疗机制尚未明确。近年来，电针血清作为一种体外研究针刺作用机制的新方法，在揭示针灸疗法的有效性和科学性方面发挥了重要作用。近期一项体外研究发现电针治疗后的中动脉闭塞（MCAO）大鼠血清外泌体注射回大鼠体内，能够明显减少脑梗死体积和病理损伤^［11］。因此，本研究以离体培养的HT22细胞为研究对象、以电针“神庭”“百会”穴后的血清为干预手段，观察电针血清对氧糖剥夺/复氧糖（ODG/R）后HT22神经元铁死亡的影响，以期揭示电针血清对脑缺血后海马神经元保护机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源和实验动物

HT22 细胞株由武汉普诺赛提供；20 只5周龄 SPF级雄性 SD 大鼠，体质量为 180~200 g（用于制备电针血清），购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［生产许可证号：SCXK（鲁）2019‑0003］。实验动物饲养于河南中医药大学SPF级动物中心实验室［许可证SYXK（豫）‑2021‑0015］，所有实验操作严格遵循国际伦理准则，并已获得河南中医药大学动物伦理委员会的批准（DWL202203022）。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清（武汉普诺赛）；DMEM含糖/无糖培养基、Erastin、ECL 化学发光液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝）；PAGE凝胶快速制备试剂盒、三色预染蛋白Marker（上海雅酶）；SLC7A11 抗体、GPX4 抗体、FTH1 抗体、LOX 抗体（英国Abcam）；NCOA4 抗体、ACSL4 抗体（美国Santa Cruz）；GAPDH 抗体、HRP 标记山羊抗兔/鼠二抗（武汉三鹰）；CCK‑8 试剂盒（日本Dojindo）；ROS 荧光探针（南京建成）；Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天）；铁离子比色法试剂盒（北京普利莱）；LDH细胞毒性检测试剂盒、谷胱甘肽比色法试剂盒、丙二醛比色法试剂盒（武汉伊莱瑞特）。三气细胞培养箱（日本 Sanyo）；超净工作台（苏州安泰）；自动细胞计数仪（上海睿钰）；数显恒温水浴锅（常州国华）；荧光倒置相差显微镜（日本NiKon）；透射电子显微镜（日本Hitachi）；流式细胞仪（美国 BD）；低温高速离心机（德国Eppendorf）；酶标仪（美国Thermo Fisher）；化学发光成像系统（法国Vilber）；小型垂直电泳转印系统（美国Bio‑Rad）

1.3 电针血清的制备

适应性喂养1周后，将20只雄性SD大鼠随机分为正常组（n=10） 和电针组（n=10） 。电针组大鼠采用线栓法建立MCAO/R模型。次日，依据Zea Longa评分筛选出造模成功的大鼠后选取“神庭”、“百会”，以无菌一次性针灸针（0.25 mm ×13 mm）15°斜刺 2 mm，针灸柄分别连接 GM01 型电针仪（疏密波，1~20 Hz，1 mA），每日 1 次，每次 30 min，连续干预 14 d。正常组大鼠在相同的实验条件下仅进行抓取，不给予其他干预。治疗周期结束后，使用 3%戊巴比妥钠麻醉各组大鼠，自腹主动脉取血制备血清。各组血清充分混匀后，先于56 ℃的恒温水浴锅中进行30 min的加热灭活，再经0.22 μm 的微孔滤器过滤纯化后于-80 ℃保存备用。

不同浓度电针血清的配置：5%电针血清（2.5 mL 电针血清+47.5 mL DMEM培养基）、10%电针血清（5 mL 电针血清+45 mL DMEM培养基）、15%电针血清（7.5 mL 电针血清+42.5 mL DMEM培养基）、20%电针血清（10 mL 电针血清+40 mL DMEM培养基）。

1.4 细胞培养与OGD/R模型的建立

将-80 ℃冻存的HT22细胞复苏后接种于完全培养基（高糖DMEM培养基中添加10%胎牛血清）中，并在37 ℃、5% CO₂、95%空气及高湿度的培养箱内培养。培养过程中，每2~3 d更换1次新鲜培养基。当细胞生长汇合覆盖培养瓶底面积的80%以上时，可用于OGD/R模型的构建。

OGD/R模型的构建步骤如下：首先，吸除完全培养基并替换为无糖DMEM培养基。随后，将HT22细胞转移至37 ℃、1% O₂、5% CO₂、94% N₂的三气培养箱中进行4 h的缺氧缺糖处理。处理结束后，移除无糖培养基，加入新鲜的含糖DMEM培养基，并将细胞转移至常氧条件（37 ℃、95%空气、5% CO₂）下继续复氧培养24 h。

1.5 分组及干预方法

正常组：不进行 OGD/R 处理，使用含空白血清（与最佳电针血清浓度相同）的高糖 DMEM 培养基培养 HT22 细胞。模型组：OGD 处理 4 h后，复氧阶段使用含空白血清的高糖 DMEM 培养基培养。电针血清组：OGD 处理 4 h后，复氧阶段使用含最佳浓度电针血清的高糖 DMEM 培养基培养。诱导剂组：OGD 处理前 24 h加入 10 μmol/L 铁死亡诱导剂Erastin，OGD处理 4 h后，复氧阶段使用含空白血清的高糖 DMEM 培养基培养。电针血清 + 诱导剂组：OGD 处理前 24 h加入 Erastin，OGD处理 4 h后，复氧阶段使用含最佳浓度针刺血清的高糖 DMEM 培养基培养。

1.6 观察指标及检测方法

CCK‑8 检测细胞活力：将 HT22细胞以每孔 1×10⁴个细胞的密度接种至 96 孔板（每组设 6 个复孔），并根据上述分组干预方法进行处理，另设空白组（仅加入培养基，不接种细胞）。干预结束后，每孔加入 10 μL CCK‑8 溶液，于 37 ℃ 培养箱中孵育 1 h。孵育结束后，在酶标仪上于 450 nm 波长处测定各孔的 光密度（OD） 值。细胞活力根据以下公式计算：细胞活力 （%） =（实验组 OD 值-空白组 OD 值）/（正常组 OD 值-空白组 OD 值）× 100%。

LDH 试剂盒检测细胞毒性：将 HT22 细胞以每孔 5×10⁴个的密度接种到 96 孔板中，每组设定 6 个复孔，然后按照前述分组干预方法进行处理。随后，严格按照试剂盒说明书制备并处理空白孔、样本对照孔、最大酶活对照孔及样本测定孔。各组处理完成后，在 450 nm 波长下测定各孔的 OD 值。细胞毒性通过 LDH 释放率表示，LDH 释放率（%） =（样本测定孔 OD 值-样本对照孔 OD 值） /（最大酶活对照孔 OD 值-样本对照孔 OD 值）× 100%。

流式细胞术检测HT22细胞凋亡情况：向各组细胞培养皿中依次加入 1 mL 不含 EDTA 的胰酶和培养基，离心 （4 ℃，1 000×g， 5 min）后收集细胞沉淀。用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞沉淀 3 次，并将细胞重悬于 195 µL Annexin V‑FITC 结合液和 5 µL Annexin V‑FITC 工作液中，37 ℃ 避光孵育 5 min。之后，加入 10 µL 碘化丙啶染色液，室温下避光孵育 10~20 min，最后使用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

透射电镜观察HT22细胞内线粒体超微结构：将 2×10⁶ 个细胞接种于培养皿中，用 2.5% 戊二醛溶液和1% 四氧化锇溶液4 ℃ 固定。 固定后的细胞团经梯度脱水、渗透和包埋处理后切割为约 50 nm 的超薄切片。切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，可在透射电子显微镜下观察线粒体的超微结构。

比色法检测HT22细胞内Fe²⁺、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量： 各组分别收集不少于 3×10⁶个细胞，并加入 500 μL PBS 进行匀浆。匀浆后，样品于4 ℃、3 000×g条件下离心10 min，收集上清液并置于冰上备用。根据试剂盒说明制备检测工作液，并将其与样品混合后孵育。最后，分别在酶标仪 405 nm、532 nm 和 550 nm 波长处测定各孔的OD值。根据 OD 值绘制标准曲线，并计算各组 HT22 细胞内 Fe²⁺、GSH 和 MDA 的含量。

荧光探针检测HT22细胞内ROS含量：将细胞浓度调整至 1×10⁵个/mL，向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 细胞悬液，稳定培养24 h后按照上述分组进行干预处理。处理完成后，去除培养基，向每孔中加入 1 mL 稀释后的 DCFH‑DA 探针（浓度为 2 μmol/L）。在 37 ℃孵育 15 min后，弃去探针溶液，用 PBS 缓冲液清洗各孔 2 次并重悬。随后，使用荧光显微镜进行观察并采集图像，结果以平均荧光强度表示。

Western blot法检测HT22细胞中铁死亡相关蛋白表达：各组收集约 3×10⁶个细胞，用 PBS 洗涤并称重后，加入含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液（蛋白酶抑制剂 ： RIPA 裂解液=1∶100）。随后，使用细胞研磨仪充分研磨组织后提取上清。蛋白浓度通过 BCA 试剂盒测定。蛋白样本经电泳分离后，转移至 PVDF 膜。随后，膜在 4 ℃ 下与以下一抗孵育过夜：GAPDH（1∶5 000）、转缺蛋白受体1（TFR1）（1∶1 000）、FTH1（1∶2 000）、NCOA4（1∶1 000）、ACSL4（1∶1 000）、LOX（1∶5 000）、SLC7A11（1∶2 000）和 GPX4（1∶2 000）。次日，在室温下与 HRP 偶联的抗兔/小鼠二抗（1∶10 000）孵育 1 h，随后通过凝胶成像系统进行显影。最后，使用 ImageJ 软件分析条带灰度值，并通过目的蛋白与内参（GAPDH）条带灰度值的比值计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学处理

本研究采用GraphPad Prism 8软件进行绘图，SPSS 26.0软件用于统计分析处理数据。计量资料以\overline{x}\pm s表示。符合正态分布的组间比较采用单因素方差分析（one‑way ANOVA）。若数据符合方差齐性，则采用LSD法进行两组间的比较；若不满足方差齐性要求，则使用Dunnett T3检验进行组间比较。当数据不符合正态分布时，采用秩和检验进行多组间比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 最佳电针血清浓度的确定

光镜下细胞形态及CCK‑8和LDH 释放率实验结果显示：OGD/R处理导致HT22细胞出现收缩、体积减小，细胞间连接减少，细胞活力明显下降（P<0.01），而细胞毒性明显增加（P<0.01）。不同浓度的电针血清能改善细胞形态并降低细胞毒性，除了5%的电针血清外，其余浓度的电针血清明显提升了细胞活力。尤其是10%的电针血清在改善细胞形态、提高细胞活力（P<0.01）以及减少细胞毒性（P<0.01）方面效果最为明显。见图1A、B。因此，选择10%的电针血清用于后续实验。

2.2 各组HT22细胞活力和LDH 释放率的比较

CCK‑8 和LDH 释放率的结果显示：与正常组相比，模型组HT22细胞活力明显降低（P<0.01），LDH释放率明显增加（P<0.01）；与模型组相比，电针血清组HT22细胞活力明显升高（P<0.01），LDH释放率明显减少（P<0.01），诱导剂组HT22细胞活力明显降低（P<0.01），LDH释放率明显增加（P<0.01）；与诱导剂组相比，电针血清+诱导剂组HT22细胞活力明显增加（P<0.01），LDH释放率明显减少（P<0.01）。见图2。

2.3 各组HT22细胞凋亡率的比较

流式细胞术结果显示：与正常组相比，模型组HT22细胞凋亡率明显增加（P<0.01）；与模型组相比，电针血清组神经元细胞的凋亡率有所降低（P<0.05），而诱导剂组神经元细胞的凋亡率较模型组明显增加（P<0.01）；与诱导剂组相比，电针血清+诱导剂组HT22细胞的凋亡率明显降低（P<0.01）。见图3。

2.4 各组HT22细胞线粒体形态结构

正常组HT22细胞内线粒体形态正常，结构完整，排列致密；模型组和诱导剂组线粒体肿胀甚至破裂，电子密度减低，嵴断裂消失；电针血清+诱导剂组线粒体形态结构有所改善，但仍有膜结构不完整，内部嵴破坏的现象。电针血清组线粒体形态相对完整，内膜和线粒体内嵴结构较为正常。见图4。

2.5 各组HT22细胞内Fe²⁺、GSH、MDA含量的比较

比色法结果显示：与正常组相比，模型组HT22细胞内Fe²⁺和MDA含量明显升高（P<0.01），GSH含量明显降低（P<0.01）；与模型组相比，电针血清组HT22细胞内Fe²⁺和MDA含量明显降低（P<0.01）， GSH含量有所升高（P<0.05），而诱导剂组HT22细胞内Fe²⁺和MDA含量明显升高（P<0.01），GSH含量明显降低（P<0.01）；与诱导剂组相比，电针血清+诱导剂组HT22细胞内Fe²⁺和MDA含量明显降低，GSH含量明显升高（P<0.01）。见图5。

2.6 各组HT22细胞ROS平均荧光强度情况的比较

荧光探针结果显示：与正常组相比，模型组HT22细胞 ROS 的平均荧光强度明显升高（P<0.01）； 与模型组相比，电针血清组HT22细胞 ROS 的平均荧光强度有所降低（P<0.05），诱导剂组HT22细胞 ROS 的平均荧光强度明显升高（P<0.01）；与诱导剂组相比，电针血清+诱导剂组HT22细胞 ROS 的平均荧光强度明显降低（P<0.01）。见图6。

2.7 各组HT22细胞内铁死亡相关蛋白相对表达量的比较

Western blot结果显示：与正常组相比，模型组HT22细胞内铁代谢相关蛋白FTH1和抗氧化系统相关蛋白SLC7A11、GPX4的表达降低（P<0.01），而铁代谢相关蛋白TFR1、NCOA4和脂质过氧化相关蛋白ACSL4、LOX的表达升高（P<0.01）。与模型组相比，电针血清组HT22细胞内FTH1、SLC7A11、GPX4的表达升高（P<0.05），TFR1、NCOA4、ACSL4、LOX的表达降低（P<0.05），诱导剂组FTH1、SLC7A11、GPX4的表达降低（P<0.05）；TFR1、NCOA4、ACSL4、LOX的表达升高（P<0.05）；与诱导剂组相比，电针血清+诱导剂组HT22细胞内FTH1、SLC7A11、GPX4的表达升高（P<0.05），TFR1、NCOA4、ACSL4、LOX的表达降低（P<0.05）。见图7。

3 讨论

脑卒中后认知障碍在中医学中归类为“健忘”“呆病”等范畴，其病位在脑，病机主要为痰瘀阻脑、脑髓失养，临床上常以“通督醒神、填精益髓”为主要治则^［12］。本课题组在中原名医冯晓东教授“病位在脑，首取督脉”学术思想的指导下，结合文献研究，提出了以“神庭”和“百会”为核心的“通督醒神”针刺疗法，并通过大量临床实践证实了其对改善脑卒中后认知障碍的明显疗效^［9，10］。针刺血清作为一种新兴研究方法，借鉴了血清药理学和中药血清学的理念，通过提取针刺后的血清进行干预，观察其对体内外器官、组织、细胞及分子靶标功能和形态的影响，为针刺疗法的机制研究提供了新的方向^［13］。张慧等^［14］研究发现针刺“百会”和“大椎”两穴的大鼠血清能够上调无镁培养的海马神经元中微管相关蛋白2和生长相关蛋白43的表达，从而改善神经元损伤。此外，Xu等^［11］将电针治疗后MCAO/R大鼠的血清外泌体注射至其他MCAO/R大鼠体内，发现其明显减少了MCAO/R大鼠的脑梗死体积和病理损伤。与这些研究结果一致，本实验发现不同浓度的电针血清可改善OGD/R后HT22神经元的形态损伤并降低细胞毒性，其中10%浓度的电针血清效果最佳。此外，近期的一项蛋白组学和网络分析表明，针刺后的外泌体可能通过携带活性物质参与脑损伤的修复与调节，这进一步提示电针血清中的活性成分可能通过多种机制发挥卒中后神经保护作用^［15］。

海马是大脑边缘系统的重要组成部分，负责调节长期记忆和情绪。多项研究已证实，海马神经元功能的衰退和过度死亡是导致老年人记忆力下降的关键因素之一^{［16，17］}。本团队的前期动物实验亦表明，短暂的脑缺血可以引发海马CA1区神经元的广泛溶解和变性坏死。在本次体外研究中发现OGD/R不仅会导致HT22神经元活力下降、毒性增强、细胞凋亡增加，还使其呈现出线粒体嵴减少及外膜破裂等铁死亡的典型形态学特征。铁死亡诱导剂Erastin加剧了上述现象，而电针血清干预后可逆转则表明电针血清在提升海马神经元活力、减少神经元损伤和凋亡方面可能于干预铁死亡密切相关。

铁死亡是Dixon等^［18］于2012年提出来的一种铁依赖性的新型细胞死亡形式，在细胞死亡过程中通常伴随着大量铁沉积和脂质过氧化物堆积。这种独特的细胞死亡形式受多种细胞代谢途径的调节，其中细胞内铁超载是脑缺血后诱发神经元铁死亡的主要机制。细胞内大量的游离的Fe²⁺一方面容易与H₂O₂发生芬顿反应，产生能对DNA、蛋白质和膜脂质造成氧化损伤的羟基自由基，另一方面又可通过参与脂氧合酶的合成，促进脂质过氧化反应的发生而损伤细胞膜导致细胞死亡^［19］。TFR1是铁离子的主要转运蛋白。基础研究显示，在MCAO/R模型大鼠的脑梗死区中存在大量铁沉积，并伴随TFR1表达的明显上调^［20］。铁螯合剂或转铁蛋白受体特异性抑制剂的使用能够明显减小脑梗死体积^［21］。此外，临床研究也指出，脑缺血患者的血清铁离子和转铁蛋白水平明显升高^［22］。然而，病理性铁超载并非仅通过TFR1介导，NCOA4作为关键衔接蛋白，能够介导FTH靶向转运至溶酶体，诱导铁蛋白自噬。研究表明，NCOA4基因的敲低可明显抑制铁蛋白自噬过程，减少细胞内不稳定铁和ROS的累积，进而缓解铁死亡^［23］。因此，维持细胞内铁代谢稳态是预防铁死亡的关键。本研究发现，电针血清能够明显增加OGD/R处理后HT22神经元中FTH1蛋白的表达，减少细胞内游离Fe²⁺的沉积，稳定细胞内铁储存。同时，电针血清还明显降低了与铁死亡相关的关键蛋白TFR1和NCOA4的表达，从而减少细胞内铁超载。这表明，电针血清可能通过调控铁代谢稳态，抑制细胞内铁的过度积累进而对OGD/R诱导的HT22海马神经元损伤发挥神经保护作用。

细胞内抗氧化系统的失活所引发的脂质过氧化反应，是导致铁死亡的另一个关键因素^［24］。作为抗氧化系统的上游调控蛋白，System Xc⁻不仅在谷氨酸与胱氨酸转运平衡中起重要作用，亦在GSH的合成中扮演了关键角色^［25］。GSH是细胞内重要的抗氧化剂，能够有效缓解氧化应激。然而，脑缺血可损伤System Xc⁻的功能，不仅导致细胞外谷氨酸的积累，进而引发神经元的兴奋性毒性，还抑制了GSH的合成，削弱了神经元的抗氧化防御，加速铁死亡的进程^{［26，27］}。已有研究表明，GSH作为铁死亡的内源性抑制剂，其水平与神经元的存活密切相关。在OGD/R诱导的原代小鼠皮层神经元损伤模型中，GSH和GPX4的表达水平明显下降；然而，通过增强GPX4和GSH的表达，可以提高神经元的抗氧化能力，抑制铁死亡，并减轻由缺血性脑卒中引起的损伤^［28］。目前，药物依达拉奉已获批用于急性缺血性脑卒中的临床治疗，其治疗机制涉及抑制因胱氨酸缺乏而导致的GSH含量下降，从而阻止铁死亡的发生^［29］。同样，脂质过氧化反应中的关键酶LOX和ACSL4在铁死亡过程中也发挥了不可或缺的作用。研究表明，LOX基因的敲除可明显减少蛛网膜下腔出血小鼠的脑水肿体积^［30］。此外，在小鼠MCAO模型中，LOX在脑缺血梗死区的表达明显增加，而其抑制剂能够有效抑制神经元铁死亡并减少细胞损伤^［31］。ACSL4被认为通过促进磷脂酰乙醇胺的合成，增强脂质过氧化反应，从而加速铁死亡^［32］。Cui等^［33］的研究表明，敲除ACSL4基因明显减少了脑组织中的铁沉积和脂质过氧化物的累积，有效保护小鼠免受脑缺血损伤。 Chen等^［34］的研究也发现使用ACSL4抑制剂罗格列酮能够明显促进MCAO模型小鼠的神经功能恢复，减少脑梗死体积，这一作用与明显降低ROS水平、减轻细胞内氧化应激反应以及减少神经元铁死亡密切相关。因此，激活细胞内抗氧化系统，抑制脂质过度氧化是抑制铁死亡有效手段。本研究发现，电针血清明显上调了OGD/R损伤后HT22细胞System Xc⁻系统中关键蛋白SLC7A11的表达，促进了GSH和GPX4的合成，并明显降低了HT22细胞内LOX和ACSL4的表达，同时也降低了MDA和ROS的含量。这提示，电针血清可能通过激活细胞内抗氧化系统，增强海马神经元的抗氧化能力，减轻细胞内脂质氧化应激反应，从而延缓铁死亡进程。

综上所述，本实验初步推测，电针血清可能通过调控铁代谢平衡、激活SLC7A11/GPX4介导的抗氧化系统、减轻脂质过氧化，从而抑制铁死亡，进而对OGD/R后HT22神经元产生保护作用。该项研究不仅是本团队在电针血清对OGD/R后HT22神经元的保护作用及可能机制方面的探索，还为电针在治疗中风后认知障碍中的广泛应用提供了重要的理论依据。然而，本研究尚未明确电针血清中具体哪些活性成分对铁死亡产生影响，因此，未来研究应结合现代分子生物学技术，如高通量测序和质谱分析，进一步鉴定电针血清中的关键活性成分及其作用机制，以明确其在铁死亡调控中的具体作用。

作者贡献度说明：

陈露露：实验设计、数据收集与分析，初稿撰写；阮晓迪、高静：实验操作和数据分析，并参与结果解析、讨论撰写；陈渤霏、苏凯奇、吕转：实验材料的准备部分实验的执行；房璐、安雨琦：数据统计、图表制作；吴明莉、王慧灵、李瑞青：指导实验，审阅论文；冯晓东：总体研究设计和指导，审阅了论文的所有版本，并最终批准了论文的提交。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82174473)

国家自然科学基金联合基金(U2004131)

河南省科技攻关计划项目(232102311210)

河南省科技研发计划联合基金(232301420072)