异鼠李素对喉癌细胞生长、迁移及PI3K/AKT1/β‑catenin信号的抑制作用

Mechanism of isorhamnetin inhibiting growth and migration of laryngeal cancer cells and PI3K/AKT1/β‑catenin signaling

摘要

目的 探讨异鼠李素（isorhamnetin，ISO）对喉癌细胞生长、迁移的影响及其与PI3K/AKT1/β‑catenin信号的关系。 方法 以喉癌细胞株（HEP‑2、TU212）、人结肠上皮细胞（NCM460）为研究对象，通过MTT法、克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验、台盼蓝染色、Hoechst 33258染色、线粒体膜电位检测、活性氧检测等方法，分析ISO对喉癌细胞生长、迁移的影响；网络药理学及分子对接预测ISO作用于喉癌细胞的分子靶点；Western blot检测喉癌细胞中p‑PI3K、p‑AKT1、β‑catenin和cyclin D1蛋白的表达情况。 结果 与对照组（ISO 0 μmol/L）比较，ISO（10、20、40 μmol/L）明显抑制HEP‑2、TU212细胞的增殖、克隆形成、迁移与侵袭，并诱导细胞活性氧水平升高、线粒体膜电位降低，细胞凋亡率升高；网络药理学与分子对接提示ISO可能作用于AKT1分子靶点；Western blot结果发现，不同浓度的ISO（10、20、40μmol/L）处理HEP‑2、TU212细胞之后，p‑PI3K、p‑AKT1、β‑catenin和cyclin D1的蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.05）。 结论 ISO能抑制喉癌细胞的生长、迁移，并通过升高活性氧水平、降低线粒体膜电位诱导细胞凋亡，ISO作用的分子机制可能与调节喉癌细胞的PI3K/AKT1/β‑catenin信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of isorhamnetin （ISO） on the growth and migration of laryngeal cancer cells and its relationship with PI3K/AKT1/β‑catenin signaling. Methods Laryngeal cancer cell lines （HEP‑2， TU212） and human colon epithelial cells （NCM460） were used as the research objects， the effects of ISO on the growth and migration of laryngeal cancer cells were analyzed by MTT assay， colony formation assay， scratch assay， Transwell assay， trypan blue staining， Hoechst 33258 staining， mitochondrial membrane potential detection， and reactive oxygen species detection； Network pharmacology and molecular docking were used to predict the molecular targets of ISO on laryngeal cancer cells； Western blot was used to detect the expressions of p‑PI3K， p‑AKT1， β‑catenin， and cyclin D1 protein in laryngeal cancer cells. Results Compared to the control group （ISO 0 μmol/L）， ISO （10， 20， 40 μmol/L） significantly inhibited the proliferation， colony formation， migration， and invasion of HEP‑2 and TU212 cells， and induced the increase of reactive oxygen species level， the decrease of mitochondrial membrane potential， and the increase of apoptosis rate. The results of network pharmacology and molecular docking suggested that ISO may have effects on AKT1 molecular targets； Western blot results showed that the protein expression levels of p‑PI3K， p‑AKT1， β‑catenin， and cyclin D1 were significantly lower than those in the control group after HEP‑2 and TU212 cells were treated with different concentrations of ISO （10、20、40μmol/L）（P<0.05）. Conclusions ISO can inhibit the growth and migration of laryngeal cancer cells， and induce apoptosis by increasing the level of reactive oxygen species and reducing mitochondrial membrane potential， and its molecular mechanism may be related to the regulation of PI3K/AKT1/β‑catenin signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

异鼠李素 / 喉癌 / 生长 / 迁移 / PI3K/AKT1/β‑catenin

Key words

Isorhamnetin / Laryngeal cancer / Growth / Migration / PI3K/AKT1/β‑catenin

喉癌是一种常见的头颈部肿瘤，由于其早期症状不典型，大多数喉癌患者在晚期时才被诊断。目前以手术治疗联合放、化疗为主的治疗方式，可明显提高病人的生存质量、延长生存时间^［1，2］，但预后较差。合并咽瘘、切口感染、呼吸困难等并发症的喉癌晚期患者5年生存率仅为20%^［3］。因此，寻找新的治疗方案对改善喉癌的预后具有重要意义。

异鼠李素（isorhamnetin，ISO）是一种黄酮类化合物，微溶于水、甲醇，易溶于DMSO，分子式为C₁₆H₁₂O₇，相对分子量为316.27，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、预防肥胖等功能^［4，5］。研究发现，ISO在胆囊癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中发挥抑制癌细胞增殖，促进凋亡作用^［6‑8］。尽管ISO在体内外已被证实能抑制多种肿瘤细胞的增殖，但其对喉癌的抗肿瘤作用及具体机制仍不清楚。因此，本研究采用细胞与实验网络药理学、分子对接结合的方法，探究ISO对喉癌细胞生长、迁移的影响及其机制是否与PI3K/AKT1/β‑catenin信号相关。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人喉癌细胞HEP‑2、TU212细胞株和人结肠上皮细胞NCM460为本实验室保存。

1.1.2 药物

ISO，分析标准品，HPLC≥98%，CAS号：480‑19‑3，批号：B21554，购于上海源叶公司。

1.1.3 主要试剂和仪器

台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（批号：C0011）、Hoechst染色检测试剂盒（批号：C0003）、GAPDH Mouse Monoclonal Antibody（批号：AF0006）购于中国碧云天生物公司；PI3K（批号：ab133595）、p‑PI3K（批号：ab182651）购于Abcam公司；p‑AKT1单克隆抗体、AKT1单克隆抗体（批号：66444‑1‑lg、80457‑1‑RR）购于武汉三鹰生物技术有限公司；β‑catenin单克隆抗体（批号：8480s）购于Cell Signaling Technology；cyclin D1单克隆抗体（批号：60186‑1‑Ig）购于Protein Tech Group；双色预染蛋白Marker（批号：WJ102）购于上海雅酶生物医药公司；线粒体膜电位检测试剂盒（JC‑1，含阳性对照剂CCCP，批号：BL726A）、活性氧检测试剂盒（ROS，含阳性对照剂Rosup，批号：BL714A）购于Biosharp；多功能酶标检测仪购于美国BioTek公司；倒置荧光显微镜购于日本Olympus Corporation公司；ChemiDoc MP蛋白印迹‑多功能成像系统购于美国Bio‑Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人喉癌细胞HEP‑2、TU212及人结肠上皮细胞NCM460常规培养于T25瓶，DMEM高糖培养基中添加10%的胎牛血清及1%的双抗，在37 ℃及5% CO₂内，在细胞状态良好时进行以下实验。

1.2.2 细胞增殖实验（MTT法）

调整HEP‑2、TU212、NCM460细胞浓度为9×10³个/孔接种于96孔板，每个浓度分别建立6个复孔，将0、5、10、20、40、80 μmol/L的ISO药液以每孔100 μL的剂量加入，在继续培养24、48、72 h后，弃旧液，在每个孔加入10 μL的MTT，锡纸包裹继续培养4 h后，加入150 μL的DMSO孵育，摇床震荡15 min后使用酶标仪490 nm的波长检测各孔吸光值，GraphPad Prism 8.0软件绘制细胞生存曲线并计算IC₅₀值，将实验组和对照组的OD值相比较并乘100%，计算细胞的存活率，其中，0 μmol/L ISO组作为对照组，其它组为实验组。

1.2.3 细胞克隆形成实验

调整HEP‑2、TU212细胞浓度为1×10³个/孔接种于6孔板，加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的ISO培养7~14 d，用结晶紫染色后晾干拍照记录，ImageJ软件统计分析结果。

1.2.4 细胞迁移和侵袭实验

细胞横向迁移实验：调整HEP‑2、TU212细胞浓度为3×10⁵个细胞，24 h后用200 μL枪头划痕，加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的ISO，并在0、24 h拍照；细胞纵向迁移实验：调整HEP‑2、TU212细胞浓度为1×10⁵个/孔，在上室中加入200 μL不含血清的细胞悬液，下室加入含不同浓度ISO的培养基，培养24 h后，用4%的多聚甲醛固定、结晶紫染色，将小室洗净晾干后在显微镜下拍照并统计结果；细胞侵袭实验：除在上室中加入细胞悬液前预铺Matrigel基质胶外，其余步骤同细胞纵向迁移实验。

1.2.5 台盼蓝染色

调整HEP‑2、TU212细胞密度为4×10⁶个/孔，加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的ISO，培养24 h后重悬细胞，将100 µL重悬的细胞加入100 µL台盼蓝染色液中混匀，染色3 min后，用血细胞计数板拍照并计数。细胞存活率＝（细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数×100%。

1.2.6 Hoechst 33258染色

调整HEP‑2、TU212细胞密度为4×10⁴个/孔，加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的ISO处理24 h，按试剂盒说明书进行染色，PBS冲洗后进行拍照。

1.2.7 线粒体膜电位检测（JC‑1）

调整HEP‑2、TU212细胞密度为4×10⁴个/孔，加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的ISO处理24 h，加入0.5 mL阳性对照置于培养箱内孵育20 min，弃旧液，每孔加入200 μL细胞培养液和JC‑1工作液孵育20 min，弃旧液，加入JC‑1染色缓冲液洗2次，最后加入细胞培养液进行拍照。

1.2.8 ROS检测

调整HEP‑2、TU212细胞密度为5×10⁴个/孔，加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的ISO培养24 h后，去除旧液，每孔加入500 μL的DCFH‑DA，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液洗3次后拍照。

1.2.9 网络药理学及分子对接

在SwissTargetPrediction（http：//www.Swisstargetprediction.ch）、Genecard（https：//www.genecards.org）、DisGenet（http：//www.Disgenet.org）、OMIM（https：//www.omim.org）等数据库获得ISO及喉癌相关靶点、2者共同靶点；String蛋白质互作网络（PPI）分析数据库中导入共同靶点，选择人类数据库，设置评分值（置信度）>0.4后，隐藏游离节点，生成PPI蛋白互作网络节点图；cytoscape软件（cytoHubba插件）获得作用力最强的前15个靶点；DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）对靶基因进行GO与KEGG的富集分析；利用PubChem、RCSB PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）对结合能力最强的靶点进行分子对接。

1.2.10 Western blot实验

加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的ISO处理24 h，提取细胞蛋白，按Western blot法进行上样、电泳、转膜、孵育，使用ECL显影液采集图像，用ImageJ软件对蛋白的灰度值进行统计，并计算其相对表达量。

1.3 统计学处理

本研究中所有实验独立重复3次。使用ImageJ和GraphPad Prism 8.0进行统计、分析、绘图，计量资料以\overline{x}\pm s表示，用单因素方差分析进行数据分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ISO对喉癌细胞增殖的影响

MTT结果显示（图1A、B），在不同浓度ISO（0、5、10、20、40、80 μmol/L）作用HEP‑2、TU212、NCM460细胞24、48、72 h后，ISO以浓度依赖性抑制HEP‑2、TU212细胞的增殖，而对NCM460细胞的增殖活力则无明显影响，其中HEP‑2细胞24 h存活率分别为（94.66±2.57）%、（83.50±1.72）%、（78.93±0.73）%、（66.65±3.01）%、（45.33±1.49）%、（21.60±0.81）%，IC₅₀为（28.27±3.04） μmol/L，TU212细胞24 h存活率分别为（90.60±1.57）%、（81.66±2.48）%、（65.46±1.86）%、（53.20±1.27）%、（38.70±2.27）%、（16.71±1.04）%，IC₅₀为（23.01±2.66） μmol/L。与对照组相比，差异具有统计学意义（F_HEP‑2=200.0，F_TU212=226.5，P<0.05），因此，本研究采用0、10、20、40 μmol/L的ISO浓度作用24 h进行后续的实验。

细胞克隆形成实验结果显示（图2A、B），经不同浓度ISO（0、10、20、40 μmol/L）处理后HEP‑2、TU212细胞的体外克隆形成团数逐渐减少，HEP‑2的克隆形成率分别为（82.00±2.08）%、（52.33±1.76）%、（35.00±2.88）%、（12.00±2.30）%，TU212的克隆形成率分别为（92.66±2.60）%、（65.00±2.88）%、（45.33±2.90）%、（15.33±2.90）%。与对照组相比，差异具有统计学意义（F_HEP‑2=164.9，F_TU212=132.7，P<0.05）。上述结果表明ISO具有明显抑制HEP‑2、TU212细胞增殖的作用。

2.2 ISO对喉癌细胞迁移和侵袭的影响

细胞划痕实验结果显示（图3A、B），经不同浓度ISO（0、10、20、40 μmol/L）处理后HEP‑2、TU212细胞的横向迁移能力受到明显的抑制，HEP‑2细胞划痕迁移率分别为（87.00±3.60）%、（66.33±3.28）%、（50.00±2.88）%、（8.00±1.15）%，TU212细胞划痕迁移率分别为（81.33±1.76）%、（61.66±3.75）%、（44.66±2.40）%、（7.33±1.76）%。与对照组比较，差异具有统计学意义（F_HEP‑2=134.3，F_TU212=151.2， P<0.01）。

细胞的纵向迁移和侵袭能力结果显示（图4A、B），经不同浓度ISO（0、10、20、40 μmol/L）处理后，HEP‑2、TU212细胞的纵向迁移和侵袭能力随ISO浓度升高而降低。与对照组相比，差异具有统计学意义（HEP‑2： F_迁移=192.8， F_侵袭=41.08， P<0.05；TU212：F_迁移=200.9， F_侵袭=116.0， P<0.01）。

上述结果说明ISO对HEP‑2、TU212细胞的迁移及侵袭有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性关系。

2.3 ISO诱导喉癌细胞的凋亡

台盼蓝染色结果显示（图5A、B），经不同浓度ISO（0、10、20、40 μmol/L）处理后HEP‑2细胞的存活率为分别为（75.33±4.48）%、（61.33±2.40）%、（53.00±3.51）%、（31.00±1.52）%，差异具有统计学意义（F=33.98，P<0.05）；TU212细胞的存活率分别为（87.00±4.35）%、（65.00±3.21）%、（46.00±2.30）%、（27.00±1.52）%，差异具有统计学意义（F=71.45，P<0.01），提示ISO呈浓度依赖性诱导HEP‑2、TU212细胞死亡。

Hoechst 33258染色结果显示（图6A、B），对照组中的细胞呈现出均匀的弱蓝色荧光，各给药组中细胞亮蓝色荧光细胞的数量增加，说明ISO可诱导喉癌细胞凋亡（F_HEP‑2=159.2，P<0.05；F_TU212=102.0，P<0.05）。

2.4 ISO对喉癌细胞线粒体膜电位及ROS水平的影响

JC‑1探针检测细胞中线粒体膜电位的变化，结果显示（图7A、B），与对照组相比，经不同浓度ISO处理后HEP‑2、TU212细胞表现出JC‑1单体（绿色）的增强、JC‑1聚集体（红色）减少，说明随着ISO药物浓度的增高，HEP‑2、TU212细胞线粒体膜电位逐渐下降（F_HEP‑2=88.81，P<0.05；F_TU212=164.3，P<0.05），结果提示ISO可能触发HEP‑2、TU212细胞的线粒体依赖性细胞凋亡。实验中同时设置CCCP处理组作为阳性对照，可见JC‑1染色绿色荧光增强和红色荧光淬灭，表明实验体系稳定可靠。

ROS水平在细胞凋亡的过程中发挥重要作用，高水平ROS作用于线粒体后，可引起线粒体肿胀、膜电位降低、线粒体膜通透性增高从而启动一系列凋亡信号^［9］。ROS结果显示（图8A、B），随着ISO浓度的增加，ROS荧光信号也逐渐增强，差异具有统计学意义（F_HEP‑2=119.6，P<0.05；F_TU212=74.93，P<0.01）。此外，阳性对照Rosup处理组细胞显示出最高水平的ROS荧光强度。

2.5 网络药理学及分子对接结果分析

通过数据库获得ISO靶点242个；喉癌靶点920个；2者共同靶点38个（图9）；PPI数据库生成了366条蛋白相互作用连线（图10）；筛选出ISO治疗喉癌的Top15的关键靶点（按degree算法评分顺序）分别为AKT1、EGFR、MMP9、NFKB1、GSK3B、MMP2、PTK2、IGF1R、RAF1、NFE2L2、IL2、ESR2、PTPN11、CDK1、MMP3（图11）；GO功能富集分析生成GO条目1 312条（P<0.05）（图12）；KEGG富集分析获得115个信号传导途径（P<0.05），主要富集在PI3K‑AKT、EGFR等信号通路（图13）；分子对接反映的是受体蛋白和配体结合构象的稳定性，分子对接结合能小于-5.0 kcal/mol表示该组分更好地结合到核心靶蛋白质上，当结合能低于-7.0 kcal/mol时，表明配体与蛋白具有强烈的结合活性。ISO和AKT1的结合能是-9.6 kcal/mol，分子对接结合能结果可视化见图14。结果显示，ISO与AKT1结合最稳定，同时综合以上度值结果，选择ISO和靶点AKT1进行后续体外实验验证。

2.6 ISO对喉癌细胞PI3K/AKT/β‑catenin信号及cyclin D1表达的影响

Western blot结果显示（图15A、B），随着ISO药物浓度的增加，HEP‑2、TU212细胞中p‑PI3K、p‑AKT1、β‑catenin、cyclin D1的表达量逐渐降低。与对照组相比，差异具有统计学意义（F_HEP‑2=188.7，F_TU212=60.87，P<0.05），表明ISO可能通过下调cyclin D1的表达抑制喉癌细胞的增殖，及ISO对喉癌细胞的作用可能与其对PI3K/AKT1/β‑catenin信号通路的调节有关。

3 讨论

喉癌是头颈部肿瘤中发病率较高的恶性肿瘤，其发病机制目前尚未完全阐明，一般认为主要与吸烟、饮酒、接触有害粉尘及乳头状瘤病毒感染等多种因素有关^［10］，其主要临床表现为声音嘶哑、呼吸困难、咳嗽、吞咽困难等症状，给患者带来了极大的痛苦^［11］，尽管其诊疗方法在近几年取得了较大进展，但患者存活率仍然较低^［1］。因此，寻找靶向性强、毒性低的治疗方案以提高生存率是当前治疗策略的当务之急。天然产物作为一种低毒的抗肿瘤药物，已逐渐成为抗癌药物研发的热点。ISO是一种具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性的药物，对胆囊癌^［6］、乳腺癌^［7］、膀胱癌^［8］、非小细胞肺癌^［12］等多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用。然而，ISO对喉癌细胞生长的影响及其机制尚不清楚。因此，本研究采用细胞与网络药理学、分子对接结合的方法，探讨ISO的抗喉癌作用及分子机制。

首先，本研究采用MTT法及克隆形成实验检测ISO对HEP‑2、TU212、NCM460细胞增殖作用的影响。结果显示，当不同药物浓度的ISO作用于HEP‑2、TU212细胞24 h后，与对照组相比，在浓度为20 μmol/L时，细胞形态开始皱缩、体积缩小，40 μmol/L时活细胞逐渐减少，80 μmol/L时仅存少量活细胞，表明ISO对HEP‑2、TU212细胞的增殖有明显的抑制作用，而不影响正常细胞的增殖；细胞迁移及侵袭实验结果也显示，相较于对照组，HEP‑2、TU212细胞的迁移能力及侵袭能力呈剂量依赖性降低；台盼蓝染色结果显示ISO能以浓度依赖性诱导喉癌细胞死亡；而Hoechst 33258细胞凋亡染色证实了ISO诱导HEP‑2、TU212细胞发生凋亡；JC‑1及ROS检测结果显示，ISO可引起HEP‑2、TU212细胞的线粒体膜电位降低、ROS水平增高。以上结果说明ISO可抑制喉癌的生长、迁移并诱导其发生凋亡，但其具体作用机制仍不清楚。

因此，本研究利用网络药理学中的PPI网络分析ISO和喉癌的靶点，确定Top15的关键基因，如AKT1、EGFR、MMP9、NFKB1、GSK3B、MMP2、PTK2、IGF1R等多个靶点，AKT1作为PI3K‑AKT通路的的下游靶点，在喉癌的发生、发展过程中发挥重要作用^{［13，14］}。EGFR的表达在喉癌生物进展中起着至关重要的作用^［15］；为进一步验证ISO治疗喉癌的作用机制，通过分子对接结果可知，ISO与AKT1结合较稳定，所以选取核心靶点AKT1进行后续机制的验证；以往研究发现ISO可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制前列腺癌细胞增殖、迁移^［16］；ISO还可通过降低β‑catenin、cyclin D1蛋白的表达抑制结直肠癌细胞的生长和迁移^［17］；岩大戟内酯B可通过PTEN/PI3K/Akt信号通路，从而诱导喉癌细胞凋亡^［18］；去氢木香内酯通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导喉肿瘤细胞中发生自噬和凋亡^［19］；Western blot结果显示ISO可降低p‑PI3K、p‑AKT1、β‑catenin和cyclin D1蛋白表达。上述研究结果与预测结果基本一致，提示ISO可能通过抑制PI3K/AKT1/β‑catenin信号通路诱导细胞凋亡。

综上所述，ISO能有效地抑制HEP‑2和TU212细胞的生长、迁移并诱导细胞凋亡，其机制可能是通过调控PI3K/AKT1/β‑catenin信号通路介导的线粒体凋亡途径发挥抗喉癌作用，为今后临床预防和治疗喉癌提供了理论依据。

作者贡献度说明：

佘同辉：承担课题的经费、文章整体的设计和书写把关；余南琼：文章的书写、相关实验操作、数据整理；付一笑：部分实验操作、实验数据整理；冷东泽、胡美纯：技术支持、提供部分实验指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

湖北省自然科学基金(2016CFB491)

湖北科技学院医学科研专项基金(2022YKY07)

湖北科技学院医学科研专项基金(2022YKY08)

湖北科技学院五官医学院专项基金(2020WG09)