重楼皂苷Ⅱ与反式肉桂醛调控ROCK/LIMK/cofilin通路抑制子宫腺肌病异位内膜细胞侵袭迁移的机制研究

Mechanism of polyphyllin Ⅱ and trans‑cinnamaldehyde modulating the ROCK/LIMK/cofilin pathway to inhibit invasive migration of ectopic endometrial cells in uterine adenomyosis

摘要

目的 探究重楼皂苷Ⅱ（polyphyllin，PPⅡ）与反式肉桂醛（trans-cinnamaldehyde，TCA）通过调控ROCK/LIMK/cofilin通路抑制子宫腺肌病（adenomyosis，AM）进展的机制。 方法 提取人子宫腺肌病异位内膜细胞（adenomyosis-derived cells，AMDC）进行培养，采用CCK-8法检测梯度浓度的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ（PPⅠ、PPⅡ、PPⅦ）及TCA对AMDC活力的影响；采用正交试验设计筛选PPⅡ与TCA（简称PT）的最佳配比；采用Transwell实验和免疫荧光实验检测PT抑制AMDC侵袭、迁移的能力；采用Western blot检测ROCK1、LIMK、p-LIMK、cofilin、p-cofilin的蛋白表达水平；对ICR小鼠腹腔注射梯度浓度的PT 30 d，采用苏木素-伊红染色法观察小鼠肝、脾和肾组织的形态学改变，采用酶联免疫吸附法检测血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）活性。他莫昔芬滴喂新生ICR雌鼠建立AM模型，设置空白对照组、模型组、PT低剂量组、PT高剂量组和阳性药物复方米非司酮组，药物干预30 d，采用H&E染色检测小鼠子宫的形态学改变；采用免疫组化评估子宫组织内ROCK1、p-LIMK、p-cofilin以及KI67的表达水平改变。 结果 体外实验结果显示，PPⅡ和TCA抑制AMDC活力效果较好；PT抑制AMDC侵袭、迁移效果最显著（P<0.001），下调ROCK1、LIMK、p-LIMK、cofilin、p-cofilin蛋白表达（P<0.05），抑制AMDC骨架重排（P<0.001）。体内实验结果表明，PT药物未损伤小鼠肝、脾和肾组织形态，不影响血清ALP、BUN活性和AST/ALT比值，能够减轻AM模型小鼠子宫内膜腺体向肌层侵袭的数量，降低AM小鼠子宫组织中ROCK1、p-LIMK、p-cofilin和KI67的表达水平（P<0.05）。 结论 PT可通过调控ROCK/LIMK/cofilin通路抑制AM腺体向肌层的侵袭和迁移，延缓AM进展。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of polyphyllin （PPⅡ） and trans-cinnamaldehyde （TCA） inhibiting the progression of adenomyosis （AM） through modulating the ROCK/LIMK/cofilin pathway. Methods Human adenomyosis-derived cells （AMDC） were extracted and cultured， and the effects of gradient concentrations of polyphyllin Ⅰ，Ⅱ，Ⅶ （PPⅠ， PPⅡ， PPⅦ） and TCA on the viability of AMDC were detected using CCK-8 assay； the optimal ratio of PPⅡ to TCA （PT for short） was screened by orthogonal experiment； Transwell assay and immunofluorescence assay were used to detect the ability of PT to inhibit AMDC invasion and migration； Western blot was used to detect the protein expression levels of ROCK1， LIMK， p-LIMK， cofilin， and p-cofilin； graded concentrations of PT were injected intraperitoneally into ICR mice for 30 d. Hematoxylin-eosin staining （H&E） was used to observe the morphological changes in the liver， spleen， and kidney tissues of the mice， and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to measure the activities of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALP）， and blood urea nitrogen （BUN） in serum. Tamoxifen was fed to the neonatal ICR female mice to establish the AM model， as well as the blank control group， the model group， the low-dose group of PT， the high-dose group of PT， and the group of the positive compounded mifepristone group were set up， and administered drug-intervention for 30 d. Morphological changes in the mouse uterus were detected by H&E staining， and the expression levels of ROCK1， p-LIMK， p-cofilin， and KI67 in uterine tissues were detected by immunohistochemistry. Results The results of in vitro experiments showed that PPⅡ and TCA were more effective in inhibiting AMDC viability； PT most significantly inhibited AMDC invasion and migration （P<0.001）， downregulated the protein expression of ROCK1， LIMK， p-LIMK， cofilin， and p-cofilin （P<0.05）， and inhibited the cytoskeletal rearrangement of AMDC （P<0.001）. The results of in vivo experiments showed that PT drug did not damage the liver， spleen， and kidney tissue morphology； did not affect serum ALP， BUN activity， and AST/ALT ratio； attenuated the number of endometrial glands invading the myometrium in AM model mice， and reduced the expression levels of ROCK1， p-LIMK， p-cofilin， and KI67 in uterine tissues of AM mice （P<0.05）. Conclusion PT can reduce the invasion of glands into the myometrium and delay the progression of AM by inhibiting the expression of ROCK/LIMK/cofilin pathway.

Graphical abstract

关键词

子宫腺肌病 / 重楼皂苷Ⅱ / 反式肉桂醛 / ROCK/LIMK/cofilin通路

Key words

Adenomyosis / PolyphyllinⅡ / Trans-cinnamaldehyde / ROCK/LIMK/cofilin pathway

子宫腺肌病（adenommyosis，AM）是一种良性妇科疾病，主要特征为子宫内膜腺体与间质侵入子宫肌层。临床症状涉及子宫异常出血、月经过多及痛经^［1］，严重情况下可能导致不孕，并对辅助生殖技术的助孕效果产生负面影响^［2］，多发于育龄妇女，发病率为7%~23%，且呈逐年增高的趋势^［3］。尽管子宫切除术是治疗AM的根治性方案，但难以满足女性对生育的需求，药物治疗多采用孕激素、促性腺激素类似物等控制疾病进展，具有诸多副作用，影响生育能力，患者接受度低^［4］，因此，寻找高效低毒的药物是当前迫切需要解决的问题。

相对于西医严重不良反应，中药在改善痛经、调经助孕等领域展现出独特的优势，已被列入2020年《子宫腺肌病诊治中国专家共识》诊疗指南^［5］。课题组前期研制了组方融合桂枝茯苓丸、宫血宁胶囊等多个经典名方验方主要成分的医疗机构制剂“通脉化癥合剂”（鲁药制备字Z20240154000），临床证实可显著降低AM病人月经量、痛经程度和血清CA125水平^［6］，《中成药治疗痛经临床应用指南（2021年）》^［7］提示，桂枝茯苓丸可减少AM病灶，改善痛经和妊娠结局，且能明显降低AM小鼠子宫内膜浸润肌层^［8］。《宫血宁胶囊妇产科临床应用指导建议》^［9］明确指出，宫血宁胶囊展现出显著优势，能够有效减少子宫异常出血患者的出血量。因此，课题组取桂枝茯苓丸中的核心成分桂枝，以其温经通脉、止痛之效，同时引入宫血宁胶囊单一成分重楼，旨在解毒化瘀、止血，构建桂楼关键药对，协同作用于病症，开展了一系列实验研究，以揭示其治疗AM的科学机制。

课题组前期研究发现，桂楼药对可通过调控Rho/ROCK通路有效抑制AMDC的迁移、侵袭能力^［10］，桂枝中的主要药物成分^［11］及重楼中的药物成分^{［12，13］}均可降低AMDC的侵袭和迁移，但桂楼药对中具体有效组分尚不明确，其联合应用在AM中的作用机制仍有待进一步阐述。近年来，张伯礼院士创新性的提出了组分中药的概念，以中医药理论为指导，遵循方剂配伍理论与原则，由有效组分配伍而成的现代中药^［14］，具有安全、有效、稳定、可控的特征，可有效解决单味药治疗复杂病情的局限性，有望为临床带来低毒高效的新药，越来越为研究的热点^［15］。因此，在AM体内外模型中验证桂楼有效组分联用（简称PT）调控ROCK/LIMK/cofilin通路，阻断或延缓异位内膜细胞侵袭、迁移的作用效果，探究深层次作用机理，为中医药治疗AM提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞

SPF级ICR雌性小鼠48只，雄性小鼠9只（6周龄），购自维通利华［SYXK（鲁）2022-0009］，于山东中医药大学附属医院的SPF隔离室中进行饲养，环境设定在（22±2） ℃的恒温条件下，遵循12 h/12 h周期的固定饮食周期，确保常规且稳定的生长环境。此研究已获山东中医药大学附属医院伦理委员会的批准与支持（批准号：AWE20230823001）。

AM异位病灶标本取自临沂市中心医院就诊的AM患者。所有患者均签署了知情同意书，且该研究方案已获得伦理委员会的批准（2018临床科研申报号第021号）。将AM病灶组织于无菌条件下剪切成1 mm³大小，加入4倍体积的0.1%胶原酶Ⅳ，置于37 ℃环境孵育4 h，直至成完全溶解至乳糜状态，通过70 µm和40 µm孔径细胞筛网过滤，1 000 r/min离心5 min后，去除上清，沉淀物中加入DMEM/F-12完全培养液（含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液）重悬，并计数细胞数量，接种于6孔板中，置于5% CO₂培养箱中进行培养。取3~10代的AM异位病灶细胞作为后续的研究对象。

1.2 药品与试剂

反式肉桂醛购自上海源叶生物科技有限公司（批号：B50765-1mL）；重楼皂苷Ⅰ（PolyphyllinⅠ，PPⅠ，批号：MUST-19031905）、重楼皂苷Ⅱ（PolyphyllinⅡ，PPⅡ，批号：MUST-21062804）、重楼皂苷Ⅶ（PolyphyllinⅦ，PPⅦ，批号：MUST-18062201）购自于成都曼斯特生物科技有限公司；米非司酮购自美国MedChemExpres公司（批号：26593）；胎牛血清购自苏州双洳生物科技有限公司（批号：S711-001S）；DMEM/F-12培养基（批号：F3023N1）购自中科迈晨（北京）科技有限责任公司；0.25%胰蛋白酶（批号：J121102）、青霉素-链霉素双抗溶液（批号：J121004）购自上海源培生物科技股份有限公司；Matrigel基质胶购自博奥森生物科技有限公司（批号：354234）；细胞固定液（批号：20191217）、结晶紫（批号：20211009）购自武汉索莱宝生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（批号：E-CK-A362）；复方米非司酮片购自武汉九珑人福药业有限责任公司（国药准字H20040365，批号：07230501）；他莫昔芬购自美国Sigma-Aldrich公司（批号：WXBD7619V）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，H&E）染色试剂盒（批号：HADGP）；BCA蛋白浓度检测试剂盒（批号：Z928240816）；PVDF膜（批号：000176876）购自广州伟伯科技股份有限公司；ROCK1抗体购自Proteintech公司（批号：21850-1-AP）；p-LIMK抗体购自美国CST公司（批号：AF3345）；p-cofilin抗体购自美国ABCclonal公司（批号：AP0178）；KI67抗体购自武汉塞维尔科技有限公司（批号：GB111141）。

1.3 仪器

二氧化碳培养箱（德国Memmert）；5424R型高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；Multiskan Go1510型酶标仪（美国Thermo公司）；HP30型自动组织脱水机［达科为（深圳）医疗设备有限公司］；DHG-9070A型鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；BM450A型包埋机、BM450型包埋冷冻台、PH60型病理组织漂烘仪（常州派斯杰医疗设备有限公司）；531CM-Y43型轮转式切片机（德国Leica公司）；WS-10病理切片扫描仪（中国Wisleap）。

1.4 药物制备

购买PPⅡ粉末和反式肉桂醛4 ℃避光密封保存。TCA溶于二甲基亚砜，配成浓度为200 mmol/L母液，-20 ℃保存；取20 mg PPⅡ粉末溶于23.39 mL二甲基亚砜，配制终浓度1 mmol/L的母液，贮存于-20 ℃；将25 mg米非司酮粉末与100 μL二甲基亚砜混合，制备成浓度为250 mg/mL的母液。母液应于-20 ℃的避光条件下长期保存，用于后续体外试验。

参照通脉化癥合剂（鲁药制备字Z20240154000）中的标准临床用量，成年人（60 kg）每日服用桂枝、重楼的量分别为10 g和9 g，符合《中国药典》，根据人体与小鼠体表面积比值换算方法^［16］，PT的1倍临床剂量为7.88 mg/kg 的PPⅡ加上53.34 mg/kg的TCA充分混合，以37 ℃、50 Hz超声振荡30 min，设置浓度梯度分组为1/2和1倍的临床用量。复方米非司酮的1倍临床等效剂量相当于3.25 mg/kg，将复方米非司酮片溶解于生理盐水之中^［17］，用于后续体内实验。

1.5 细胞实验

1.5.1 CCK‑8实验

以每孔3.5×10³的AMDC培养于100 μL/孔的96孔板内，培养24 h后，加入不同摩尔浓度的PPⅠ（0、0.5、1、2、4、8 μmol/L）、PPⅡ（0、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L）、PPⅦ（0、0.5、1、2、4、8 μmol/L）、TCA（0、30、60、120、240、480 μmol/L）和不同摩尔浓度的米非司酮（0、25、45、90、180、360 μmol/L），各组设置3个复孔，对照组加入空白培养基。处理48 h后，更换孔内液体为含10% CCK-8的培养基，37 ℃保持2 h，用酶标仪测量光吸收度。通过GraphPad Prism 9软件统计实验数据处理并计算AMDC的半抑制浓度（IC₅₀）。

1.5.2 Transwell侵袭实验

将Transwell小室放入24孔板内，将Matrigel基质胶与DMEM/F-12培养基按照1∶9的比例稀释混合，每孔滴入25 μL稀释好的基质胶，37 ℃孵育30 min；将生长至对数期的细胞消化，每个小室加入500 μL含2.5×10⁴细胞的无血清培养基，在下室加入600 μL完全培养基（含10% FBS），将上室放入其中，24孔板置于37 ℃培养箱，培养48 h后取出，将Transwell小室底部浸入4%组织固定液中固定20 min，后浸入0.1%结晶紫，37 ℃染色30 min，后用棉签将基质胶擦掉，上室底部浸入PBS中，洗去多余结晶紫，倒置晾干，显微镜下拍照。

1.5.3 Transwell迁移实验

与侵袭实验不同的是操作过程中不使用基质胶，其余步骤与“1.5.2项”相同。

1.5.4 免疫荧光法

将对数生长期的AMDC接种于含有细胞爬片的24孔板内，并加入梯度浓度的PT药物（0、3.94 mg/kg PPⅡ+26.67 mg/kg TCA、7.88 mg/kg PPⅡ+53.34 mg/kg TCA），培养过夜。细胞贴壁后，弃培养基，用预温的PBS洗涤3次，5 min/次，洗去细胞表面多余的培养液；经细胞组织固定液固定10 min、0.2%TritonX-100（PBS稀释）通透，加入TRITC-phalloidin（稀释度为1∶100）200 μL，慢摇30 min；PBS清洗3次，加入200 μL DAPI染液染色5 min，将细胞爬片取出，用荧光淬灭剂封片，在室温下静置一夜，用激光共焦显微镜对其荧光强度进行观测并测定。

1.5.5 Western blot实验

使用蛋白裂解液对收集的各组AMDC进行裂解，提取细胞中的总蛋白，利用BCA试剂盒对其浓度的进行检测。采用12% SDS-PAGE对所获得的蛋白质进行分离，再将其转移到PVDF膜上，在室温下用含有5%脱脂奶粉TBST的封闭液封闭1 h后，分别加入ROCK1（1∶1 000）、LIMK（1∶1 000）、p-LIMK（1∶1 000）、cofilin（1∶1 000）、p-cofilin（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗体，4 ℃过夜孵育；随后孵育相对应二抗（1∶5 000），TBST清洗3次后，采用ECL化学发光试剂盒结合（化学发光）成像仪，拍照并记录蛋白的表达情况后，运用ImageJ软件对图像的灰度值进行分析。

1.6 动物实验

1.6.1 动物造模分组及给药

ICR小鼠（6周龄）适应性饲养1周后，将其按照雌∶雄2∶1的比例进行随机合笼，交配后随机选取32只新生雌性ICR小鼠，自出生第2天至第5天滴喂5 μL/g的花生油、卵磷脂和炼乳混合液（体积比2∶0.2∶3）+2.7 μmol/kg的他莫昔芬，制备AM模型小鼠。此外，取8只ICR雌性小鼠，自出生第2天至第5天滴喂不含他莫昔芬的混合液^［18-20］。常规饲养90 d后，将32只ICR雌性小鼠按照随机数表法分为模型组、复方米非司酮组（3.25 mg/kg）、1/2 PT组（3.94 mg/kg PPⅡ+26.67 mg/kg TCA）、PT组（7.88 mg/kg PPⅡ+53.34 mg/kg TCA），另设空白对照组，每组8只。各给药组小鼠每日腹腔注射100 μL给药溶液，空白对照组和模型组腹腔注射等体积的生理盐水，西药对照组灌胃等体积复方米非司酮溶液，各组持续干预30 d。末次给药2 h后，经戊巴比妥钠麻醉小鼠后，眼球取血获取血液样本，分离血清置于-80 ℃保存，随后处死小鼠，获取子宫、肝、脾、肾组织，进行形态学观察后，置于4%组织细胞固定液中固定，用于H&E染色和免疫组化检测。

1.6.2 小鼠血清学检测

使用促凝管通过摘眼球方式采集各组小鼠血液，室温下静置30 min，3 200 r/min离心15 min，取上清液，遵循ELISA试剂盒说明书检测血清中AST、ALT、ALP活性和BUN含量。

1.6.3 H&E染色

取各组小鼠子宫、肝、脾、肾组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，将切片在二甲苯中脱蜡，苏木素染色20 s、伊红复染30 s，随后用清水冲洗，完成切片的脱水透明处理，并以封片剂包封，最终在病理切片扫描仪下进行拍照。

1.6.4 免疫组化检测小鼠子宫组织中ROCK1、p‑LIMK、p‑cofilin和KI67的蛋白表达

对子宫组织切片进行脱蜡水化处理后，接着使用过氧化氢进行内源性过氧化物酶的封闭，并在37 ℃条件下孵育30 min，PBS洗3次。山羊血清封闭30 min后依次滴加稀释后的一抗孵育过夜（ROCK1 1∶800、p-LIMK 1∶300、p-cofilin 1∶100、KI67 1∶300），第2天组织切片室温下放置30 min复温，PBS洗3次，滴加二抗孵育40 min（稀释比为1∶200），加入DAB工作液显色。采用苏木素复染30 s后，依次进行脱水、透明和封片处理，观察并拍摄ROCK1、p-LIMK、p-cofilin以及KI67的免疫组化染色情况，利用Image-Pro Plus进行分析计算。

1.7 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计学分析，计量资料符合正态分布者采用（\overline{x}\pm s）进行描述，多组间运用one-way ANOVA进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞实验

2.1.1 各药物抑制AMDC的活力

CCK-8结果显示，PPⅠ、PPⅡ、PPⅦ、TCA和米非司酮均能有效抑制AMDC的活力，通过对数据的分析，获得各药物对应IC₅₀值，PPⅠ为（1.67±0.04） μmol/L（图1A），PPⅡ为（0.80±0.02） μmol/L（图1B），PPⅦ为（2.40±0.05） μmol/L（图1C），TCA为（161.43±4.20） μmol/L（图1D），米非司酮为（109.5±3.64） μmol/L（图1E）。结果显示，同浓度下PPⅡ与TCA抑制AMDC活力作用较强。通过正交实验^［21］，各设置3个水平（即0、1/2 IC₅₀、1/4 IC₅₀）验证了不同浓度PPⅡ和TCA药物组合对AMDC活力的影响，见表1。

2.1.2 PT抑制AMDC的迁移和侵袭

通过Transwell实验检测PT对AMDC迁移和侵袭的影响。单独使用PPⅡ与TCA处理AMDC 48 h后，与对照组相比，PPⅡ（P<0.05）与TCA（P<0.01）处理AMDC迁移和侵袭的数量均减少，见图2A、B；采用PT药物（0.4 μmol/L PPⅡ和40 μmol/L TCA）干预AMDC 48 h后，观察对应分组细胞数量，与对照组相比，1/2 PT与PT浓度抑制AMDC迁移性和侵袭性的细胞数量更显著（P<0.001），且呈浓度梯度依赖效应，见图2C。

2.1.3 PT调控AMDC中的ROCK/LIMK/cofilin信号通路

Western blot结果显示PT可下调AMDC中ROCK1蛋白的表达和LIMK、cofilin蛋白的磷酸化水平（P<0.05），免疫荧光结果显示空白对照组AMDC中F-actin表现出细丝结构异常，胞质F-actin面积较大，伪足伸出较多，细胞大多表面不规则且排列紊乱，见3A、B；1/2 PT和PT干预后细胞伪足数量减少，胞质F-actin面积缩小，荧光强度较对照组显著降低（P<0.001），见图3C、D。

2.2 动物实验

2.2.1 PT药物对小鼠肝、脾、肾功能的损伤程度评价

各浓度药物干预后，病理结果显示小鼠肝脏组织切片可见肝小叶结构无异常，肝细胞及血窦清晰，脾脏组织切片可见界限清晰的红髓区和白髓区，肾小体结构无异常，见图4A。各给药组小鼠血清ALP活性、BUN水平以及AST/ALT比值未见显著性差异，见图4B。饲养期间，观察小鼠生存状况，各组身体状况良好，饮食正常，皮毛、二便等行为表现均正常，无中毒和死亡情况，各组间小鼠体重呈上升趋势，未见显著性差异，见图4C。

2.2.2 PT改善AM模型小鼠子宫中腺体向肌层的侵袭

利用滴喂他莫昔芬法构建小鼠AM模型（图5A）。称量各组小鼠子宫质量，与空白对照组比较，模型组小鼠子宫质量显著升高（P<0.01）；与模型组相比，1/2 PT（P<0.01）和PT组（P<0.01）子宫质量显著降低，复方米非司酮组子宫质量也降低，未出现显著性差异，见图5B。观察结果显示，空白对照组中子宫内膜与肌层界限分明，未观察到内膜腺体及间质细胞向肌层的浸润；而在模型组中，子宫内膜与肌层的界限模糊，肌层内部出现了多个内膜腺体向肌层的浸润现象；1/2 PT组和复方米非司酮组子宫内膜与肌层边界较清晰，偶见腺体与间质侵入肌；PT组子宫内膜与肌层界限清楚，肌层完整，无明显浸润肌层的现象，见图5C。

2.2.3 PT抑制AM模型小鼠子宫组织中ROCK1、p‑LIMK、p‑cofilin和KI67的表达

与空白对照组相比，模型组子宫组织ROCK1、p-LIMK、p-cofilin及KI67显著升高（P<0.05）；与模型组相比，1/2 PT（P<0.05）、PT剂量组（P<0.001）和复方米非司酮组（P<0.05）子宫组织ROCK1、p-LIMK及KI67均显著降低，PT剂量组（P<0.01）和复方米非司酮组（P<0.001）子宫组织的p-cofilin蛋白表达也显著降低，见图6A、B。

3 讨论

AM发病及进展过程中，必然伴随子宫内膜对于肌层的入侵和浸润，故AMDC侵袭、迁移能力的增强是AM发生的关键^［2，22］。因此，找寻特异性药物抑制AMDC的侵袭和迁移，是当前亟待解决的问题。随着中医药的传承发展与创新，张伯礼院士提出要发展由有效组分配伍而成的现代中药，既能保持传统中药配伍增效减毒，同时药效物质基础及其作用机理又相对比较清楚，能够更加精准的作用于药物靶点，可有效提高疗效^{［23，24］}，现代中药组分的开发正逐渐成为中医药领域的研究热点。《景岳全书·妇人规》云：“瘀血留滞作癥，惟妇人有之”，“瘀血内阻”为AM核心病机。桂枝和重楼分别是AM临床治疗有效中成药桂枝茯苓丸和宫血宁胶囊的主要成分，也是课题组前期研发验证有效的医疗机构制剂“通脉化癥合剂”的核心药对^［9］。桂枝有温阳通脉散结作用，重楼具有清热解毒化瘀功效。现代药理学研究发现，桂枝对人肿瘤细胞具有抑制增殖及促进凋亡的功效^［25］，重楼能够阻断子宫内膜的侵袭和增殖，加速大鼠异位子宫内膜细胞的凋亡，减缓AM的进展^{［26，27］}，但其抑制AM侵袭和迁移的机制和主要组分尚不清楚。

有研究发现，中药复方^［28］可及中药组分^［29］均可通过调节ROCK/LIMK/cofilin信号通路抑制细胞骨架破坏的进程，以及细胞的迁移和侵袭。2020版《中国药典》^［30］指出PPⅠ、PPⅡ、PPⅦ是对重楼质量控制的指标性成分，TCA则被用于桂枝的鉴定。通过CCK-8实验筛选出重楼中有效组分为PPⅡ，且已有研究表明PPⅡ^{［31，32］}与TCA^{［33，34］}单独使用对多种肿瘤细胞均具有一定的抑制作用。因此，本研究进一步筛选PPⅡ与TCA最佳比例进行联合应用（简称PT），经Transwell实验证实，PT较PPⅡ、TCA单独使用抑制AMDC的侵袭和迁移效果更佳。

有研究显示，ROCK/LIMK/cofilin信号通路的过表达可增强细胞侵袭和迁移能力，可能是抑制子宫内膜细胞侵入、浸润子宫肌层的重要靶点^［35］，在机制上，ROCK通过激活下游的LIMK磷酸化，从而抑制纤维蛋白中肌动蛋白解聚活性，影响细胞骨架的稳定，而cofilin是LIMK下游的肌动蛋白解聚因子，在有丝分裂开始时刺激肌动蛋白丝的分离和解聚，是肌动蛋白丝动力学和解聚的调节剂，其活性主要由LIMK调节，LIMK的磷酸化可导致cofilin蛋白失去活性，抑制cofilin蛋白与ADP-肌动蛋白结合，聚合态的F-actin发生解聚，磷酸化程度受损害，细胞骨架重排程度也将减少^［36］。因此，基于ROCK/LIMK/cofilin信号通路在细胞骨架重排中的关键作用^［37］，本研究通过免疫荧光和Western blot，检测PT作用于ROCK/LIMK/cofilin信号通路的磷酸化水平以及观察细胞骨架纤维的形态改变，发现PT可下调ROCK/LIMK/cofilin信号通路的表达及磷酸化水平，最终抑制AMDC骨架蛋白重排，实现对细胞运动能力的调控，减弱了AMDC的侵袭和迁移能力，见图7。

同时，本研究通过体内实验对PT药物进行了亚慢性毒性评估^［38］，检测能够反映肝、脾、肾功能损伤的ALP活性、BUN水平及AST/ALT比值^［39］，未发现PT对小鼠肝、脾、肾功能的损伤，初步确定了PT的安全性；研究发现，激活ROCK/LIMK/cofilin通路会加速肿瘤细胞的转移进展^{［37，40］}，AM作为一种具有向远处的侵袭和转移等部分肿瘤特征的疾病，ROCK/LIMK/cofilin极有可能是调控其运动能力的重要信号通路。因此，本研究进一步通过PT干预AM模型小鼠，发现PT可减少AM模型小鼠子宫肌层中腺体的数量，降低子宫组织中ROCK1、p-cofilin和p-LIMK的表达，此外，增殖标志物KI67^［22］的表达也相对减弱。

综上，本研究实验结果表明，PT能够延缓AM的进展，其机制可能与其调控ROCK/LIMK/Cofilin通路介导细胞骨架重排，抑制异位内膜细胞运动能力的机制相关，可为AM的药物研发提供物质研究基础。

作者贡献度说明：

曹涵：负责完成实验、分析数据、撰写论文；王子璐：协助撰写论文与投稿；王楚矗：协助完成实验；石雅馨：协助分析数据；师伟：负责写作指导、项目管理和方法论指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82474559)

山东省自然科学创新发展联合基金资助项目(ZR2023LZY024)