ERK1/2信号通路在新生小鼠持续性肺动脉高压中发病的作用研究

The role of ERK1/2 signaling pathway in the pathogenesis of persistent pulmonary hypertension in neonatal mice

摘要

目的 研究细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号通路在新生小鼠持续性肺动脉高压中发病的作用。 方法 将80只新生小鼠置于缺氧箱内，随机分为对照组、新生儿持续性肺动脉高压（PPHN）组、二甲基亚砜（DMSO）组、抑制剂组，使用经肋间隙右心室穿刺法测量右心室收缩压（right ventricular systolic pressure， RVSP），H&E染色观察肺血管形态，计算肺血管重塑指标肺血管璧面积与管总面积比值百分比（WA%）和肺动脉壁厚度与血管外径比值百分比（WT%）；免疫组化法测定肺组织中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）蛋白表达水平；Western blot方法测定肺组织中PCNA、ERK1/2及p‑ERK1/2蛋白表达水平。 结果 PPHN组小鼠较对照组相比RVSP升高、右心室肥厚程度增大、肺泡破坏增多、肺动脉平滑肌明显增厚及PCNA、p‑ERK1/2表达明显增高，而加用ERK1/2抑制剂U0126的PPHN小鼠相比较PPHN组RVSP降低、右心室肥厚程度有所改善、肺泡破坏减少、肺动脉平滑肌增厚减轻及PCNA、p‑ERK1/2表达明显降低。 结论 ERK1/2信号通路参与PPHN小鼠新生小鼠持续性肺动脉高压的形成。

Abstract

Objective To study the role of ERK1/2 signaling pathway in the pathogenesis of persistent pulmonary hypertension PPHN in neonatal mice. Methods A total of 80 neonatal mice were placed in a hypoxic box and randomly divided into the control group， PPHN group， DMSO group and inhibitor group. Right ventricular systolic pressure （RVSP） was measured by right ventricular puncture through the intercostal space， and the morphology of pulmonary blood vessels was observed by H&E staining， and pulmonary vascular remodeling indexes， such as the ratio of pulmonary vascular wall area to the total area of the tube （WA%） and the ratio of pulmonary arterial wall thickness to the outer diameter of the blood vessel （WT%） were calculated.Expression level of proliferating cell nuclear antigen（PCNA） protein was detected by immunohistochemistry.The expression level of PCNA， ERK1/2 and p‑ERK1/2 proteins in lung tissue was detected by Western blot. Results The PPHN group exhibited elevated RVSP， increased right ventricular hypertrophy， increased alveolar destruction， significant thickening of pulmonary artery smooth muscle， and significant increased PCNA and p‑ERK1/2 expression compared to the control group. In contrast， PPHN mice with the addition of the ERK1/2 inhibitor U0126 resulted in a reduction in PVSP， an improvement in right ventricular hypertrophy， a reduction in alveolar destruction， and a significant decrease in pulmonary artery smooth muscle thickening. These effects were accompanied by a notable reduction of PCNA and p‑ERK1/2 expression. Conclusion The ERK1/2 signaling pathway is involved in the development of persistent pulmonary hypertension in neonatal mice.

Graphical abstract

关键词

新生儿持续性肺动脉高压（PPHN） / ERK1/2信号通路 / 肺动脉平滑肌 / 小鼠

Key words

Persistent pulmonary hypertension of the newborn（PPHN） / ERK1/2 signaling pathway / Pulmonary artery smooth muscle / Mice

新生儿持续性肺动脉高压（persistent pulmonary hypertension of the newborn， PPHN）是一种出生时循环适应受损临床综合征。由于出生时肺循环异常，导致肺血管阻力升高，进而引起严重的低氧血症^［1］，是导致新生儿死亡的主要原因之一^［2］。因此，探索PPHN潜在的发病机制及相应的治疗策略尤为重要。PPHN的病理特点主要表现为肺动脉平滑肌的过度增殖^［3，4］，因此，通过抑制肺动脉平滑肌的增殖可能在治疗PPHN中起到一定的作用。细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated protein kinases 1/2， ERK1/2）是一种有丝分裂原激活的蛋白激酶，是丝氨酸/苏氨酸激酶家族中的重要成员，可促进各种类型的细胞增殖与迁移^［5］。有研究表明，ERK1/2效应器在缺氧条件下参与细胞增殖、分化和迁移以及其他细胞过程^［6］。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）是DNA复制和修复的必要因素^［7］，其指标常用于评估肺动脉平滑肌的增殖。故而推测ERK1/2信号通路可能促进PPHN中肺动脉平滑肌的增殖以及PCNA蛋白表达，进而引起PPHN的发生、发展。本实验通过低氧诱导新生小鼠制备PPHN模型，使用ERK1/2通路抑制剂U0126抑制ERK1/2信号通路的磷酸化，并检测ERK1/2、p‑ERK1/2及PCNA的表达情况来检测肺动脉平滑肌的增殖情况，进而观察ERK1/2信号通路在PPHN中的作用，为寻找新的治疗靶点提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

选取体重在20~25 g的SPF级别C57BL/6小鼠（广东斯嘉景达生物科技有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2019‑0004）。本实验已通过石河子大学医学院第一附属医院实验动物伦理委员会批准（批件号：A2023‑043‑01）。按雌鼠与雄鼠1∶1比例合笼，雌鼠产仔后，随机选取80只健康仔鼠作为实验用鼠。

1.1.2 实验试剂

ERK1/2通路抑制剂U0126（APE×BIO公司，美国）；U0126溶剂二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）（SIGMA）；Anti‑ERK1/2 Antibody（博士德公司，武汉）、Anti‑PERK/EIF2AK3 Antibody（博士德公司，武汉）、Anti‑PCNA Antibody（博士德公司，武汉）；山羊抗小鼠二抗（中杉金桥，北京）；山羊抗兔IgG H&L（HRP）（Abcam）；Anti‑beta Actin mouse mAb（塞维尔公司，武汉）；Anti‑beta Tubulin antibody（Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及模型建立

将80只新生C57BL/6小鼠随机平均分成4组：对照组、PPHN组、PPHN+DMSO（DMSO组）和PPHN+U0126组（抑制剂组）。所有组别母鼠正常饮食，小鼠由母鼠母乳喂养。对照组小鼠置于正常空气中，每日腹腔注射等量生理盐水；模型小鼠采用常压低氧法制备^［8］，将其余3组小鼠置于低氧箱内，箱内氧浓度维持在12%左右，温度控制在25~28 ℃，湿度维持在50%~70%，PPHN组每日腹腔注射20 mg/kg生理盐水，DMSO组分别每天腹腔注射20 mg/kg DMSO溶液，抑制剂组每天腹腔注射20 mg/kg U0126，造模共14 d。

1.2.2 经肋间隙右心室穿刺法测量右心室收缩压

造模完成后，各组小鼠提前禁食水3~4 h，应用吸入麻醉方法，将被七氟烷浸湿的消毒脱脂棉球放入麻醉罐，将小鼠头部置入麻醉罐中麻醉并固定小鼠，定位穿刺点后使用细针穿刺，连接BL‑420生物功能实验系统，测量右心室收缩压力，曲线稳定后记录压力曲线。

1.2.3 小鼠心脏和肺组织提取

测压后，持续麻醉小鼠，沿胸骨左缘剪开胸腔，行气管切开插管，将预冷的PBS灌洗心肺组织后取出，其中一侧肺组织置于福尔马林中固定，使用石蜡包埋备用；另一侧肺组织及心脏用PBS洗净去除水分后放入组织冻存管，于-80 ℃超低温冰箱储存备用。

1.2.4 H&E染色观察心脏及肺组织形态

将包埋好的石蜡块切片，脱蜡处理后通过苏木精‑伊红（H&E）染色。每组随机选取8张心脏切片及肺组织切片，每张切片选取6个视野。计算平均肺泡内衬间隔（mean linear intercept， MLI）和径向肺泡计数（radial alveolar count， RAC）评估肺泡发育情况。测量肺动脉壁厚度（WT）及血管外径，计算肺血管璧面积与管总面积比值百分比（WA%）＝肺血管壁面积/总面积×100%，计算肺动脉壁厚度与血管外径比值百分比（WT%）=（血管壁厚度×2）/血管外径×100%，进而评估肺动脉增厚程度。为评估肺动脉高压及心室壁肥厚程度，测量右心室及左心室的室壁厚度，计算右心室与左心室的室壁厚度比值（RV/LV）。

1.2.5 免疫组化法检测肺血管中PCNA蛋白表达水平

将肺组织石蜡切片常规脱蜡水化，用枸橼酸抗原加热修复，冷却至室温后用缓冲液冲洗，添加鼠抗小鼠PCNA单克隆抗体一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜。次日加入山羊抗小鼠IgG二抗（1∶500），DAB显色，封片后置于显微镜下观察。

1.2.6 Western blot法检测肺组织中PCNA、ERK1/2及p‑ERK1/2蛋白表达水平

取-80 ℃中存放的肺组织，加入4 ℃裂解液于冰上充分研磨，低温离心15 min后取上清液，BCA法测定蛋白浓度，配平后变性处理制成蛋白样品冷却备用。将电泳液倒入电泳槽内，各组取20 μg蛋白样品加入凝胶（10%分离胶）梳孔中开始电泳，电泳后转移至PVDF膜，室温下封闭，分别加入山羊抗兔ERK1/2一抗（1∶1 000），山羊抗兔p‑ERK1/2一抗（1∶1 000），β‑tubulin一抗（1∶1 000），β‑actin一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。TBST冲洗后，去除多余的TBST后加入相应的二抗（1∶1 000）室温孵育2 h，TBST冲洗后显色液，曝光显影，拍摄条带用于后续分析。

1.3 统计学处理

使用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，计量资料用\overline{x}\pm s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD‑t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠RVSP变化

各组右心室压力曲线结果显示（图1），PPHN组小鼠RVSP（9.27±0.20）较对照组（4.11±0.21）相比明显增高（t=30.64，P<0.001），而DMSO组小鼠RVSP（8.97±0.19）较PPHN组相比无明显差异，提示DMSO作为U0126的溶剂不影响小鼠的右心室收缩压（t=1.817，P>0.05），抑制剂组小鼠RVSP（5.26±0.34）较PPHN组明显降低（t=17.66，P<0.001），该结果表明，使用ERK1/2抑制剂U0126可缓解在低氧条件下引发的PPHN小鼠右心室收缩压的增高。

2.2 肺组织形态学观察

肺组织切片H&E染色结果显示（图2），对照组小鼠肺泡发育正常，PPHN组小鼠肺泡较对照组相比变大，肺泡隔断裂且数量减少，计算MLI增宽（分别为133.20±1.86，198.30±2.92，t=46.06，P<0.001），RAC减少（分别为4.85±0.49，2.70±0.47，t=16.38，P<0.001），表明缺氧可抑制小鼠肺泡的发育；DMSO组小鼠MLI（199.50±7.08，t=0.37）及RAC（2.80±0.52，t=0.70）较PPHN组无明显差异（P>0.05），表明DMSO对肺泡发育无明显影响；而抑制剂组MLI（152.5±1.56）较PPHN组减小（t=33.89，P<0.001），抑制剂组RAC（4.20±0.52）较PPHN组增加（t=9.74，P<0.001），本结果表明抑制剂U0126对低氧导致的肺泡损伤有一定改善作用。

肺动脉H&E染色结果显示（图3），对照组小鼠肺动脉管壁较薄，而PPHN组较对照组WA%值（分别为39.05±1.19，82.65±2.06，t=44.88）及WT%值（分别为22.10±1.37，53.93±2.08，t=31.30）均增加（P<0.001），提示PPHN组小鼠肺动脉管壁有所增厚；DMSO组WA%值（82.77±1.018，t=0.13）及WT%值（53.42±1.94，t=0.44）较PPHN组无明显差异（P>0.05）；抑制剂组WA%值（42.82±1.60，t=37.45）及WT%值（28.33±1.51，t=24.35）相比PPHN组显著降低（P<0.001），肺血管厚度较PPHN组减少，表明PPHN组及DMSO组的肺血管发生增厚，而抑制剂U0126可明显改善PPHN小鼠肺血管壁的增厚。PPHN组小鼠心脏组织RV/LV比值（46.35±4.13）较对照组（33.75±3.03）明显增高（t=4.26，P<0.001），表明PPHN小鼠右心室室壁增厚，而抑制剂组（36.38±2.99）较PPHN组右心室肥厚程度有所减轻（t=3.39，P<0.001）（图3G）。

2.3 肺动脉PCNA表达情况

免疫组化结果显示（图4），PPHN组相对吸光度（4.827±0.19）较对照组（1.00±0.00）相比显著增加（t=34.87，P<0.001），表明PPHN小鼠肺动脉平滑肌PCNA蛋白表达增高；DMSO组相对吸光度（4.727±0.12）较PPHN组无明显差异（t=0.76，P>0.05），提示DMSO对肺动脉PCNA蛋白表达无影响；而抑制剂组相对吸光度（1.993±0.26）较PPHN组表达显著下降（t=15.37，P<0.001），说明应用U0126可降低低氧导致的肺动脉平滑肌PCNA蛋白表达，可抑制肺动脉管平滑肌增殖。

Western blot结果显示（图5），与对照组（0.12±0.03）相比，PPHN组PCNA蛋白表达（0.81±0.03）明显增加（t=31.79，P<0.001），而DMSO组（0.75±0.05）与PPHN组无明显差异（t=2.06，P>0.05）；抑制剂组（0.27±0.03）相较于PPHN组PCNA蛋白表达明显降低（t=25.14，P<0.001），表明U0126可减低PPHN引起的肺动脉的增殖。

2.4 肺组织中ERK1/2、p‑ERK1/2蛋白表达

Western blot结果显示（图6），小鼠肺组织ERK1/2蛋白表达在4组小鼠（分别为1.02±0.07，1.02±0.93，1.03±0.07，1.04±0.46）中无明显差异（F=0.06，P>0.05）。而在PPHN组p‑ERK1/2蛋白表达（1.16±0.06）较对照组（0.20±0.04）相比明显上调（t=23.35，P<0.001），DMSO组p‑ERK1/2蛋白表达（1.10±0.05）较PPHN组相比无明显差异（t=1.369，P>0.05），而抑制剂组p‑ERK1/2蛋白表达（0.27±0.05）较PPHN组及DMSO组明显降低（t=19.81，P<0.001）。表明低氧条件下，ERK1/2信号通路通过磷酸化过程参与PPHN的形成。

3 讨论

PPHN是新生儿重症监护室中常见的急危重症疾病之一，其主要临床特点为难治性低氧血症。在缺氧条件下，血管活性物质平衡失调，调节肺动脉平滑肌细胞增生，长期的肺动脉压力增加导致肺血管重塑，进而引起PPHN^［9］。本实验通过模拟PPHN的发病过程，于低氧条件下制备PPHN小鼠模型，探究ERK1/2信号通路在PPHN肺血管重塑中的作用。通过观察右心室收缩压、肺动脉管壁厚度及右心室室壁增厚程度检测造模是否成功。在本研究中，PPHN组右心室收缩压增高，肺动脉管壁明显增厚，右心室与左心室比值增高，较对照组相比均具有统计学意义，提示造模成功。

ERK1/2信号通路广泛分布于各组织中，是将分子信号从细胞表面受体传导至细胞核的关键，在各种细胞过程中发挥关键作用^［10］，包括细胞周期进展、存活和分化。ERK有两种异构体，分别为ERK1和ERK2，因其具有80%以上的同源性，所以统称为ERK1/2，被激活后ERK1/2发生特异性磷酸化形成p‑ERK1/2，p‑ERK1/2从细胞质被转位到细胞核内，进而介导其下游因子的转录活化，触发一系列功能反应，发挥其调节细胞生长、分化、增殖、凋亡等的生物学效应^{［11，12］}。在新生儿相关疾病的研究中，有实验表明表皮生长因子可激活ERK1/2通路使其磷酸化，加速细胞周期从G1期进入S期促进成纤维细胞增殖，进而导致支气管肺发育不良，而重度支气管肺发育不良的患儿出现换气功能障碍，引起低氧持续存在，促进肺血管重构，肺血管阻力及压力不断升高，最终出现肺动脉高压^［13］。目前只有少量研究报道表明ERK1/2可促进大鼠肺动脉高压细胞模型中肺动脉平滑肌细胞的增殖^{［14，15］}，而ERK1/2在新生儿肺动脉高压小鼠模型中的作用尚不明确，本研究采用低氧诱导PPHN小鼠模型，使用ERK1/2信号通路抑制剂U0126抑制其磷酸化，并排除U0126溶剂DMSO的干扰因素，证明低氧可成功诱导新生小鼠右心室收缩压增高，而抑制剂U0126可通过抑制ERK1/2信号通路明显改善PPHN引起的右心室压力增高。在微观结构上，抑制剂U0126可明显改善PPHN中肺泡损伤、肺血管平滑肌增厚以及右心室肥厚，说明抑制ERK1/2的磷酸化可以促进损伤肺泡的修复，降低肺动脉壁的厚度及平滑肌的增殖能力，进而降低肺动脉高压的病变程度。蛋白层面表明，PPHN模型小鼠肺组织中PCNA蛋白表达较对照组明显增高，说明PPHN组肺动脉平滑肌细胞的增殖能力增高，而抑制剂组表达明显降低，说明应用抑制剂U0126后肺动脉平滑肌细胞的增殖能力降低。在4组小鼠模型中，肺组织中ERK1/2蛋白表达无明显差异，但p‑ERK1/2蛋白在PPHN组表达较对照组明显增加，而抑制剂组与PPHN组相比p‑ERK1/2蛋白表达明显减低。说明抑制剂U0126抑制ERK1/2是通过抑制其磷酸化进而降低肺动脉平滑肌的增殖，引起肺动脉高压的形成^［16］。有研究提出绿茶提取物对动脉粥样硬化的患者具有潜在的益处，实验发现绿茶中提取的主要活性成分ECG可调节细胞周期，并降低PCNA及p‑ERK1/2的表达，改善心血管平滑肌的增殖^［17］，与本实验结果相似。此外，有研究者通过血栓栓塞大鼠肺动脉24 h导致肺动脉阻力和肺动脉压升高，构建急性肺栓塞逐渐引起肺动脉高压的大鼠模型，在下调p‑ERK1/2的表达后显著减轻大鼠肺动脉高压^［18］，进一步支持本研究中抑制ERK1/2信号通路可改善肺动脉高压的结论。因此，开发针对ERK1/2信号通路相关分子的靶向药物是治疗PPHN的有效路径。

综上所述，本研究认为，通过抑制ERK1/2通路磷酸化，降低ERK1/2通路相关分子活性，可明显改善PPHN的发生、发展。ERK1/2信号通路的激活与持续性肺动脉高压的发病密切相关。因此，进一步研究以明确对ERK1/2信号通路在PPHN发生发展中的具体调控机制，可能成为治疗PPHN的新方向。

作者贡献度说明：

刘畅：提出研究思路、进行实验以及撰写初稿；朱亚平：文献查阅与数据整理；谷强：提供实验材料及审阅修订文稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82360315)

兵财行2023人才发展基金‑兵团重点实验室‑第一附属医院兵团儿童疾病临床医学研究中心(CZ001209)