基于NEK7/NLRP3/ASC信号通路探讨平喘宁方抑制细胞焦亡调控哮喘大鼠气道炎症的机制

Mechanism of Pingchuanning Formula inhibiting pyroptosis to regulate airway inflammation in asthmatic rats based on the NEK7/NLRP3/ASC signaling pathway

摘要

目的 从细胞焦亡角度探讨由经典名方组合而成的平喘宁方、MCC950抑制剂对哮喘大鼠气道炎症的影响及作用机制。 方法 70只SD大鼠随机分为7组：空白组、模型组、平喘宁组、MCC950抑制剂组、平喘宁+MCC950抑制剂组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组。10％鸡卵清蛋白（OVA）经腹腔及四肢皮下注射致敏，用2％ OVA雾化联合寒冷空气（2~4 ℃）刺激，激发哮喘大鼠模型。平喘宁（7.289 g/kg）、MCC950（10 mg/kg）、平喘宁（7.289 g/kg）+MCC950（10 mg/kg）、地塞米松（0.405 mg/kg）、桂龙咳喘宁（0.405 g/kg）灌胃及雾化，持续干预3周。末次激发后，对大鼠肺组织进行H&E、PAS染色，观察大鼠气道炎症和细胞增殖情况。采用ELISA检测血清和BALF中IL‑1β、IL‑18、IL‑6的含量，RT‑PCR检测NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的mRNA表达水平，Western blot检测NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的蛋白表达水平。 结果 与空白组比较，模型组大鼠饮食减少、体重下降、情绪烦躁、呼吸喘促，气道炎性细胞浸润、杯状细胞增生，血清和BALF中IL‑1β、IL‑18、IL‑6炎症因子明显增多；NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的mRNA和蛋白表达水平升高。与模型组比，平喘宁、MCC950抑制剂、平喘宁+MCC950抑制剂组大鼠饮食逐渐改善、喘促缓解，气道炎性细胞浸润明显减少，血清和BALF中IL‑1β、IL‑18、IL‑6炎症因子降低（P<0.001），同时抑制了NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的mRNA和蛋白的表达（P<0.001）。 结论 平喘宁和MCC950抑制剂可以明显改善OVA联合寒冷刺激诱发的哮喘大鼠气道炎症，且与NEK7/NLRP3/ASC信号通路和细胞焦亡相关，其中平喘宁联合MCC950抑制剂的疗效更加明显，提示联合治疗的效果要优于单一复方或西药。

Abstract

Objective To explore the effects and mechanism of action of the classical formula of Pingchuanning （PCN） and MCC950 inhibitor on airway inflammation in asthmatic rats from the perspective of pyroptosis. Methods A total of 70 SD rats were randomly divided into 7 groups： the normal group， the model group， the PCN group， the MCC950 group， the PCN+MCC950 inhibitor group， the dexamethasone group， and the Guilong Kechuanning group. A concentration of 10% ovalbumin （OVA） was injected subcutaneously via the abdominal cavity and the limbs to induce allergy， and the rat model of asthma was stimulated by the combination of 2% OVA nebulisation and cold air （2‒4 ℃）. The intervention was continued for 3 weeks with gavage and aerosolization of PCN （7.289 g/kg）， MCC950 （10 mg/kg）， PCN （7.289 g/kg）+MCC950 （10 mg/kg）， dexamethasone （0.405 mg/kg）， and Guilong Kechuanning （0.405 g/kg）. After the final stimulation， airway inflammation was observed by H&E and PAS staining in lung tissue of the rats. The levels of IL‑1β， IL‑18， and IL‑6 in serum and BALF were detected by ELISA， the mRNA expression levels of NEK7， NLRP3， ASC， and Caspase‑1 were detected by RT‑PCR， and the protein expression levels of NEK7， NLRP3， ASC， and Caspase‑1 were detected by Western blot. Results Compared to the normal group， rats in the model group had reduced diet， weight loss， emotional irritability， shortness of breath， airway inflammatory cell infiltration， goblet cell proliferation， and there was a significant increase in IL‑1β， IL‑18， and IL‑6 inflammatory factors in the serum and BALF； mRNA and protein expression levels of NEK7， NLRP3， ASC， and Caspase‑1 were elevated. Compared to the model group， rats in the PCN， MCC950， and PCN+MCC950 groups showed a gradual improvement in diet， alleviation of asthma， significant reduction in airway inflammatory cell infiltration， and reduction of IL‑1β， IL‑18， and IL‑6 inflammatory factors in serum and BALF （P<0.001）， as well as suppression of NEK7， NLRP3， ASC， and Caspase‑1 mRNA and protein expression （P<0.001）. Conclusion PCN and MCC950 inhibitor can significantly improve airway inflammation induced by OVA combined with cold stimulation in asthmatic rats and correlate with the NEK7/NLRP3/ASC signaling pathway and pyroptosis， in which the efficacy of PCN combined with MCC950 is more pronounced， suggesting that the combined treatment is more effective than a single compound or Western medicine.

Graphical abstract

关键词

平喘宁 / MCC950抑制剂 / 哮喘 / NEK7 / NLRP3 / 细胞焦亡

Key words

Pingchuanning / MCC950 inhibitor / Asthma / NEK7 / NLRP3 / Pyroptosis

哮喘为常见的呼吸系统疾病，以气道高反应性、气道重塑、气道狭窄、气道黏液高分泌为特征的一种肺部炎症性疾病。临床多见反复发作的喘息、气急、咳嗽、胸闷等症状^［1］。其病程缠绵难愈，而寒冷刺激是诱导哮喘发作和加重的重要因素，严重影响人们的身体健康和生活质量。

前期研究发现，平喘宁能够有效缓解和改善哮喘大鼠的气道炎症、气道高反应性和气道重塑，能抑制促炎细胞因子的释放，调节免疫原因子，有效防止肺部炎症的发生，同时平喘宁亦能降低气道黏液分泌，减缓肺组织损伤，发挥治疗哮喘的作用^［2］。气道炎症是哮喘发作的核心机制之一，寒冷空气刺激是加剧哮喘的重要环境因素，可促进炎症细胞刺激炎症因子的释放，体外过敏原携带的病原体相关分子模式或机体内部致敏小分子携带的危险相关分子模式作为初始刺激后，可启动细胞焦亡的经典途径。哮喘大鼠肺组织伴有炎症反应，NOD样受体蛋白3（NLRP3）是触发哮喘炎症的关键因素之一，NLRP3通过衔接蛋白（ASC）激活半胱氨酸天冬蛋白酶（Caspase‑1）启动细胞焦亡，促进炎症因子白介素1β（IL‑1β）和白介素18（IL‑18）的释放，达到哮喘炎症反应^［3，4］，NIMA相关激酶7（NEK7）在NLRP3炎症小体激活过程中扮演重要角色^［5］。为深入探讨哮喘与NLRP3通道调控的相关性以及平喘宁和抑制剂在其治疗中发挥的作用，本研究通过鸡卵清蛋白（OVA）腹腔注射及寒冷刺激导致哮喘的造模方法，模拟哮喘的表现，以哮喘模型大鼠为研究对象，以NEK7/NLRP3/ASC信号通路抑制细胞焦亡调控气道炎症为研究方向，进一步探究平喘宁方及其抑制剂能够有效缓解哮喘的可能作用机制，见图1。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD大鼠70只，初始体质量100~120 g，购于河南斯克贝斯生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（豫）2020‑0005。动物饲养于安徽中医药大学护理学院老年实验中心，室内温度20~25 ℃，相对湿度45%~75%，实验前适应性饲养7 d。实验动物使用单位为安徽中医药大学，由安徽中医药大学动物伦理委员会审批通过（伦理编号：AHUCM‑rats‑2024044）。

1.2 药物

平喘宁由经方三子养亲汤、射干麻黄汤、玉屏风散组合而成。平喘宁组方由麻黄9 g、杏仁9 g、苏子6 g、细辛3 g、陈皮6 g、半夏9 g、防风6 g、地龙6 g、浙贝母9 g、太子参9 g、黄芪9 g组成，为中药饮片，均购置于安徽中医药大学国医堂，中药复方汤剂按照《方剂学》^［6］换算。计算公式：Db=Da×Rab，9.8生药量/kg大鼠体质量，药材浸泡后煎煮3次混合浓缩为0.98 g/mL；NLRP3抑制剂MCC950 （美国Selleck Chemicals，货号：S8930）；地塞米松（浙江仙琚制药股份有限公司），0.75 mg每片；桂龙咳喘宁（桂龙药业有限公司），每粒0.5 g。

1.3 试剂与器材

OVA（美国Sigma，批号：A5235）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20240525）；Trizol（Life technogies，批号：99088701）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（novoprotein，批号：05285501）；RIPA细胞裂解液（Beyotime，批号：09271919023）；SDS、Glycine、PAGE胶促凝剂、Tris、Tween‑20（Beyotime，批号：723T033、516V061、1020F024、809C0730、1121S017）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（Zsbio，批号：140193、202700514）；大鼠IL‑1β、IL‑6、IL‑18酶联免疫吸附（ELSIA）试剂盒（武汉基因美科技有限公司，货号：JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0650Ra）；NLRP3（英国Abcam公司，批号：GR3369573‑3），Caspase‑1（CST公司，批号：5），ASC（Bioss公司，批号：AF03162934）。

酶标仪（雷杜公司）；离心机（安徽嘉文公司）；漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司）；荧光定量PCR仪（Thermo Scientific）；微孔板迷你离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；电泳仪、电泳槽、转膜仪（Tanon上海天能科技有限公司）；高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；自动曝光仪（上海培清科技有限公司）。

1.4 动物分组及哮喘模型建立

依据课题组前期实验方法建立哮喘模型：70只大鼠依据随机分类法，共分为7组，分别为：空白组、模型组、平喘宁组、MCC950抑制剂组、平喘宁+MCC950抑制剂组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组，每组10只。除空白组外，其余6组大鼠均使用OVA致敏和激发，分别于第1、8天对大鼠的腹腔及腹股沟两侧皮下注射10% OVA进行致敏，再于第15、28天，将大鼠放置于0~2 ℃可调节的寒冷箱中，以2% OVA溶液超声雾化，每天1次，每次30 min。空白组参照上述方法，用生理盐水代替OVA腹腔注射及雾化。第29~49天，所有大鼠继续寒冷刺激与雾化，并在雾化结束0.5 h后灌胃（10 mL/kg），连续灌胃21 d，每天1次。空白组和模型组根据大鼠体质量灌生理盐水；平喘宁组按照7.289 g/kg剂量灌胃；MCC950抑制剂组按照10 mg/kg灌胃；平喘宁+MCC950抑制剂组先予平喘宁7.289 g/kg剂量灌胃，后予MCC950抑制剂组按照10 mg/kg灌胃；地塞米松组以0.405 mg/kg灌胃；桂龙咳喘宁组以0.405 g/kg灌胃。第52天处死并进行取材。

1.5 取材与制备标本

大鼠禁食24 h后取材，末次进行OVA激发，麻醉后取腹主动脉血2 mL，离心取血清，-20 ℃保存，用于ELISA测定；脱椎处死后，每组取6只暴露胸腔及器官，用生理盐水（0.5 mL×3次）反复灌洗肺泡，抽取肺泡灌洗液1.0~1.5 mL，离心后留取肺泡上清液；剩余大鼠摘取左肺，冲洗后，固定于多聚甲醛溶液中，用于H&E、PAS染色，右肺置于液氮中，保存转运至-80 ℃冰箱，用于RT‑PCR及蛋白测定。

1.6 指标检测

1.6.1 H&E染色法观察肺组织病理学变化

摘取左肺叶组织，以10%甲醛固定24 h后经脱水、包埋，制备厚3~4 μm的切片，再以二甲苯、乙醇脱蜡及乙醇水化，按操作常规行H&E染色，再以苯酚‑二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ至透明，封片后光镜观察气道周围炎症细胞浸润情况。

1.6.2 PAS染色法观察肺组织病理学变化

肺组织切片，脱蜡氧化染色后以流水洗净甩干，Schiff染液滴入，37 ℃培养，苏木素复染2~5 min，分化10 s水洗至返蓝，水洗1 min，再按照上述步骤脱水透明，光镜观察肺组织杯状细胞增生及黏液等情况。

1.6.3 ELISA法检测血清和肺泡灌洗液（BALF）中IL‑1β、IL‑18、IL‑6的浓度

依据说明书，将IL‑1β、IL‑18、IL‑6试剂及血清和肺泡灌洗液置于室温，标注好不同上样顺序。标准孔、样品孔加入标准液、样品液，加酶标试剂50 μL，封好以37 ℃孵育30 min，静置30 s摇匀，避光37 ℃孵育10 min，加停止液，以酶标仪（450 nm）读OD值，绘制标准曲线。

1.6.4 RT‑PCR法检测NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA表达水平

称取肺组织50 mg，加入Trizol （1 mL）裂解，提取肺组织总RNA，使用TaKaRa 反转录试剂盒将RNA转录为cDNA，反应条件为37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，cDNA 于-80 ℃保存备用。取cDNA 1 μL加入上下游引物各1 μL进行荧光定量PCR反应，两步法程序反应，反应体系10 μL，反应条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火延伸60 s，连续40次循环。反应结束后获取扩增曲线及溶解曲线，以β‑actin为内参，每个样本重复3次检测，使用 2^-ΔΔCt法计算NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的相对表达。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，见表1。

1.6.5 Western blot检测肺组织NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的蛋白表达

收取组织样本（约0.1 g左右），加入RIPA细胞裂解液600 µL（内含0.6 mmol/L PMSF）进行裂解，12 000 ×g离心15 min。收集上清液，即含有组织总蛋白。在收集的蛋白样品中按照1∶4加入5× SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热15 min，以充分变性蛋白。待样品冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS‑PAGE胶加样孔内即可。每孔加5~10 µL。恒压电泳，将蛋白转移至PVDF膜，加入Western blot封闭液摇床2 h，再用PBST洗涤。之后加入NEK7（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Caspase‑1（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000），4 ℃摇床孵育过夜。次日PBST洗涤后加入稀释的二抗辣根过氧化物酶（1∶20 000），温室孵育1.2 h，PBST洗涤后使用ECL发光试剂盒检测蛋白，用ImageJ软件进行条带分析。

1.7 统计学处理

采用SPSS 26.00对实验结果进行统计学分析，以\overline{x}\pm s描述计量资料，多组间比较用单因素方差分析，方差齐者用LSD检验，方差不齐用Tamhane's T2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠一般情况的影响

造模前，各组大鼠无差异，精神、进食、活动等均正常。致敏期间，除空白组，其他大鼠进食及饮水量均减少，体重减轻，伴随喘息、呼吸急促、烦躁、毛发色泽晦暗脏乱等。经药物干预后，各治疗组的症状与模型组相比有所改善和缓解。

2.2 哮喘大鼠肺组织病理学变化

H&E染色组：与空白组相比，哮喘模型组大鼠管腔狭窄，管壁、间隔皆增厚，炎性细胞增多、浸润改变；平喘宁组、MCC950抑制剂组、平喘宁+MCC950抑制剂组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组可见管壁与间隔增厚状态减轻，管腔狭窄改变，炎性细胞数量有所减少，黏膜水肿状态好转等。说明平喘宁、MCC950抑制剂、平喘宁+MCC950抑制剂、地塞米松、桂龙咳喘宁能够有效改善哮喘大鼠病理状态，同时平喘宁组较MCC950抑制剂组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组佳，而平喘宁+MCC950抑制剂组最佳，见图2A~G。

PAS染色组：与空白组相比，哮喘模型组可见明显的杯状细胞和黏液；平喘宁组、MCC950抑制剂组、平喘宁组+MCC950抑制剂组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组及对照组支气管和气道黏液减少，杯状细胞增生样改变明显缓解。说明平喘宁、MCC950抑制剂、平喘宁‑MCC950抑制剂、地塞米松、桂龙咳喘宁能有效减少哮喘大鼠支气管和气道黏液以及改善杯状细胞增生，平喘宁组和MCC950抑制剂组效果较佳。平喘宁+MCC950抑制剂组效果最佳，见图3A~G。

2.3 大鼠血清中IL‑1β、IL‑18、IL‑6含量的变化

与空白组相比，模型组IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显升高（P<0.001）；与模型组相比，给药组大鼠IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显降低（P<0.001）；与平喘宁组相比，MCC950抑制剂组IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显升高（P<0.05），平喘宁+MCC950抑制剂组IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显降低（P<0.001）；与地塞米松组相比，平喘宁组IL‑18、IL‑6明显降低（P<0.005）；与桂龙咳喘宁组相比，平喘宁组IL‑18明显降低（P<0.05），见表2。

2.4 大鼠BALF中IL‑1β、IL‑18、IL‑6含量的变化

与空白组相比，模型组IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显升高（P<0.001）；与模型组相比，给药组IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显降低（P<0.001）；与平喘宁组相比，MCC950组IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显升高（P<0.001），平喘宁+MCC950组明显降低（P<0.001），其余各组差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

2.5 大鼠肺组织NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的表达

与空白组相比，模型组大鼠肺组织NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的表达水平明显升高（P<0.001）；与模型组相比较，给药组大鼠肺组织NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的表达明显降低（P<0.001）；与平喘宁组相比，MCC950抑制剂组各指标差异无统计学意义（P>0.05），平喘宁+MCC950组、地塞米松组、桂龙咳喘宁组的NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的表达明显降低（P<0.001），见表4。

2.6 大鼠肺组织NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 蛋白的表达影响

与空白组相比，模型组NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 蛋白表达明显升高（P<0.001）；与模型组相比，平喘宁组NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的蛋白表达水平明显降低（P<0.01），MCC950组NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的蛋白表达水平明显降低（P<0.01），而PCN+MCC950组则明显降低NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的蛋白表达水平（P<0.001）；与平喘宁组相比，MCC950组抑制剂组差异无统计学意义（P>0.05），平喘宁+MCC950抑制剂组中的NLRP3、ASC、Caspase‑1、NEK7的蛋白表达水平明显降低（P<0.01），见表5、图4。

3 讨论

哮喘迁延难愈，由各种发病机制刺激导致肺卫不固，遇过敏原或寒冷空气刺激则喘促不息、痰涎壅盛，然土为金之母，肺金病久则至脾，导致脾土亏虚；金为土之子，脾土亏虚，肺金无水谷之精而润之，则肺卫亏虚，遇寒则哮喘易发作。平喘宁由《韩式医通》的祛痰名方三子养亲汤和《金匮要略》治哮喘之经典名方射干麻黄汤，还有出自《丹溪心法》的益卫固表名方玉屏风散组成，药物组成分别为：麻黄、杏仁、苏子、细辛、陈皮、半夏、防风、地龙、浙贝母、太子参、黄芪，方中麻黄、细辛、地龙、苏子祛风散寒、宣肺温阳、降气平喘，杏仁、陈皮、半夏、浙贝母燥湿化痰、止咳平喘，防风、黄芪、太子参益卫固表、祛风止痉，诸药合用，共凑祛风止痉、宣肺平喘、降气化痰、益卫固表之效以治哮喘。本研究以OVA诱导，联合冷刺激构建哮喘大鼠模型，大鼠肺组织炎症细胞出现明显浸润，黏液分泌过多，支气管管腔狭窄，并出现呼吸喘促伴有哮鸣音，毛发脏乱无光泽，烦躁等表现，提示哮喘模型造模成功。经平喘宁与MCC950抑制剂干预后均不同程度改善哮喘大鼠肺组织的炎症细胞浸润、支气管管壁厚度、黏液分泌，其中以平喘宁+MCC950抑制剂组疗效最佳，提示联合治疗的效果强于单一复方或西药治疗。另外MCC950抑制剂的使用存在一定毒性，因此在联合用药的同时，中药的使用是否可以减缓MCC950抑制剂的毒性则有待进一步考证^［7］。

地塞米松为糖皮质激素药，是目前治疗哮喘的的主要药物之一，但是不良反应较多，为患者的治疗产生较多负面影响；桂龙咳喘宁为中成药，有止咳化痰，降气平喘的功效，可用于治疗咳嗽气喘、痰多，其治疗哮喘的临床效果明显，亦可作为平喘宁方的中药阳性对照组进行比较。MCC950为NLRP3炎症小体特异性抑制剂，根据Gordon等^［8］研究可知，MCC950抑制剂具有高度口服活性，可通过灌服的方式进行治疗，其主要机制为通过抑制NLRP3炎症小体的激活以及炎症因子的释放来改善炎症反应。有研究发现，在脂多糖诱导的小鼠肺部炎症中，MCC950可通过抑制炎症细胞浸润和减少肺部促炎介质释放来有效缓解脂多糖诱导的肺部炎症^［9］。Zhang等^［10］研究发现，MCC950还可抑制OVA诱导的过敏性鼻炎，通过降低NLRP3、Caspase‑1、ASC、IL‑1β的表达，从而减轻过敏和炎症反应；而周凛梅等^［11］发现，MCC950可干预NLRP3炎症小体来缓解哮喘小鼠气道炎症。本研究中，在OVA诱导的大鼠哮喘模型中，与模型组相比，MCC950抑制剂组和平喘宁+MCC950抑制剂组大鼠肺组织蛋白的表达和mRNA的表达量明显降低，血清和肺泡灌洗液中的IL‑1β、IL‑18、IL‑6等炎症因子浓度呈现不同程度的降低，病理标本显示，肺组织支气管周围的炎症细胞浸润、气道黏液分泌也在不同程度的减轻，其中平喘宁+MCC950抑制剂组则更优。

IL‑1β、IL‑18的分泌与NLRP3炎症小体的激活关系密切，IL‑6为IL‑1β的下游靶标，有研究表明IL‑6可以治疗IL‑1β介导的炎症治疗靶标，根据《2024年重度哮喘诊断与处理中国专家共识》^［12］，可知IL‑6与肺功能降低和哮喘严重程度相关；另外IL‑6作为体内重要的促炎细胞因子之一，由多种炎性细胞如T细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞以及内皮和上皮细胞产生，可以在IL‑1β的刺激下由气道肌肉细胞释放产生，因此IL‑6是炎症的重要生物标志物^［13］；另外IL‑6还可影响适应性免疫应答的类型，调节CD4^＋ T细胞，降低Th1细胞的分化，同时IL‑6还能抑制Treg细胞并推进Th17分化，从而诱导哮喘^［14］。IL‑1β由IL‑1分泌所得，不仅能促进嗜酸性粒细胞和中性粒细胞聚集浸润，还能刺激巨噬细胞，促进嗜酸性粒细胞脱颗粒，能诱发哮喘；Morris等^［15］发现，与哮喘相关的EL呼吸道合胞病毒（EL‑RSV）感染中，IL‑1β可诱导加剧过敏反应，而EL‑RSV感染明显改变肺上皮细胞亚群，导致哮喘发作。IL‑18是IL‑1的家族成员，能诱导嗜碱性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞后产生Th2细胞因子，从而促进哮喘炎症反应；另Venkateshaiah等^［16］发现IL‑18转化的CD274嗜酸性粒细胞可诱导胶原蛋白沉积、杯状细胞增生，促进气道阻塞引发哮喘，因此IL‑18在过敏原诱导的哮喘发病机制中也十分有意义。在本实验中，与空白组相比，模型组的血清和肺泡灌洗液中IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显升高，而平喘宁组、MCC950组、平喘宁+MCC950组、阳性表达对照组中的IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显下降，肺泡灌洗液中平喘宁组优于MCC950组，而平喘宁+MCC950组优于平喘宁组和MCC950组。

细胞焦亡的经典途径是由NLRP3炎症小体引起，NLRP3炎症小体是由NLRP3受体蛋白、ASC凋亡相关斑点样蛋白、Caspase‑1效应蛋白组合而成，而NEK7是NLRP3炎症小体激活的必须因子之一，NEK7亦是NLRP3炎症小体的组成部分，其促进ASC的适配蛋白的聚集，进一步激活Caspase‑1，最终导致炎症因子的释放^［5］。Williams等^［17］研究发现，过度表达的NLRP3炎症小体的激活和IL‑1β的产生在哮喘的发病机制中起着重要作用，而哮喘患者的NLRP3、Caspase‑1的蛋白表达也会上调，与轻度哮喘患者相比，重度哮喘患者的痰液中NLRP3和IL‑1β的基因表达水平也较高。NEK7为脊椎动物中发现的NEK激酶之一，隶属于有丝分裂进程和DNA损伤反应的NIMA相关激酶家族，目前已被确定为NLRP3炎症小体的选择性上游调节剂，NEK7能有效激活NLRP3炎症小体是基于NEK7‑NLRP3之间的相互影响作用，因此，NEK7已被明确在NLRP3炎症小体的激活中起着重要作用^［5］。本研究中，哮喘模型组大鼠的NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1蛋白和NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA表达明显增强（P<0.001），可以有效说明在哮喘大鼠造模过程中，OVA诱导引发哮喘后会引起强烈的炎症反应，导致NEK7激活NLRP3炎症小体，使活化后的Caspase‑1进一步激活炎症因子的释放或发生细胞焦亡，从而产生炎症反应。因此目前通过靶向NEK7抑制细胞焦亡来缓解炎症反应被认为是具有治疗前景的^［18］。经过平喘宁干预后，哮喘模型大鼠中NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1蛋白和NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的表达明显降低（P<0.001），提示平喘宁能够有效抑制NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1的蛋白和mRNA的表达。

哮喘大鼠肺组织活化后的Caspase‑1剪切无活性的IL‑1β、IL‑18前体，转化成具有活性的IL‑1β、IL‑18，大量炎症因子的释放最终导致炎症反应，使哮喘加重。本研究发现，模型组大鼠IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显升高，说明哮喘大鼠体内炎症反应增加，经平喘宁干预后IL‑1β、IL‑18、IL‑6明显降低，提示平喘宁能有效抑制炎症反应，且与NEK7/NLRPS/ASC信号通路和细胞焦亡有关。MCC950为NLRP3的特异性抑制剂，能有效抑制NEK7‑NLRP3的信号通路^［19］。与平喘宁组相比，MCC950在降低NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1蛋白和NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的表达无明显差异，而平喘宁+MCC950组经干预后，NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 蛋白和NEK7、NLRP3、ASC、Caspase‑1 mRNA的表达明显降低，说明联合治疗更加有效改善哮喘大鼠的炎症反应。

综上所述，平喘宁能够有效通过NEK7/NLRP3/ASC信号通路抑制细胞焦亡，缓解哮喘大鼠肺组织病理损伤，减轻炎症反应，明显降低蛋白和mRNA表达，减少炎症因子的释放，改善哮喘气道炎症。NLRP3炎症小体是目前治疗哮喘的新靶点，而NEK7亦可以作为靶向抑制细胞焦亡缓解哮喘炎症，改善大鼠肺组织病理学变化。本研究不足之处是MCC950抑制剂具有一定毒性，为减轻毒副作用，在剂量的控制方面还有待研究，另外平喘宁联合MCC950的治疗明显，但在缓解MCC950毒性方面还需进一步研究。

作者贡献度说明：

刘家鑫：文章撰写，实验方案设计，数据整理与分析；方文凯：论文校正；方向明：提供实验课题、经费与论文写作指导；袁亚美：论文指导与修改、审校；叶卫东：提供思路、论文指导；李秋慧：图片、数据审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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