原位和淋巴结转移肝癌中巨噬细胞异质性与生存期分析

Analysis of macrophage heterogeneity and overall survival in primary and lymph node metastatic hepatocellular carcinoma

摘要

目的 通过生物信息学方法分析原位和淋巴结转移肝癌中巨噬细胞异质性标志基因及生存期分析。 方法 从美国国家生物技术信息中心GEO数据库下载肝癌相关单细胞测序数据，GSE编号为GSE149614，通过单细胞聚类、差异基因表达分析获得原位和淋巴结转移肝癌巨噬细胞异质性标志基因，使用在线分析网站STRING进行蛋白质互作网络分析，并对差异表达的Top基因进行GO聚类和GSEA分析，并在GEPIA网站进行生存期分析。 结果 共筛选出70个差异基因，其中50个差异基因显著下调（‑FC=2.26~7.93），20个差异基因显著上调（FC=1.52~2.99）。GO功能注释富集分析发现，原位肝癌巨噬细胞主要为蛋白质异常折叠，而淋巴结转移肝癌巨噬细胞主要为创伤愈合、胞内蛋白质合成、丙酮酸盐（酯）代谢过程。通过生存期分析发现，淋巴结转移肝癌巨噬细胞的5个的标志基因（ALOX5AP、CD109、MMP12、SLC16A10、SPINK1）中MMP12和SPINK1基因低表达时患者的生存期较长（P<0.05）。 结论 原位和淋巴结转移肝癌中巨噬细胞异质性基因与患者的生存期存在显著相关性。

Abstract

Objective To analyze macrophage heterogeneity marker genes in hepatocellular carcinoma （HCC） in situ and lymph node tissues and to analyze the overall survival （OS） by bioinformatics methods. Methods The single‑cell sequencing data related to HCC were downloaded from the GEO database of National Center for Biotechnology Information （GSE number： GSE149614）. Obtaining heterogeneity marker genes of macrophages in primary and lymph node metastatic liver cancer through single-cell clustering and differential gene expression analysis.The online analysis website STRING was used for protein‑protein interaction network analysis， and the differentially expressed Top genes were analyzed by GO clustering and GSEA analysis. The OS analysis was performed on GEPIA website. Results A total of 70 differentially expressed genes were screened out， of which 50 differentially expressed genes were significantly down‑regulated （‑FC=2.26‑7.93） and 20 differentially expressed genes were significantly up‑regulated （FC=1.52‑2.99）. GO functional annotation enrichment analysis showed that macrophages in situ were mainly involved in abnormal protein folding， while macrophages in lymph nodes were mainly involved in wound healing， intracellular protein synthesis， and pyruvate （ester） metabolism. The results of OS analysis showed that low expression of MMP12 and SPINK1 in 5 marker genes （ALOX5AP， CD109， MMP12， SLC16A10， SPINK1） of macrophages in metastatic lymphoid tissue was associated with a longer survival time （P<0.05）. Conclusion Macrophage heterogeneity genes in primary and lymph node metastatic HCC are significantly correlated with the OS of patients.

Graphical abstract

关键词

肝癌 / 巨噬细胞 / 信号通路 / 生物信息学

Key words

Hepatocellular carcinoma / Macrophage / Signaling pathway / Bioinformatics

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）通常发生在60~70岁人群中，且男性发病率高于女性。HCC的发生主要与乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、酒精滥用、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等相关^［1］。原发性肝癌对化疗和放疗不敏感，是全球第二大致死性癌症，其5年生存率仅为10%。多数患者确诊时已处于中晚期，失去根治性治疗机会^［2］。NAFLD，包括其更严重的表现NASH，在全球的患病率为20%~25%，是一个主要的公共卫生问题。从NASH进展为NASH相关HCC（每年约2%的病例）受到许多因素的影响，包括组织和免疫微环境、PNPLA3的生殖细胞系突变和微生物组^［3］。肝癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中HCC占所有肝癌病例的90%^［4］。手术切除是目前最主要且有效的肝癌根治性治疗方法，虽然精准的肝癌切除术后5年生存率高达70%以上，但其依然受到肿瘤高复发率的影响，严重影响了肝癌患者的长期生存和生活质量^［5］。

研究结果表明，肿瘤的发生、发展不是一个孤立事件，在肿瘤演进过程中，始终伴随着实质细胞与免疫微环境的相互作用^［6］。由于原发性肝癌和转移性肝癌在临床治疗策略及预后上存在显著差异，对其异质性的深入解析对于精准治疗具有重要意义。肿瘤微环境的细胞成分高度复杂，包括基质细胞、髓系细胞和恶性肿瘤细胞等，这些细胞在炎症反应、免疫逃逸及肿瘤进展中发挥不同功能^［7］。髓系细胞往往与免疫抑制相关，而淋巴细胞则能介导抗肿瘤免疫反应^［6］。

传统的转录组测序技术虽然成本较低，但其数据反映的是细胞群体分子水平的平均信息，容易掩盖不同细胞间的异质性，限制了对肿瘤微环境的精确解析。在此背景下，单细胞测序技术凭借其在单细胞分辨率上捕获转录组、基因组等多维信息的能力，成为研究肿瘤异质性的重要工具^［8，9］。本研究利用单细胞测序技术，对来自不同癌症阶段患者的原位和淋巴结转移肝癌组织、门静脉癌栓及正常肝脏组织进行了分析，绘制了肿瘤微环境的整体细胞图谱。重点解析了巨噬细胞的异质性，通过基因集分析揭示了原发和淋巴结转移组织中显著富集基因。此外，本研究结合转录组测序数据验证了这些基因的差异表达模式，进一步探讨其在肝癌发生、发展中的潜在机制。

本研究发现，在原位和淋巴结转移肝癌差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）中，部分与患者预后显著相关。这些基因可能通过调控免疫逃逸、炎症反应或肿瘤微环境重塑等机制，影响肝癌的进展及治疗响应。这些发现不仅为理解HCC的异质性提供了重要参考，也为开发新的生物标志物及靶向治疗策略提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据获取

本实验所用实验数据来源于GEO数据库，GSE编号为GSE149614^［8］，包含从4个相关部位（原发肿瘤，门静脉癌栓，转移淋巴结和非肿瘤肝脏）的10例HCC患者共大于70 000单细胞转录组数据。

1.2 相关数据库

文章中使用的相关数据库汇总表见表1。

1.3 数据预处理

使用R包Seurat中的CreateSeuratObject函数读取下载的数据集并创建Seurat对象，参数min.features设为100。随后，通过subset函数过滤掉线粒体基因比例高于20%且每个细胞中检测到的基因数不在500~4 000范围内的细胞，同时nCount_RNA小于40 000。为了去除批次效应，基于patient分组，利用harmony包中的RunHarmony函数进行校正，所选assay为RNA。之后，依次采用Seurat包的NormalizeData和ScaleData函数对数据进行归一化与标准化处理，均使用默认参数。

1.4 细胞分群和标记

首先，使用Seurat包中的RunTSNE 和 RunUMAP 函数进行降维分析，选择了基于前29个主成分的结果，reduction参数设定为harmony。接着，利用FindNeighbors和FindClusters 函数实现细胞聚类分析，将分辨率resolution定为0.6。然后，通过FindAllMarkers函数计算各簇特异性标记基因，并仅保留那些P<0.05的基因作为候选者。最后，根据这些挑选出的标记基因执行人工及自动注释过程；前者参考了CellMarker 2.0数据库的信息，后者则调用SingleR包提供的算法，参照celldex包内含有的标记基因集合，并对来自不同患者和组织进行细胞比例的堆积柱状图展示。

1.5 Gene Ontology（GO）基因功能注释富集分析

针对原发组织与转移组织中的巨噬细胞实施GO富集分析，运用clusterProfiler包里的enrichGO函数，设置了P值与q值阈值均为0.01。

1.6 生存分析

在GEPIA平台上，通过对表达模式自定义以及生存期预测等功能模块的应用，具体参数：“Gene”为自主输入基因名，“Methods”为Overall Survival，“Group Cutoff”为Median，“Hazards Ratio”为Yes，“95% Confidence Interval”为Yes，“Axis Units”为Months，“Cancer name”为LIHC，完成了对选定基因集内核心基因与HCC患者总生存期相关性的验证工作。

2 结果

2.1 原位和淋巴结转移肝癌样本可视化

为了获得肝癌样本的整体单细胞图景（图1A、B），首先将样本的基因表达矩阵转换成Seurat对象，并依次通过质控过滤、批次校正、标准化和归一化进行数据预处理（图1C~E）。

2.2 原位和淋巴结转移肝癌的单细胞亚群图谱

为了进一步对全景图谱中不同细胞亚型进行聚类，使用R包Seurat中的FindClusters函数进行细胞聚类，经细胞类群注释得到以下7种细胞类型：B_cell、dendritic cell（DC）、 Endothelial cell、Fibroblast、Hepatocytes、Macrophages、T_NK（图2A~C），巨噬细胞的主要标志基因为CD68和CD163（图2C）。在细胞聚类和注释（图2D~G）可视化结果中，肿瘤组织（T）中的细胞类型丰度比例与正常组织（N）中的明显不同，而门静脉癌栓组织（P）与转移淋巴结（L）的巨噬细胞和T_NK的比例相似（图2G）。肿瘤组织中Hepatocytes类型和Macrophages类型的占比较多（图2D、F、G）。经CNV分析，推测Hepatocytes细胞群是恶性肿瘤细胞，此外，DC和Macrophages的拷贝数也有较大变化，推测是由于这两个细胞群对肿瘤细胞产生了免疫应答。综上，本研究选择Macrophages即巨噬细胞作为进一步分析的细胞类群。

2.3 原位和淋巴结转移肝癌的巨噬细胞差异表达基因的蛋白互作网络

为探究巨噬细胞在原位和淋巴结转移肝癌中基因表达的差异，提取细胞注释类型为Macrophages的细胞，并先利用R包Seurat中的FindMarkers函数计算类型为“primary tumor”和“metastatic lymph node”细胞中巨噬细胞DEGs。其中相对于原发组织，转移组织中巨噬细胞的DEGs主要为下调（图3A），进一步通过STRING对下调基因（Top50，‑FC=2.26~7.93）和上调基因（Top20，FC=1.52~2.99）进行蛋白质互作网络分析（图3B、C），本研究发现形成的蛋白质互作网络主要分为11个簇，其中簇1共有15个蛋白（AHSG、APOA1、APOA2、APOB、APOC3、APOE、APOH、APOM、CST3、HRG、KNG1、MMP14、RBP4、SERPINC1、TTR），主要参与类视黄醇的代谢和运输（图3B、表 2）。

2.4 淋巴结转移肝癌巨噬细胞基因表达异质性分析

为进一步探究巨噬细胞在原位与淋巴结转移中基因表达异质性，对“primary tumor”和“metastatic lymph node”细胞中巨噬细胞DEGs进行了GO富集分析和GSEA分析。经GO富集分析，发现淋巴结转移肝癌巨噬细胞的生物学过程主要为创伤愈合、胞内蛋白质合成、丙酮酸盐（酯）代谢过程（图4A），而原位肝癌巨噬细胞的生物学过程大多数与蛋白质异常折叠相关（图4B）。经GSEA分析，得到了2个富集基因集，其中HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE在原位肝癌巨噬细胞细胞中上调，HALLMARK_XENOBIOTIC_METABOLISM在淋巴结转移巨噬细胞中上调（图4C、D）。

2.5 利用转录组测序数据库进行验证性分析的结果

本研究在原发和转移组织中各选取了差异倍数位列前5的标志基因，结合公共数据库TCGA在线分析平台GEPIA进行联合验证分析。结果显示，单细胞测序中得到的巨噬细胞的标志基因在Bulk测序中同样具有差异性：原发组织细胞的5个的标志基因（AGXT、APOC3、HLA‑DQA2、HRG、IGFBP7）中，HLA‑DQA2在转录组测序数据中相对于正常组织的表达显著上调（图5A）；在转移组织细胞的5个的标志基因（ALOX5AP、CD109、MMP12、SLC16A10、SPINK1）中，SPINK1在Bulk测序数据中相对于正常组织的表达显著上调（图5B）。由Survival Analysis生存曲线图可知，MMP12、SPINK1（P<0.05）等基因低表达时患者的生存期较长（图5C），而APOC3（P<0.05）基因高表达时患者的生存期较长（图5D）。筛选出的标志基因与癌症的发生、发展有密切联系，即原发性肝癌巨噬细胞中APOC3的高表达和转移性肝癌巨噬细胞中MMP12和SPINK1的低表达有利于改善患者预后。

3 讨论

经过肝癌组织单细胞图谱刻画，本研究发现早期患者肿瘤组织及癌旁组织的异质性较大。Hedrick等^［10］提到已有大量证据表明中性粒细胞具有促癌作用。因此推断早期患者肿瘤组织及癌旁组织的异质性较大的原因可能是因为受到中性粒细胞的影响。

通过细胞注释，本研究成功获得了巨噬细胞的聚类亚群，并且在进一步对原位和转移淋巴结肝癌来源的巨噬细胞进行基因差异表达分析后，找出了转移淋巴结巨噬细胞相对于原位的Top50的下调和Top20的上调基因，其中上调Top5的基因为ALOX5AP、CD109、MMP12、SLC16A10和SPINK1，而下调Top5的基因为AGXT、APOC3、HLA‑DQA2、HRG、IGFBP7。

通过进一步的蛋白质互作网络分析，发现这些差异基因主要参与类视黄醇的代谢和运输，视黄醇的代谢中间产物全反式维甲酸则可抑制胶质母细胞瘤进展及治疗急性早幼粒细胞白血病^{［11，12］}。此外，为了分析原位和转移淋巴结肝癌巨噬细胞的功能异质性，在基因集富集分析中，发现原位肝癌中上调的生物学过程大多数和蛋白质异常折叠相关，转移淋巴结肝癌巨噬细胞上调的基因则富集在创伤愈合、胞内蛋白质合成、丙酮酸盐（酯）代谢过程等。研究表明蛋白质稳态调控系统的功能异常是致癌蛋白异常积累的重要原因^［13］。而肿瘤的发生、发展与创面愈合有许多共同点，比如它们都依赖细胞的增殖活动、细胞外基质的支架结构与血管形成、激素水平和生长因子活性的变化^{［14‑17］}。

本研究在原位和转移淋巴肝癌中各选取了差异倍数位列前5的标志基因，并结合公共数据库TCGA在线分析平台GEPIA进行联合验证分析后发现APOC3基因表达与患者的生存期正相关，而MMP12和SPINK1的基因表达与患者的生存期负相关。APOAC3为编码载脂蛋白的基因，研究表明APOC3主要在肝脏合成并增加甘油三酯水平^{［18，19］}，可作为防治脂肪肝、脂质代谢异常、代谢综合征和动脉粥样硬化等相关疾病的靶点^［18］，有报道AOPC3与血管生成有关^［20］，因此推测微血管的生成可能促进了免疫细胞向肿瘤微环境中的富集过程。MMP12为细胞外基质降解酶基质金属蛋白酶家族的成员，参与了组织重塑、伤口修复、动脉粥样硬化进展和肿瘤侵袭^{［21‑24］}，SPINK1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可显著抑制胰蛋白酶，尤其是在胰腺中，SPINK1突变可导致胰腺癌^［25］，此外SPINK1在肝细胞癌中表达显著上调，与肿瘤的发生和发展紧密相关^{［26，27］}。

本研究结果表明，原位和淋巴结转移肝癌中巨噬细胞具有异质性，转移淋巴结内的巨噬细胞信号通路发生改变，主要参与了创伤愈合、胞内蛋白质合成、丙酮酸盐（酯）代谢过程。并且，MMP12和SPINK1基因的高表达和APOC3基因的低表达均与肝癌不良预后正相关。APOAC3可能是潜在的治疗原发性肝癌靶点。不过，相关结论仍需实验研究作进一步验证。

作者贡献度说明：

何成思：文章设计、文献整理、数据分析及手稿撰写；李子豪：数据分析及手稿撰写；蔡哲友、杨林浩、陈峙橦：数据分析及文献整理；邹争志：文章设计及格式检查；侯本新：提供整体思路和修改意见。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Sun J， Althoff KN， Jing Y， et al. Trends in hepatocellular carcinoma incidence and risk among persons with HIV in the US and Canada， 1996‑2015［J］. JAMA Netw Open， 2021， 4（2）： e2037512.

[2] Xu M， Yang L， Lin Y， et al. Emerging nanobiotechnology for precise theranostics of hepatocellular carcinoma［J］. J Nanobiotechnol， 2022， 20（1）： 427.

[3] Llovet JM， Willoughby CE， Singal AG， et al. Nonalcoholic steatohepatitis‑related hepatocellular carcinoma： Pathogenesis and treatment［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2023， 20（8）： 487‑503.

[4] Zhang Q， He Y， Luo N， et al. Landscape and dynamics of single immune cells in hepatocellular carcinoma［J］. Cell， 2019， 179（4）： 829‑845.

[5] Fuster‑Anglada C， Mauro E， Ferrer‑Fàbrega J， et al. Histological predictors of aggressive recurrence of hepatocellular carcinoma after liver resection［J］. J Hepatol， 2024， 81（6）： 995‑1004.

[6] Mempel TR， Lill JK， Altenburger LM. How chemokines organize the tumour microenvironment［J］. Nat Rev Cancer， 2024， 24（1）： 28‑50.

[7] Sharma P， Hu‑Lieskovan S， Wargo JA， et al. Primary， adaptive， and acquired resistance to cancer immunotherapy［J］. Cell， 2017， 168（4）： 707‑723.

[8] Lu Y， Yang A， Quan C， et al. A single‑cell atlas of the multicellular ecosystem of primary and metastatic hepatocellular carcinoma［J］. Nat Commun， 2022， 13（1）： 4594.

[9] Laisné M， Lupien M， Vallot C. Epigenomic heterogeneity as a source of tumour evolution［J］. Nat Rev Cancer， 2024， 25（1）：7‑26.

[10] Hedrick CC， Malanchi I. Neutrophils in cancer： Heterogeneous and multifaceted［J］. Nat Rev Immunol， 2022， 22（3）： 173‑187.

[11] Fu M， Zhang Y， Peng B， et al. All‑trans retinoic acid inhibits glioblastoma progression and attenuates radiation‑induced brain injury［J］. JCI Insight， 2024， 9（21）： e179530.

[12] Vedi A， Leiter SM， Memon IL， et al. Real‑world experience of paediatric acute promyelocytic leukaemia in the United Kingdom and Ireland［J］. Br J Haematol， 2024， Epub ahead of print.

[13] 袁涛， 钱美佳， 葛孚晶， 等. 调控蛋白质稳态的抗肿瘤新靶点和新策略研究进展［J］. 药学进展， 2022， 46（12）： 898‑909.

[14] Yuan T， Qian MJ， Ge FJ， et al. Research progress of new targets and strategies to regulate proteostasis in cancer［J］. Progress Pharm Sci， 2022， 46 （12）： 898‑909.

[15] Liu WS， Chen Z， Lu ZM， et al. Multifunctional hydrogels based on photothermal therapy： A prospective platform for the postoperative management of melanoma［J］. J Control Release， 2024， 371： 406‑428.

[16] Wang P， Hou Z， Wang Z， et al. Multifunctional therapeutic nanodiamond hydrogels for infected‑wound healing and cancer therapy［J］. ACS Appl Mater Interfaces， 2024， 16（8）： 9656‑9668.

[17] Chan HL， Zhang XH. Nutrient sensing in macrophages linked to reorganized tumor vasculature［J］. Cancer Res， 2024， 84（5）： 650‑651.

[18] Danella EB， Costa DMM， D'Silva NJ. Cytokines secreted by inflamed oral mucosa： Implications for oral cancer progression［J］. Oncogene， 2023， 42（15）： 1159‑1165.

[19] 王秀文. 抑制APOC3表达的药物筛选及其在肝细胞脂代谢中的作用机制研究［D］. 长春：东北师范大学，2022.

[20] Wang XW. Drugs screening for inhibiting APOC3 expression and the underlying mechanisms in lipid metabolism of hepatocytes［D］. Changchun：Northeast Normal University，2022.

[21] 闫姗， 丁智勇， 高媛， 等. 载脂蛋白C3在非酒精性脂肪肝、糖脂代谢和胰岛β细胞功能调节中的作用［J］. 生理学报， 2023， 75（6）： 767‑778.

[22] Yan S， Ding ZY， Gao Y， et al. The role of apolipoprotein C3 in the regulation of nonalcoholic fatty liver disease， glucose and lipid metabolism， and islet β cell function［J］. Acta Physiol Sin， 2023， 75 （6）： 767‑778.

[23] El‑Gammal Z， Bakry U， El‑Sayed AF， et al. Apolipoproteins have a major role in cellular tumor dormancy in triple negative breast cancer： Insilico study［J］. Sci Rep， 2024， 14（1）： 23146.

[24] Wang KJ， Ye SZ， Jia XL， et al. RON receptor tyrosine kinase as a critical determinant in promoting tumorigenic behaviors of bladder cancer cells through regulating MMP12 and HIF‑2alpha pathways［J］. Cell Death Dis， 2024， 15（11）： 844.

[25] Yu LM， Sampath D， Bosykh DA， et al. YAP/TAZ drive agrin‑matrix metalloproteinase 12‑mediated diabetic skin wound healing［J］. J Invest Dermatol， 2024，145（1）：155‑170.

[26] Shelbaya K， Arthur V， Yang Y， et al. Large‑scale proteomics identifies novel biomarkers and circulating risk factors for aortic stenosis［J］. J Am Coll Cardiol， 2024， 83（5）： 577‑591.

[27] Luttun A， Lutgens E， Manderveld A， et al. Loss of matrix metalloproteinase‑9 or matrix metalloproteinase‑12 protects apolipoprotein E‑deficient mice against atherosclerotic media destruction but differentially affects plaque growth［J］. Circulation， 2004， 109（11）：1408‑1414.

[28] Chen F， Long Q， Fu D， et al. Targeting SPINK1 in the damaged tumour microenvironment alleviates therapeutic resistance［J］. Nat Commun， 2018， 9（1）： 4315.

[29] Wang C， Dong R， Yang F， et al. LARP4B promotes hepatocellular carcinoma progression and impairs sorafenib efficacy by activating SPINK1‑mediated EGFR pathway［J］. Cell Death Discov， 2024， 10（1）： 208.

[30] Man KF， Zhou L， Yu H， et al. SPINK1‑induced tumor plasticity provides a therapeutic window for chemotherapy in hepatocellular carcinoma［J］. Nat Commun， 2023， 14（1）： 7863.

基金资助

三亚市人才开发专项资金项目(（2023）14‑04)