黎药胆木治疗糖尿病肾病的网络药理学研究及实验验证

Network pharmacology research and experimental verification of Li Medicine Nauclea officinalis in the treatment of diabetic nephropathy

摘要

目的 利用网络药理学、分子对接和体外实验研究黎药胆木有效成分治疗糖尿病肾病的关键作用靶点和潜在作用机制。 方法 通过CNKI、PubMed、SwissTargetPrediction数据库检索胆木活性成分作用靶点，同时在GeneCards、Disgenet数据库获取糖尿病肾病靶点，取交集后导入String数据库筛选核心靶点，对靶点进行富集分析以及分子对接验证，细胞实验验证胆木中有效成分对糖尿病肾病的保护作用。 结果 筛选得到9种有效成分，258个对应靶点5 333个疾病靶点，取交集得132个共同靶点，主要为IL6、ALB、STAT3、PPARG、EGFR等靶点；经富集分析可知胆木治疗糖尿病肾病信号通路主要涉及基因表达的正调控、细胞溶质、ATP结合、HIF‑1、FoxO、PI3K‑Akt等通路；分子对接可知胆木活性成分与核心蛋白之间能自发结合，同时将结合分数及靶点通路相关度最高的胆木化学成分常春藤皂苷元进行体外实验验证，结果表明常春藤皂苷元能够保护高糖诱导的细胞凋亡，抑制细胞迁移并提高细胞增值率。 结论 本研究通过网络药理学及分子对接研究胆木治疗糖尿病肾病的作用成分及机制，发现胆木可通过多靶点、多成分、多通路发挥治疗作用。体外实验初步验证了胆木中活性成分常春藤皂苷元可缓解高糖诱导的细胞损伤，提高肾足细胞增值率，表明胆木中常春藤皂苷元可能是治疗糖尿病肾病的基础所在，为研究黎药胆木应用提供了新思路。

Abstract

Objective To study the potential mechanism of the active ingredients of Liyao Nauclea（N.） officinalis in the treatment of diabetic nephropathy by using network pharmacology and in vitro experiments. Methods Through CNKI， PubMed， and SwissTargetPrediction databases， the active ingredients and targets of N. officinalis were searched. At the same time， the targets of diabetic nephropathy were obtained in GeneCards and Disgenet databases. After the intersection was imported into the String database， the core targets were screened， and the targets were enriched and analyzed. Molecular docking verification， and cell experiments verified the effective protective effect of N. officinalis on diabetic nephropathy. Results A total of 9 effective components， 258 corresponding targets and 5 333 disease targets were screened， and 132 common targets were obtained by intersection， mainly IL6， ALB， STAT3， PPARG， EGFR and other targets. Enrichment analysis showed that the signaling pathways of N. officinalis in the treatment of diabetic nephropathy mainly involved positive regulation of gene expression， cell solute， ATP binding， HIF‑1， FoxO， PI3K‑Akt and other pathways. Molecular docking showed that the active components of N. officinalis could spontaneously bind to the core protein. At the same time， the Hederagenin with the highest binding fraction was verified in vitro. The results showed that Hederagenin could protect high glucose‑induced apoptosis， inhibit cell migration and increase cell proliferation rate. Conclusion In this study， the components and mechanisms of N. officinalis in the treatment of diabetic nephropathy were studied by network pharmacology， and it was found that N. officinalis could play a therapeutic role through multi‑target， multi‑component and multi‑pathway. Hederagenin contained in N. officinalis is likely to be the basis for its treatment of diabetic nephropathy. In vitro experiments have preliminarily verified that the active ingredient hederagenin in N. officinalis can alleviate cell damage induced by high glucose and increase cell proliferation rate， which provides a new idea for the treatment of diabetic nephropathy by Li medicine N. officinalis.

Graphical abstract

关键词

胆木 / 网络药理学 / 糖尿病肾病

Key words

Nauclea officinalis / Network pharmacology / Diabetic nephropathy

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病严重并发症之一，临床表现为蛋白尿、高血糖、水肿等^［1］；现代医学认为DN是一种慢性炎症性疾病^［2］，研究表明，DN发病与足细胞损伤、炎症反应、氧化应激及代谢异常等多种因素密切相关^［3］。足细胞属于肾小球上皮细胞，其损伤被证实为DN发展的核心环节^［4］；当体内促炎因子分泌后，炎症细胞会在肾脏中发生浸润现象，导致足细胞受损诱发DN^［5］；故控制炎症反应是DN防治必须重视的环节。当前，针对DN仍无理想的治疗方案，临床多以血糖控制、胰岛素注射^［6］、针灸推拿及食疗药膳等手段来缓解病症^［7］，且大多成效欠佳。伴随中医药防治DN的理论与临床研究逐步深入，中药凭借多成分、多靶点、多途径的特点在DN治疗中彰显出愈发显著的优势与价值^［8］。胆木是海南省道地药材，主产于海南琼中、白沙等黎族区域^［9］，民间常用于治疗扁桃体炎症、肠炎等炎症疾病^［10］；胆木活性成分多样，包含生物碱、酚酸、五环三萜及皂苷类成分，这些成分赋予了胆木多种药理活性。研究表明，胆木具有显著的抗炎^［11］、解热、抗氧化^［12］等药理作用，而DN的发病常伴随炎症反应、氧化应激等，鉴于胆木在抗炎、抗氧化该方面的独特优势，本研究采用网络药理学及分子对接方法分析黎药胆木治疗DN可能的单体成分及作用机制，并通过体外实验对网络药理学结果进行初步验证，为黎药胆木治疗DN提供新的研究角度和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器

BX53型荧光显微镜（奥林巴斯公司）；C22.2NO型酶标仪（BioTek公司）；Ta2‑FL 型倒置显微镜（尼康公司）；C1109B超净工作台（上海智城）；5702l型离心机（赛默飞）。

1.1.2 实验耗材

小鼠足细胞MPC5细胞系（武汉普诺赛生命科技有限公司）；DMEM高糖培养基（Gibco公司 10564011）；EDTA（Gibco公司 252000 56）；胎牛血清（浙江天航生物 13011‑8611）；青霉素‑链霉素‑庆大霉素×100（白鲨生物科技公司 BL141A）；D‑葡萄糖（赛国科技公司 1179GR500）；CCK‑8检测试剂盒（白鲨生物科技公司 BS350A）；常春藤皂苷元（HDG，麦克林生化科技公司 H796103）；EDU‑594细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物 C0078S）。

1.2 方法

1.2.1 胆木靶点筛选与预测

通过查询（CNKI、PubMed）获取胆木主要化学成分、Canonical SMILES标识；采用SwissTP网站（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进一步分析，选择研究对象为人类（Homo sapiens），按照Druglikeness 5原则、probability≥0为依据筛选，得到胆木相关靶基因；于Uniprot网站（https：//www.uniprot.org）校准基因，剔除无效及重复靶点，获得标准化基因用于后续分析。

1.2.2 DN疾病靶点预测

利用数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）、Disgenet数据库（https：//www.disgenet.org/login），检索关键词“Diabetic Nephropathy”整理合并相关靶点信息，通过Venny2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）在线网站将胆木与DN靶点基因取交集获取共同靶点。

1.2.3 药物与疾病靶点PPI的网络构建及互作分析

将1.2.2收集的共同靶点数据输入STRING数据库（https：//string-db.org），设置物种Homo Sapiens，Protein Name中输入靶点，设置置信度0.9，删除无连接节点，得出数据导入Cytoscape软件，运用插件Centiscape通过勾选对应参数条件，进行拓扑分析获得关键靶点。

1.2.4 富集分析及网络图绘制

通过DAVID数据库（https：//davidbioinformatics.nih.gov）对关键靶点GO及KEGG富集分析，使用微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）对其统计分析以及采用可视化方式处理。Cytoscape软件，选择排名靠前通路、靶点、成分绘制网络图。

1.2.5 分子对接验证

为进一步验证胆木治疗DN的可靠性，选择Degree值排名靠前的5种关键靶点及对应活性成分进行分子对接，从PDB数据库下载关键靶蛋白的PDB结构，将1.2.1项中对应成分利用OpenBabel软件转为Mol2格式；通过AutoDockTools软件，对PDB蛋白和关键成分的结构进行分子对接，以验证关键靶点与关键成分的结合活性，选择结合能最佳结构，使用Pymol软件结果可视化。

1.2.6 细胞培养及活性测定

MPC5细胞于37 ℃，5% CO₂（高糖DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素‑链霉素‑庆大霉素）中培养。细胞密度达90%~100%时，以（每孔8×10³个细胞）接种于96孔板中，培养24 h后加入不同浓度常春藤皂苷元（0.3、0.6、1.2、2.4、4.8 μmol/L）培养24 h后，每孔加入10 μL CCK‑8试剂，继续孵育1 h后在450 nm处测定吸光度计算细胞存活率。细胞存活率：［（As给药组-Ab空白组）/（Ac正常组-Ab空白组）］×100%

1.2.7 细胞分组及药物干预

取对数生长期MPC5细胞以（每孔8×10³个细胞）接种于96孔板中，细胞分为5组：正常组（ZCZ，5.5 mmol/L葡萄糖）、模型组（MD，30 mmol/L葡萄糖）、常春藤皂苷元+高糖低剂量组（HDGL，0.3 μmol/L常春藤皂苷元+30 mmol/L葡萄糖）、常春藤皂苷元+高糖中剂量组（HDGM，0.6 μmol/L常春藤皂苷元+30 mmol/L葡萄糖）、常春藤皂苷元+高糖高剂量组（HDGH，1.2 μmol/L常春藤皂苷元+30 mmol/L葡萄糖），孵育24 h后同“1.2.6”方法对细胞进行测定。

1.2.8 细胞划痕实验

划痕实验检测细胞迁移情况，将细胞以每孔5×10⁵个的细胞接种到6孔板中，37 ℃、5% CO₂的条件下培养24 h，当细胞汇合度达到100%时，使用200 µL移液器吸头在细胞单层表面进行划痕，利用显微镜分别观察细胞在0、24 h的划痕面积。使用lmageJ软件计算细胞间距。划痕愈合率（%）=（0 h划痕面积-24 h划痕面积）/0 h的划痕面积×100%。

1.2.9 EDU检测细胞增殖

在12孔板中加入不同浓度常春藤皂苷元（0.3、0.6、1.2 μmol/L）处理高糖诱导MPC5细胞24 h后去除培养基，将EdU工作液等体积加入到12孔板中，继续孵育2~3 h后去培基，加固定液15 min后去固定液，洗涤3次后加通透液10 min，加Click反应液避光30 min， 加Hoechst液10 min后在荧光显微镜中观察荧光细胞增殖比例。

1.3 统计学处理

采用Graph Pad Prism 8.0统计软件分析及绘制；数据以（\overline{x}\pm s）表示；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验；P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 胆木活性成分筛选

通过Cnki、Pubmed检索胆木有效成分，结合SwissTargetPrediction数据库共筛选出活性成分9个包括（Gallic acid没食子酸、Nauclefine、 Protocatechuic acid原儿茶酸、Cinnamic acid肉桂酸、Vanillic acid香草酸、Benzoic acid苯甲酸、Hederagenin常春藤皂苷元、Strictosamide异长春花苷内酰胺、Parvine）；将活性成分中对应靶点于Uniprot网站校准后去重复得258个，包括IL6、ALB、STAT3、PPARG、MAPK1等。

2.1.2 胆木治疗DN核心靶点收集

通过GeneCards、Disgenet数据库去重后得疾病靶基因5 333个；采用Venn图将活性成分靶点与疾病靶点取交集得共同靶点132种（图1），导入STRING数据库，分析胆木治疗DN共同靶点的蛋白互作关系及网络可视化构建PPI网络图（图2）。使用Cytoscape3.9.1拓扑分析，以Degree值、中位数为阈值筛选得30种核心靶点（图3），其中Degree值排名靠前的靶点包括白细胞介素6（IL6）、白蛋白（ALB）、信号转导和转录激活因子‑3（STAT3）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）、表皮生长因子受体（EGFR），推测胆木可能通过上述5种关键靶点发挥治疗DN作用。

2.1.3 GO与KEGG富集通路分析

将胆木治疗DN关键靶点导入DAVID数据库，按P值排名将前10位进行GO生物富集，发现生物过程（BP）主要涉及基因表达的正调控、细胞凋亡过程的负调控、信号传导等生物过程，细胞成分（CC）主要涉及大分子复合物、线粒体、细胞核等细胞组分，分子功能（MF）涉及蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、酶结合等活性分子功能（图4）。

DN的发生涉及多种信号通路与生物过程，为深入研究胆木治疗DN的作用机制，对关键靶点进行KEGG富集分析，共得105条通路。按P值排序靠前通路包括，HIF‑1信号通路、癌症途径、PI3K‑Akt信号通路、内分泌抵抗、FoxO信号通路、乙型肝炎、脂质和动脉粥样硬化、癌症中的蛋白聚糖、胞葬作用等（图5）；推测胆木通过影响以上通路参与治疗DN，其中MAPK1、STAT3、EGFR、BRAF靶点一次对应多条通路，提示靶点与通路之间相互关联相互影响。

2.1.4 胆木成分‑疾病‑靶点‑通路网络图

通过Cytoscape 3.9.1软件，绘制胆木治疗DN的成分‑靶点‑通路的网络图（图6），分析发现，胆木多种活性成分可能对不同的靶点产生作用，不同的活性成分可能会影响同一靶点；胆木中一种活性成分也可能参与多个不同的代谢途径，使多靶点在同一代谢途径上发挥作用，从而调节机体的生理平衡治疗DN。进一步证明胆木可能通过多靶点、多通路、多成分实现对DN治疗。

2.1.5 胆木成分与关键靶点对接结果

将Degree值排名靠前的IL6、PPARG、ALB、STAT3和EGFR靶点与对应核心成分常春藤皂苷元、原儿茶酸、nauclefine和肉桂酸进行分子对接，验证结合能力（表1）。分析5组数据，结合能均小于-5 kcal/mol，表示配体与受体具有较好的结合能力，其中常春藤皂苷元与蛋白受体PPARG结合能达到-9.2 kcal/mol，表示其结合状态高度稳定。

分子对接结果提示，小分子与大分子之间均能够自发结合，说明关键成分与核心靶点具有较好的亲和性，可稳定自发结合的同时也验证了本次预测结果的可靠性。分子对接可视化见图7。

2.2 体外实验结果

2.2.1 不同浓度HDG对MPC5细胞活性影响

细胞CCK‑8实验表明（图8），与ZCZ比较，HDG在浓度为0.3~1.2 μmol/L对MPC5细胞无明显毒性（P>0.05），当HDG浓度≥2.4 μmol/L细胞存活率明显降低，故选择浓度0.3~1.2 μmol/L作为后续HDG干预浓度。

2.2.2 HDG对高糖诱导的MPC5细胞活力的影响

CCK‑8法检测HDG对高糖诱导的MPC5细胞活力影响，与ZCZ比较，MD高糖组存活率显著降低，差异具有统计学意义（P<0.001）。与MD高糖组比较，HDGM 0.6 μmol/L与HDGH 1.2 μmol/L细胞存活率显著升高，差异均具有统计学意义（P<0.001），表明HDG对高糖诱导损伤的MPC5足细胞起到一定的保护作用（图9）。

2.2.3 HDG抑制高糖诱导的MPC5细胞迁移

迁移实验检测HDG对高糖诱导MPC5细胞迁移情况，与ZCZ相比，MD组迁移率显著升高（P<0.001），与高糖组相比，HDG组整体呈现迁移率降低趋势，HDGH 1.2 μmol/L细胞迁移率进一步降低 （P<0.05）（图10）。

2.2.4 HDG对高糖诱导的MPC5细胞增殖的影响

采用EDU法检测HDG对高糖诱导MPC5细胞增殖情况（图11），与ZCZ比较，MD组细胞增值率降低（P<0.001）。与MD组比较，用（0.3、0.6、1.2 μmol/L） HDG处理高糖损伤MPC5细胞24 h后，随给药浓度升高EDU标记细胞数显著增加，其中1.2 μmol/LHDGH处理的细胞增值率进一步升高（P<0.01），通过EDU实验与划痕实验相互佐证，说明HDG可抑制高糖诱导MPC5足细胞损伤。

3 讨论

DN是由糖尿病引起的严重并发症，因病程沉默期长且发病速度快往往被患者忽略，发病过程从蛋白尿开始，逐步降低肾小球过滤率最终可导致终末期肾病^［13］。目前，针对治疗DN的有效药物有限，大量中医临床研究发现内服外用中药治疗DN安全有效，同时中药也被认为是治疗DN的重要药物来源^［14］。黎药胆木含有多种活性成分，目前市面上用于临床实践的胆木制品多以注射剂、浸膏片、胶囊为主，且质量控制多数集中在生物碱类化合物中，而对胆木中五环三萜类、有机酚等化学成分研究相对缺乏^［15］。为此，本研究基于网络药理学对黎药胆木治疗DN有效成分进行筛选，探讨相关靶点与作用机制，并通过体外实验对网络药理学得出的结论初步验证。网络药理学结果提示胆木可能通过有机酚及五环三萜类化合物包括（没食子酸、原儿茶酸、肉桂酸及常春藤皂苷元等）调控PPARG、IL6、STAT3、EGFR、BRAF靶点或PI3K‑Akt、Endocrine resistance、FoxO等信号通路到达治疗DN的效果。

既往研究发现，DN可致高血糖和氧化应激从而激活NLRP3炎性小体依赖性释放促炎因子，导致肾脏损伤^［16］，而没食子酸可在高糖环境中减缓细胞凋亡，这种保护作用可能与调节NLRP3基因表达有关^［17］；原儿茶酸可作用于HepG2细胞增加AMPK蛋白的磷酸化的同时激活AKT信号通路，使糖异生相关基因表达量降低^［18］；实验表明肉桂酸可降低炎症基因表达IL6以减轻由糖尿病引起的肝脏并发症^［19］，当脂肪细胞中的IL6细胞因子将信号传导至内脏脂肪细胞时，可释放游离脂肪酸从而起到调节肝胰岛素抵抗、治疗糖尿病的作用^［20］；ALB在血浆中含量占比达60%，属于最多的蛋白质，在肾损伤状况下ALB呈现代谢异常、自噬停滞等特征，而减少ALB暴露可缓解该病理进程^［21］；肾小管STAT3可推动成纤维细胞增殖以及间质纤维化进程，故通过抑制STAT3可达到保护肾纤维化的目的^［22］。FoxO信号通路能够参与对蛋白质合成、代谢调控等过程的调节，进而实现对肾脏的保护作用^［23］。研究发现通过激活缺氧诱导因子HIF‑1信号通路能够抑制肾小管上皮细胞死亡，进而发挥保护肾损伤的作用^［24］。PI3K‑Akt信号通路可调节生长因子信号传导，促进蛋白质生成、维持葡萄糖稳态、脂代谢调控中扮演重要角色^［25］，同时PI3K‑Akt通路还具有改变血糖与胰岛素抵抗的作用^［26］。

综上所述，本研究利用网络药理学探索了黎药胆木治疗DN的作用靶点及机制，并通过分子对接及体外实验初步验证黎药胆木中可能对DN产生治疗效果的有效成分。结果显示胆木可通过多成分、多靶点干预疾病进展，从而达到治疗的DN目的，提示黎药胆木用于治疗糖尿病肾病的可能性，也为防治糖尿病肾病提供了新的思路和方法。

作者贡献度说明：

张瀚铭：文章的设计、实验与数据分析；杨月华、霍天祺：实验数据收集整理；刘颖、吴珠：实验指导；杨卫丽：实验指导、文章质量控制及修稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省自然科学基金(823MS147)

海南省自然科学基金高层次人才项目(820RC624)