青蒿素通过改善心肌线粒体功能减轻脓毒症小鼠心肌损伤的实验研究

Experimental studies of artemisinin‑attenuated myocardial injury in sepsis‑induced mice by improving myocardial mitochondrial function

摘要

目的 探讨青蒿素（ART）减轻不同菌种所致脓毒症小鼠心肌损伤的作用及其可能机制。 方法 104只C57/BL小鼠随机分为假手术组（sham组）、革兰氏阳/阴性脓毒症组（G+/G- sepsis组）、革兰氏阳/阴性脓毒症+ART不同剂量组（ART 5、10、15、20、25+G+/G- sepsis）。造模后12 h取样，H&E染色观察心肌病理变化并评分，ELISA法测定小鼠血清CK‑MB、cTnⅠ浓度。以ART 25 mg/kg剂量组探讨其减轻脓毒症小鼠心肌损伤的作用机制，心脏超声检测小鼠心脏LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD、EDV、ESV水平，透射电镜观察心肌线粒体损伤并评分。 结果 与sham组相比，G+/G- sepsis组心肌损伤和炎症细胞浸润严重、CK‑MB、cTnⅠ明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；ART各剂量组显著减轻心肌纤维损伤和炎症细胞浸润，损伤评分、血清CK‑MB、cTnⅠ水平较G+/G- sepsis组呈浓度依赖性下降，差异均有统计学意义（P<0.05）；与sham组相比，G+/G- sepsis组心肌收缩功能下降、心肌线粒体呈严重的形态损伤及评分，差异有统计学意义（P<0.05）；与G+/G- sepsis组相比，ART 25+G+/G- sepsis组心肌收缩功能得到改善且评分下降、仅少部分线粒体形态破坏，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 青蒿素对金黄色葡萄球菌/大肠埃希菌所致脓毒症小鼠心肌损伤有保护作用，其机制可能与改善心肌线粒体功能相关。

Abstract

Objective To explore the effect of artemisinin（ART） in reducing myocardial injury in mice caused by different strains. Methods Atotal of 104 C57/BL mice were randomized to the sham surgery group （sham group）， the Gram positive/negative sepsis group （G+/G‑ sepsis group）， and the Gram positive/negative sepsis+ART group （ART 5、10、15、20、25 + G+/G- sepsis）. Take samples 12 h after molding， myocardial pathological changes were observed and scored by H&E staining， and mouse serum CK‑MB and cTnⅠ concentrations were determined by ELISA. The mechanism of ART in alleviating myocardial injury in septic mice was explored in the ART 25 mg/kg dose group. The LVEF， LVFS， LVEDD， LVESD， EDV and ESV levels of the mice hearts were detected by cardiac ultrasound， and the myocardial mitochondrial damage was observed and scored by transmission electron microscopy. Results Compared to the sham group， the G+/G- sepsis group had severe myocardial injury and inflammatory cell infiltration， CK‑MB and cTnⅠ， which were significant （P<0.05）. Each dose group of ART significantly reduced cardiac muscle fiber injury and inflammatory cell infiltration， and the injury score， serum CK‑MB and cTnⅠ levels showed a concentration‑dependent significantly decrease compared to G+/G- sepsis group （P<0.05）； compared to the sham group， the G+/G- sepsis group showed decreased myocardial systolic function， severe myocardial mitochondria， and significant morphological damage and score （P<0.05）； Compared to the G+/G- sepsis group， the ART 25 + G+/G‑ sepsis group had improved myocardial systolic function and mitochondrial damage score decreased scores， and only a small part of the mitochondrial morphology was disrupted， showing a statistically significant difference （P<0.05）. Conclusion Artemisinin has a protective effect on myocardial injury in Staphylococcus aureus/Escherichia coli‑induced sepsis in mice， and the mechanism may be related to improve myocardial mitochondrial function.

Graphical abstract

关键词

脓毒症 / 心肌损伤 / 青蒿素 / 心肌线粒体

Key words

Sepsis / Myocardial injury / Artemisinin / Myocardial mitochondria

脓毒症是宿主应对各种微生物及免疫原性物质侵入机体，引起全身炎症和免疫反应失调而危及生命的器官功能障碍综合征^［1］。其中，脓毒症心功能障碍的病死率高达70%~90%，是脓毒症的主要死因之一^［2］，脓毒症心肌功能障碍，常常表现为心肌抑制，心脏收缩及舒张功能受限、心脏扩大、射血分数改变等^［3］。其发生的潜在病理生理机制尚不明确，目前认为脓毒症心肌损伤的可能机制包括：病原体相关分子直接作用、基因调控、免疫调节作用、过量的一氧化氮产生、线粒体功能障碍、钙稳态障碍、心肌水肿等^［4］。心脏是富含线粒体的器官，心肌细胞收缩所需的能量主要由线粒体提供，线粒体损伤在脓毒症心肌损伤发病中的作用受到广泛关注。目前研究表明，线粒体功能障碍的多个方面，如线粒体结构异常、钙离子失衡、线粒体代谢异常、能量产生障碍、线粒体氧化应激增加、线粒体解偶联和质量控制系统紊乱、线粒体自噬等，都会导致脓毒症心脏功能障碍^［5，6］。

青蒿素（Artemisinin，ART）及其半合成衍生物是一组用于治疗疟疾的新型倍半萜内脂化合物，除了抗疟功能外，该化合物还具有强大的抗炎、抗氧化、免疫调节、抑制血管生成、抗癌等功效^［7］，对其治疗人类疾病的药物和机理进行的综述中提到，大量研究证实其对疟疾、癌症、病毒、细菌感染和心血管疾病的影响，表明青蒿素对细菌感染相关炎症性疾病具有潜在的疗效。Lin等^［8］的研究亦证实青蒿素对脓毒症相关神经炎症和认知功能障碍的保护作用。研究表明ART具有对心肌缺血再灌注及糖尿病心肌病大鼠的保护作用^［9，10］，然而未有青蒿素在脓毒症相关心肌功能障碍中的相关研究，其对于脓毒症相关心肌功能障碍作用目前并未明确。故而本实验通过构建不同菌种所致脓毒症小鼠模型，探讨不同浓度ART对不同菌种所致脓毒症小鼠心肌损伤的作用，并着重从心肌线粒体功能方面探讨其可能的作用机制，为脓毒症心肌损伤的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

青蒿素（批号：138673）购自MCE公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase‑myocardial band，CK‑MB）、心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ）检测试剂盒（批号：MU30025、MU30257）购自购自武汉贝莱茵生物科技公司。

1.2 主要仪器

L‑CM‑1524R低温离心机（北京兰杰柯科技有限公司）、HZQ‑F160全温度震荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、RM2235石蜡切片机（德国徕卡仪器有限公司）、TB‑718L生物组织包埋机（湖北泰维科技实业股份有限公司）、AMR‑100酶标分析仪（杭州奥盛仪器有限公司）、DM3000正置显微镜（德国徕卡仪器有限公司）、N‑SIMS透射电镜（尼康精机上海有限公司）、VINNO‑6LAB便携式小动物彩色多普勒超声成像系统（飞依诺科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 青蒿素混悬液的配置

无菌条件下，将50 mg ART溶于1 000 μL DMSO配置成母液A（母液浓度为50 mg/mL）。分别取母液A 60、120、180、240 μL加入DMSO至300 μL配置成母液1、2、3、4。保存在-80 ℃冰箱，使用时以2%母液（1、2、3、4、A）+98%PBS配置成（5、10、15、20、25 mg/kg）ART混悬液^［11］。

1.3.2 细菌制备

提前配置好LB培养基并保存在4 ℃冰箱中，确保培养基清亮无杂菌生长后，用灭菌处理的接种环，挑取小部分金黄色葡萄球菌或大肠埃希菌（由石河子大学第一附属医院微生物室惠赠）的菌落，接种到LB培养液中，在恒温条件下培养细菌24 h，离心将细菌与培养液分离并进行清洗后，再次离心，随后将细菌转移至100 mL无菌生理盐水瓶中，通过震荡使细菌在生理盐水中均匀分布，确保充分混合。使用比浊仪测定细菌悬液MCF值，视MCF＝1时，测得的细菌浓度为3×10⁸ CFU/mL，根据参考文献^{［12‑14］}及预试验结果，调整金黄色葡萄球菌浓度为9×10⁸ CFU/mL，调整大肠埃希菌浓度为为9×10⁷ CFU/mL，放置于4 ℃冰箱保存。

1.3.3 试验动物分组及模型制备

C57/BL（SPF级）雄性小鼠104只，体质量（25.51±2.26） g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证编号：SCXK（京）2024‑0001，实验鼠饲养于SPF级动物房，保持室内持续循环通风，温度20~25 ℃，相对湿度50%~70%。本实验已获得石河子大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准（编号A2023‑236‑01）。

将实验小鼠随机分为sham组、G+/G- sepsis组、G+/G- sepsis+ART不同剂量组（ART5、10、15、20、25+G+/G- sepsis），每组8只。

除假手术组外，其余各组给予小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌混悬液/大肠埃希菌混悬液（1 mL/只）构建G+/G-脓毒症小鼠模型。造模前12 h和造模时分别予以ART（5、10、15、20、25 mg/kg）300 μL灌胃构建革兰氏阳/阴性脓毒症+ART不同剂量组。假手术组予以等体积生理盐水注射/灌胃。术后2 h观察呼吸频率、心率、饮食、活动变化等，根据脓毒症小鼠评分判断脓毒症模型是否建立成功^［15］。

1.3.4 心肌组织H&E染色

颈椎脱臼法处死小鼠，取0.5 mm³心肌组织。样本置于4%多聚甲醛溶液，固定后进行切片、脱去蜡质、H&E染色、封片，在显微镜下仔细观察，以评估心肌组织的损伤情况。并进行Kishimoto scores组织学评分^［18］，具体如下：每张切片随机选取5个200倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死面积与整个视野面积比值：<25%计1分；25%~50%计2分；50%~75%计3分；>75%计4分，再计算5个视野平均积分值。

1.3.5 心肌酶学标志物检测

取各实验组超声检查后麻醉状态小鼠，固定后打开小鼠腹腔，用采血针从腹主动脉中抽取1 mL的血液，离心处理分离出血清部分，放置于-80 ℃的冰箱中保存，以备后续使用。按照试剂盒检测血清中心肌肌钙蛋白（cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（CK‑MB）水平。

1.3.6 小鼠心脏超声监测

各实验组小鼠在造模后第12小时腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，备皮后立即进行心脏超声检查评估各组小鼠的心脏功能^{［16，17］}。由心脏超声科专业人员使用探头进行M型超声心动图检测，对左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期容积（LVESV）、收缩末期内径（LVESD）进行测量。

1.3.7 透射电镜检测心肌线粒体损伤

取小鼠心肌组织，2.5%戊二醛固定、4 ℃冰箱保存，低温运输标本，处理后电子显微镜拍摄图像，每只小鼠心肌电镜图片在相同放大倍数下随机选择5个视野照相，观察线粒体的形态。采用Flameng评分^［19］对线粒体损伤的严重程度进行分级：线粒体结构完好、存在基质颗粒，记0分；线粒体结构完好，但不存在基质颗粒，记1分；线粒体肿胀，基质尚能分辨，记2分；线粒体肿胀、嵴凝集，记3分；线粒体内膜外膜丧失完整性、嵴断裂，呈现空泡状，记4分，再计算5个视野平均积分值。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 9软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以计量资料用均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，方差齐时，两两组间比较采用LSD法，方差不齐时，采用采用Tamhane检验分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ART对小鼠的一般情况影响

Sham组术后12 h存活，精神、进食及活动正常；G+/G- sepsis组小鼠死亡较多，术后12 h存活小鼠表现嗜睡、运动缓慢，出现呼吸急促、竖毛、脓尿，眼眶脓性分泌物，活动明显减少等表现。ART（5、10、15、20、25）+G+/G- sepsis各组存活数量及一般情况呈剂量依赖性，高剂量小鼠精神稍萎靡，活动正常，低剂量小鼠表现与G+/G- sepsis组相似；G+sepsis+25 mg/kg ART组全部存活，精神稍萎靡，活动正常，补充每组小鼠保证最终每组小鼠模型数量≥8只。

2.2 ART对脓毒症小鼠心肌组织形态学变化的影响

小鼠心肌H&E染色结果显示，Sham组心肌纤维排列整齐，染色均匀，未见心肌纤维间隙明显增大，组织未见心肌肥大细胞；G+/G- sepsis组心肌纤维间隙增大，间质可见轻微脂肪变性，组织间质可见淤血，可见炎症细胞浸润（黑色箭头示）；ART（5、10、15、20、25）+G+/G- sepsis各组可见心肌组织偶见炎症细胞浸润（图1）。

ART各剂量组心肌组织病理学评分与G+/G- sepsis组相比具有统计学意义（P<0.05），且呈剂量依赖相关性，G+sepsis组与G- sepsis组相比无统计学意义。

2.3 ART对脓毒症小鼠心肌损伤酶学标志物的影响

与Sham组相比，G+/G- sepsis组CK‑MB、cTnⅠ明显升高（P<0.05）；与G+/G- sepsis组相比，ART（5、10、15、20、25）+G+/G- sepsis各组小鼠血清CK‑MB、cTnⅠ水平均呈下降趋势，差异具有统计学意义（P<0.05），见图2；上述结果表明ART减轻脓毒症心肌损伤呈剂量依赖性，G+sepsis组与G- sepsis组相比无统计学意义。

2.4 ART对脓毒症小鼠心脏功能的影响

与sham组相比，G+/G- sepsis组LVEF和LVFS下降（P<0.05）；与G+/G- sepsis组相比，ART25+G+/G- sepsis组LVEF和LVFS升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；在G+/G‑ sepsis组中观察到舒张功能指标LVESV与空白组相比有统计学意义（P<0.05），其余舒张功能指标均无统计学意义；G+ sepsis组与G- sepsis组相比无统计学意义，见图3。

2.5 ART对脓毒症小鼠心肌细胞线粒体形态的影响

利用透射电子显微镜来细致观察并评估各组小鼠心肌细胞内线粒体的损伤程度，在Sham组中，通过电镜可以清晰地看到心肌线粒体的双层膜结构以及嵴结构都排列得十分整齐，且整体形态饱满，在G+/G- sepsis组中，线粒体的形态发生了显著变化，具体表现为外膜出现破裂，线粒体嵴结构也呈现出了溶解和断裂的现象，甚至出现了空泡样的改变，线粒体损伤评分较高（P<0.05）；ART25+G+/G- sepsis组线粒体损伤较轻，镜下可见大部分线粒体结构正常，仅部分线粒体膜和嵴结构破坏，评分较脓毒症组下降（P<0.05）；G+sepsis组与G-sepsis组线粒体评分相比无统计学意义，见图4。

3 讨论

脓毒症是因病原微生物侵入人体无菌部位引起的人体免疫反应失调，导致全身炎症反应、多器官功能损害的临床综合征^［1］。据统计脓毒症相关死亡占全球所有死亡人数的19.7%，在全球范围内，脓毒症仍然是损害健康的主要问题^［20］。其中40%~50%的脓毒症患者并发有心肌损伤，血液循环受阻，进而出现休克，是脓毒症死亡的重要危险因素，目前尚无特异性治疗方法^［21］，迫切需要脓毒症的新药和特异性的治疗方法。脓毒症这一炎症反应失调引起的器官功能障碍疾病，长期以来一直接受中草药治疗，并取得了良好的治疗效果，中草药的抗炎、免疫调节作用为脓毒症治疗提供了新思路^［22］，明确其作用机制及作用靶点，有助于脓毒症器官功能障碍的特异性治疗。

ART是由屠呦呦团队从中草药青蒿中分离出来的倍半萜类化合物，近年来，ART被广泛用于治疗疟疾，对ART的进一步研究发现，这一药物及其衍生物不但可以治疗疟疾，还在抗炎、调节免疫功能、抗肿瘤抗等多个方面有显著作用^［7］，研究表明ART对心肌缺血再灌注的保护作用^［9.23］，亦有研究表明其衍生物双氢青蒿素能够改善糖尿病心肌病大鼠心脏功能^［10］，青蒿素类药物通过炎症因子释放发挥对多种免疫炎性疾病的治疗作用^［24］，张红等^［25］的研究中已表明青蒿素对内毒素所致全身炎症反应综合征小鼠具有保护作用，研究表明青蒿素通过激活AMPKα1通路显著抑制促炎细胞因子的表达改善与脓毒症相关的神经认知缺陷^［8］。

综上，ART可改善其他心脏疾病或脓毒症，但其对于脓毒症心肌损伤的作用及机制尚未有文献报道，本研究选用ART干预不同细菌所致脓毒症损伤模型，研究其对于脓毒症心肌损伤的作用及机制。血清cTnⅠ、CK‑MB是诊断脓毒症心肌损伤的常用指标^［26］，脓毒症心肌损伤时，肌纤维损伤cTnⅠ释放入血，线粒体损伤，ATP生成障碍，CK‑MB增多，本研究中与sham组相比，G+/G- sepsis模型组血清cTnⅠ、CK‑MB升高，进一步结合心肌病理HE染色呈现的心肌纤维损伤，间隙增宽，间质血管充盈，心肌细胞间炎症细胞浸润表现，表明经G+/G-细菌干预造模后小鼠出现明显脓毒症心肌损伤，造模成功。而给予不同剂量ART干预后，CK‑MB、cTnⅠ水平呈浓度依赖式下降，25 mg/kg ART干预组接近空白组水平，病理H&E染色可见炎症浸润较少，未见血管充盈，肌纤维排列整齐，间隙正常，组织病理学评分呈浓度依赖式下降，表明ART随浓度梯度升高可有效逆转脓毒症心肌损伤，减轻炎症细胞浸润。

既往实验和临床研究表明，脓毒症心肌损伤时，表现为左室功能障碍，左心室收缩力降低^{［27，28］}，进而血液循环受阻，出现心源性休克，加重循环衰竭。为了确定青蒿素对脓毒症所导致的心功能损伤是否具有改善作用，本研究在建模后的12 h麻醉小鼠后采用心脏超声技术评估小鼠的心脏功能状态。LVEF是衡量左心室在收缩期泵出血液效率的一个重要指标，而LVFS则能够反映左心室心肌在收缩过程中的收缩力度。在本研究中，G+/G-细菌干预脓毒症小鼠模型组，表现为LVEF（%）和LVFS（%）降低，与既往结果一致，其余舒张功能指标未见明显变化，表明G+/G-细菌干预后出现脓毒症心肌功能障碍，而ART 25 mg/kg干预组左室收缩功能指标LVEF（%）和LVFS（%）较脓毒症组改善，说明青蒿素干预可有效改善脓毒症心肌收缩功能障碍，从而对脓毒症心肌损伤起到保护作用。

脓毒症心肌病的发病机制尚不明确，目前认为脓毒症心肌损伤的可能机制包括：心肌炎性损伤、线粒体能量代谢及功能紊乱、钙循环失调、免疫调节作用、心肌肾素‑血管紧张素系统功能异常、心肌细胞凋亡等方面^［29-31］，这些机制彼此独立又相互影响，共同影响着疾病的发生与发展。线粒体是心肌主要能量来源，心脏线粒体功能障碍的多个方面，如代谢异常、能量产生障碍、氧化应激反应过度以及线粒体自噬障碍，都会导致脓毒症心脏功能障碍^{［3，6，32］}。脓毒症心肌损伤时，表现为线粒体肿胀、外膜破裂，嵴断裂、稀疏、空泡化、杂乱无章^［33］。本研究中，G+/G-细菌脓毒症模型组线粒体破坏显著，而ART 25 mg/kg干预组线粒体损伤较脓毒症模型组明显改善、Flameng评分较低，表明青蒿素可改善G+/细菌所致线粒体损伤。

本研究中，G+/G-细菌所致脓毒症组之间差异均无统计学意义，这与既往研究所呈现的G+细菌脓毒症炎症反应略强于G-细菌脓毒症反应不同，可能是由于造模方式、细菌剂量、时间以及检测方式的差异相关。

综上所述，本研究发现，青蒿素以剂量依赖方式减轻脓毒症心肌损伤，青蒿素可能通过减轻线粒体损伤，保障能量代谢，改善患者心脏收缩功能。因此，青蒿素可能成为治疗脓毒症心肌损伤患者潜在的治疗。脓毒症心肌损伤中是多种因素参与的复杂过程，青蒿素作为一种新的治疗脓毒症心肌损伤的药物，其具体机制值得进一步研究。

作者贡献度说明：

张琪：文章设计构思、实施和撰写；赵长甲、姜波、薛庆：实验实施，数据处理；许航、任珊：论文整体审阅和指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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