萆薢分清饮对急性痛风性关节炎大鼠NF⁃κB/NLRP3信号通路的影响

Effect of Bixie Fenqing Decoction on NF⁃κB/NLRP3 signaling pathway in rats with acute gouty arthritis

摘要

目的 探讨萆薢分清饮对急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）模型大鼠的影响及作用机制。 方法 雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、萆薢分清饮组（23.33 g/kg）、秋水仙碱组（0.3 mg/kg），每组10只，预防性给药，每日1次，连续7 d。灌胃给药第5天，空白组除外，踝关节注射单钠尿酸盐混悬液制备AGA模型。造模后测定踝关节肿胀度、步态评分及炎症指数评分；H&E染色观察踝关节滑膜组织病理学变化，ELISA法测定血清炎性因子及ROS水平；生化法测定血清MDA、GSH水平，SOD、CAT活性；实时荧光定量 PCR 测定踝关节滑膜组织NLRP3、ASC mRNA表达水平；Western blot检测NF⁃κB/NLRP3通路相关蛋白表达。 结果 与空白组比较，模型组大鼠踝关节明显肿胀（P<0.01），步态评分和炎症指数评分显著增加（P<0.01），H&E染色滑膜组织增生，大量炎性细胞浸润，组织病理评分升高（P<0.01），血清IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α、ROS及MDA水平升高（P<0.05），SOD、GSH、CAT水平降低（P<0.01），滑膜组织NLRP3、ASC mRNA表达及p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase⁃1蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，萆薢分清饮组踝关节肿胀度、步态评分及炎症指数评分显著降低（P<0.05），滑膜组织增生与炎性细胞浸润减轻，组织病理评分降低（P<0.01），血清IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α及ROS、MDA水平显著降低（P<0.05），SOD、GSH水平升高（P<0.01），滑膜组织NLRP3、ASC mRNA表达及p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase⁃1蛋白表达水平降低（P<0.05）。 结论 萆薢分清饮可能通过抑制AGA大鼠NF⁃κB/ NLRP3信号通路改善炎症状态。

Abstract

Objective To explore the therapeutic impact and mechanism of Bixie Fenqing Decoction on acute gouty arthritis （AGA） model rats. Methods Male SD rats were randomly assigned to the blank group， model group， Bixie Fenqing Decoction group （23.33 g/kg） and colchicine group （0.3 mg/kg），10 rats per group. The rats received preventive treatment daily for a period of 7 days. On the 5th day of gavage， the AGA model was induced by injecting monosodium urate suspension into ankle except the blank group. The swelling degree， gait and inflammatory index score of ankle joint were measured after modeling. The histopathological changes of ankle synovium were examined using H&E staining， the levels of serum inflammatory factors and ROS were detected by ELISA. Serum MDA and GSH levels， SOD and CAT activities were detected by biochemical method. Real⁃time fluorescence quantitative PCR was used to detect NLRP3 and ASC mRNA expression levels within the ankle synovial tissue. The expression of related proteins in the NF⁃κB/NLRP3 pathway was detected by Western blot. Results In contrast to the blank group， ankle joint of rats in the model group exhibited markedly increased swelling （P<0.01）， demonstrated notably higher scores in both gait assessment and inflammatory indices（P<0.01）. After H&E staining， synovial tissue hyperplasia was prominently observed， a large amount of inflammatory cell infiltrated， and histopathological scoring indicated an increase（P<0.01）. The levels of IL⁃6， IL⁃1β， TNF⁃α， ROS， and MDA in serum were increased （P<0.05）， SOD， GSH， and CAT were decreased （P<0.01）. In the synovial tissue， there was a upregulation of NLRP3 and ASC mRNA， and increased expression of p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65， NLRP3， ASC and cleaved Caspase⁃1 protein （P<0.01）. Compared to the model group， ankle swelling， gait score and inflammatory index score in the Bixie Fenqing Decoction group were significantly decreased （P<0.05）， synovial tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration were decreased， and histopathologic score were decreased （P<0.01）. Serum IL⁃1β， IL⁃6， TNF⁃α， ROS and MDA were significantly decreased （P<0.05）， SOD and GSH levels were increased （P<0.01）. mRNA expressions of NLRP3 and ASC and protein expression levels of p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65， NLRP3， ASC， and cleaved Caspase⁃1 were decreased in synovial tissues （P<0.05）. Conclusion The Bixie Fenqing Decoction may exert its anti⁃inflammatory effects in AGA rats through inhibiting the NF⁃κB/ NLRP3 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

萆薢分清饮 / 急性痛风性关节炎 / 核因子⁃κB / NLRP3炎症小体

Key words

Bixie Fenqing Decoction / Acute gouty arthritis / NF⁃κB / NLRP3 inflammasome

痛风性关节炎是一种由于嘌呤代谢紊乱，关节滑囊、滑膜、软骨等部位沉积尿酸盐晶体而引起的关节及周围软组织的炎症反应^［1］。中国成人痛风患病率约3.2%^［2］。急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）作为痛风初期表现，典型特性包括关节红、肿、热、痛及活动受限^［3］，严重影响患者生活质量。非甾体类抗炎药、秋水仙碱、糖皮质激素类药物通过抑制炎症发挥治疗作用，但长期使用该类药物可能会对中枢神经系统、消化系统及肝肾功能等造成损伤^［4］。中医药在治疗痛风方面显示出广阔的应用前景。萆薢分清饮出自程钟龄《医学心悟》，具有利湿清热，分清化浊之功效^［5］。临床应用萆薢分清饮治疗AGA疗效显著，该方可显著改善痛风性关节炎患者关节肿痛等症状^［6］。前期研究发现该方可改善高尿酸血症小鼠肠道炎症^［7］，减轻高尿酸血症小鼠肾脏炎症与纤维化^［8］。但目前对于萆薢分清饮治疗痛风性关节炎的基础研究较少，本研究通过给予大鼠踝关节注射尿酸钠（monosodium urate，MSU）建立AGA模型，观察萆薢分清饮对其炎性损伤及核因子⁃κB （NF⁃κB）/NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）信号通路的影响，探讨萆薢分清饮治疗AGA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠，体重160~200 g，8周龄，合格证号SCXK（豫）2019⁃0002。于河南中医药大学实验动物中心饲养（许可证号SYXK豫 2021⁃0015）。研究实验方案通过河南中医药大学动物福利伦理委员会审核批准（伦理审批号：IACUC⁃202404023）。

1.1.2 实验药物及制备

萆薢分清饮由萆薢20 g，石菖蒲、莲子心各6 g，茯苓、白术、黄柏各10 g，丹参、车前子各15 g组成，所用中药饮片均购自河南中医药大学第一附属医院。萆薢分清饮中药饮片于蒸馏水中浸泡30 min，6倍水大火煎至沸腾，文火煎煮1 h过滤。3倍水继续煎煮滤渣30 min，过滤。将2次煎液混合，浓缩至2 g/mL，4 ℃下保存。秋水仙碱片（0.5 mg/片，西双版纳药业有限责任公司，H53021369），尿酸钠（上海源叶生物科技有限公司，1198⁃77⁃2）。将尿酸钠盐加至生理盐水中加热溶解，制成MSU晶体混悬液（50 g/L），4 ℃保存备用。

1.1.3 实验试剂

大鼠白介素1β（IL⁃1β）ELISA试剂盒（RD，DRE20024）；大鼠白介素⁃6（IL⁃6）、大鼠肿瘤坏死因子α（TNF⁃α）、大鼠活性氧（ROS）ELISA试剂盒（上海源桔生物科技中心，YJ102828、YJ002859、YJ926281）；微量还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、总超氧化物岐化酶（T⁃SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所，A006⁃2⁃1、A003⁃1⁃2、A001⁃1⁃2），过氧化氢酶活性检测试剂盒（CAT） （北京索莱宝生物科技有限公司，BC0205）。BCA蛋白定量试剂盒（KGP902）；NF⁃κB p65、磷酸化的核因子⁃κB p65（p⁃NF⁃κB p65）（Cell Signaling Technology， 8242、3033）；NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶⁃1（Caspase⁃1）、β⁃actin、Goat Anti⁃Mouse IgG H&L（HRP）、Goat Anti⁃Rabbit IgG H&L（HRP）购自Abcam公司（ab263899、ab286125、ab8226、ab205719、ab6721）；凋亡相关斑点样蛋白（ASC）（武汉三鹰生物技术有限公司，67494⁃1⁃Ig）；引物序列均由上海生工合成。

1.1.4 实验仪器设备

超低温冰箱（FORMA 700，美国Thermo公司）；低温高速离心机（3K15，Sigma公司）；超纯水仪（Direct⁃Q with pump，Millipore公司）；石蜡包埋、切片机（德国LEICA公司）；全自动样品冷冻研磨仪（JXFSTPRP⁃CL，上海净信实业发展有限公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；实时荧光定量PCR仪（ABI 7500型，美国应用生物系统公司）；Western blot系统（Criterion™电泳槽，Trans⁃Blot^®转印槽，Bio⁃Rad 公司）；超微量分光光度计（Nanodrop 2000，Thermo fisher公司）；发光成像工作站（Tanon 5200，Tanon 公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组、造模及给药

将40只雄性SD大鼠按数字表随机分为空白组、模型组、萆薢分清饮组、秋水仙碱组，每组10只。根据药理实验动物与人体等效剂量换算方法^［9］，每天给予秋水仙碱组0.3 mg/kg，萆薢分清饮组23.3 g/kg相应药物，空白和模型组灌胃相同体积生理盐水，连续7 d给药，给药第5天，参照文献［10］制备AGA模型：在大鼠右后踝关节进行穿刺，将针尖与胫骨呈45 ℃斜刺入关节腔，除空白组外，其余大鼠注射0.1 mL MSU混悬液，空白组注射0.1 mL无菌NaCl溶液，大鼠对侧关节腔明显膨胀，肉眼观察到关节部位出现红肿，局部温度升高及活动能力受限表明造模成功^［11］。

1.2.2 大鼠踝关节肿胀度

造模前后，分别于2、8、24、48 h用游标卡尺对大鼠右后踝关节相同位置直径进行测量，重复3次得到平均值，踝关节肿胀度（mm）=造模后关节直径-造模前关节直径^［12］。

1.2.3 大鼠步态评分及炎症指数评分

造模后24 h，按照Coderre步态评定准则，对大鼠进行步态评分：步态无异常，双脚着地为0分；右膝关节微微弯曲，轻微跛行为1分；右下肢接触地面，中度跛行为2分；右下肢完全离开地面，三脚行走为3分^［10］。

炎症指数评分：0级：关节正常为0分；1级：皮肤轻微发红肿胀为1分；2级：关节部位有明显红肿为2分；3级：关节外明显红肿为3分^［13］。

1.2.4 H&E染色观察大鼠踝关节组织病理学变化

取大鼠右踝关节组织，多聚甲醛（4%）中固定24 h，进行脱钙、脱水浸蜡处理，包埋于石蜡中制作切片（5 μm），脱水后H&E染色。光学显微镜下观察滑膜组织病理变化，根据炎性细胞浸润情况进行病理评分：1分，无炎性细胞浸润；2分，最小浸润（1%~10%）；3分，轻度浸润（11%~30%）；4分，中度浸润（31%~60%）；5分，强浸润（61%~100%）^［14］。

1.2.5 ELISA法检测大鼠外周血 IL⁃6 、IL⁃1β、TNF⁃α炎性因子及ROS表达水平

末次给药2 h后，腹主动脉采血。依照ELISA说明书检测各组血清IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α及ROS含量。

1.2.6 大鼠血清氧化应激水平检测

按照各试剂盒说明书检测血清SOD、MDA、GSH、CAT水平。

1.2.7 大鼠踝关节滑膜组织NLRP3、ASC mRNA表达检测

取各组踝关节滑膜组织样本6个，将适量Trizol加入组织样本中，剪碎、匀浆处理后离心，提取总RNA。取2 μL溶液样品，用Nanodrop 2000测定mRNA浓度和纯度。取总RNA 2 μL作为模板，按照试剂盒说明配置总体积20 μL的逆转录反应体系。将该反应体系置于PCR仪中，25 ℃反应5 min，46 ℃反应20 min，95 ℃反应1 min，共40个循环。实验数据采用2^-ΔΔCt法分析。所用引物见表1。

1.2.8 Western blot法检测大鼠滑膜组织NF⁃κB p65、p⁃NF⁃κB p65、NLRP3、ASC、pro Caspase⁃1、cleaved Caspase⁃1相关蛋白表达

各组取6只踝关节滑膜组织样本，剪碎，加入RIPA裂解液处理，4 ℃条件下12 000×g转速离心5 min，收取上清液获得总蛋白；BCA法测定蛋白浓度，100 ℃下加热10 min致使蛋白变性；通过SDS⁃PAGE凝胶电泳分离蛋白质1 h，转移到PVDF膜上后在5%脱脂牛奶中封闭1 h，之后加入适当比例的一抗（NF⁃κB p65、p⁃NF⁃κB p65、NLRP3、Caspase⁃1，稀释比例1∶1 000；ASC 1∶5 000） 4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。加入HRP标记的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗（1∶1 000）室温孵育1 h 后洗膜3次。加入化学发光试剂，使用Tanon 6600发光成像系统检测，以β⁃actin作为内参，Image Pro Plus 6.0 对蛋白相对表达量进行分析，公式为目的蛋白/内参蛋白灰度值。

1.3 统计学处理

SPSS 26.0软件进行数据分析。数据呈正态分布，采用重复测量方差分析或单因素方差分析进行多组间比较，方差齐性检验用LSD⁃t，方差不齐检验用Dunnet T3；不符合正态分布，采用非参数检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 萆薢分清饮对AGA大鼠踝关节肿胀度的影响

与空白组比较，造模后2 h模型组大鼠踝关节明显肿胀（P<0.01）；与模型组比较，造模后48 h萆薢分清饮组、秋水仙碱组踝关节肿胀度降低（P<0.01）。见表2。

2.2 萆薢分清饮对AGA大鼠步态评分和炎症指数评分的影响

造模后48 h，空白组大鼠关节无肿胀，步态正常；与空白组比较，模型组大鼠步态评分、炎症指数评分均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，萆薢分清饮组、秋水仙碱组步态评分及炎症指数评分降低（P<0.05），见表3。

2.3 萆薢分清饮对AGA大鼠踝关节组织病理学的影响

空白组大鼠关节滑膜结构完整，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠关节腔内滑膜细胞明显增生，大量炎性细胞浸润。萆薢分清饮组、秋水仙碱组炎性细胞浸润程度得到改善。模型组大鼠踝关节滑膜组织评分高于空白组（P<0.01）；萆薢分清饮组和秋水仙碱组大鼠踝关节滑膜组织病理评分均显著低于模型组（P<0.01）。见图1，表4。

2.4 萆薢分清饮对AGA大鼠血清 IL⁃6、IL⁃1β 和TNF⁃α的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清IL⁃6、IL⁃1β和TNF⁃α水平升高（P<0.05）；与模型组比较，萆薢分清饮组和秋水仙碱组大鼠血清IL⁃6、IL⁃1β和TNF⁃α水平降低（P<0.05）。见表5。

2.5 萆薢分清饮对AGA大鼠血清氧化应激影响

与空白组比较，模型组大鼠血清ROS、MDA水平升高（P<0.05），SOD、CAT、GSH水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，萆薢分清饮组、秋水仙碱组血清ROS、MDA显著降低（P<0.01），SOD、GSH水平显著升高（P<0.01），萆薢分清饮组CAT活性无统计学差异（P>0.05）。见表6。

2.6 萆薢分清饮对AGA大鼠踝关节滑膜组织NLRP3、ASC mRNA表达影响

与空白组比较，模型组大鼠踝关节滑膜组织NLRP3、ASC mRNA表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，萆薢分清饮组、秋水仙碱组NLRP3、ASC mRNA表达显著降低（P<0.01）。见表7。

2.7 萆薢分清饮对AGA大鼠踝关节滑膜组织NF⁃κB p65、p⁃NF⁃κB p65、NLRP3、ASC、pro Caspase⁃1、cleaved Caspase⁃1蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠踝关节滑膜组织p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase⁃1蛋白水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，萆薢分清饮组及秋水仙碱组大鼠踝关节滑膜组织p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase⁃1蛋白水平降低（P<0.05）。见图2，表8。

3 讨论

痛风性关节炎隶属中医“痹证”“痛风病”“白虎风”“历节病”范畴^［15］。国医大师朱良春认为本病多由浊瘀痹阻经脉引起^［16］。痛风急性发作期多为实证，以湿热蕴结、痰瘀阻滞证常见，治以清热利湿，通络止痛。现代医学认为，AGA是尿酸钠微结晶引起的炎症反应^［17］。在本研究中，采用大鼠踝关节注射MSU的经典造模方法制备AGA模型，发现造模2 h后大鼠患侧肢体出现踝关节肿胀，与既往研究结果一致^［18］。

萆薢分清饮由川萆薢、石菖蒲、黄柏、车前子、茯苓、白术、丹参、莲子心组成，方中萆薢、石菖蒲化浊除湿，黄柏、车前子清热祛湿，利下焦湿热，白术、茯苓健脾祛湿，丹参活血化瘀、消肿止痛，莲子心通心清热。现代研究显示，萆薢中有效成分萆薢总皂苷、丹参减少炎性因子分泌发挥抗炎镇痛作用^{［19， 20］}，黄柏具有多种潜在的抗痛风活性成分^［21］，车前子抑制黄嘌呤氧化酶活性控制尿酸生成^［22］，白术、茯苓是健脾祛湿的常用药，通过调节肠⁃肾途径促进尿酸排泄^［23］，石菖蒲、莲子心中黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化作用^{［24，25］}。全方清热解毒、利湿去浊、活血止痛，治疗AGA疗效颇佳^［5］。

急性痛风性关节炎患者由于关节肿痛，常表现为活动受限、异常步态。本研究发现AGA模型组大鼠关节肿胀度增加，步态评分和炎症指数评分相应升高。前期预实验结果表明萆薢分清饮中剂量组较之高、低剂量组可更有效缓解AGA大鼠踝关节肿胀程度，故本实验选取中剂量组进行萆薢分清饮抗AGA炎症反应的实验设计。实验结果显示萆薢分清饮可显著改善AGA大鼠关节肿胀度、步态评分和炎症指数评分，减轻滑膜细胞增生及炎性细胞浸润。研究发现，MSU晶体沉积会诱导IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α等炎性细胞因子大量分泌，促进痛风性关节炎急性发展^［26］。与前人研究结果一致，本研究中，AGA模型大鼠血清IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α含量增加，萆薢分清饮可显著降低AGA大鼠炎症因子水平，提示萆薢分清饮可减轻AGA大鼠炎症反应。氧化应激是机体氧化与抗氧化作用失衡引发的机体应激反应，可在炎症因子刺激下激活^［27］。炎症部位巨噬细胞吞噬MSU释放大量ROS，机体产生相应的抗氧化机制，SOD、CAT、GSH等多种酶参与，抑制氧化应激可有效改善痛风疼痛和炎症反应^［18］。本研究结果显示，萆薢分清饮升高AGA大鼠血清SOD、GSH水平，降低ROS、MDA含量，提示萆薢分清饮可有效减轻AGA大鼠氧化应激损伤，提高抗氧化能力。以上结果共同提示萆薢分清饮对AGA大鼠抗炎抗氧化作用。

NF⁃κB/NLRP3通路在痛风性关节炎中起着核心作用。MSU可增加NF⁃κB的抑制蛋白IκBα磷酸化水平，进一步促进NF⁃κB磷酸化^［28］，并刺激NF⁃κB和p65易位到细胞核内^［29］。被激活的NF⁃κB诱导NLRP3基因表达，NLRP3结合ASC形成炎症小体，裂解pro caspase⁃1形成cleaved caspase⁃1，刺激多种促炎因子释放，导致急性痛风性关节炎发作^［30］。本研究结果表明萆薢分清饮可显著抑制大鼠踝关节滑膜组织NLRP3和ASC mRNA表达，抑制踝关节滑膜组织p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65、NLRP3、ASC和cleaved Caspase⁃1蛋白水平，提示萆薢分清饮可能通过抑制NF⁃κB/NLRP3通路调节AGA炎症反应。

综上，萆薢分清饮能有效改善AGA炎症进展，提高大鼠抗氧化应激能力，其机制可能与其抑制NF⁃κB/NLRP3信号通路控制下游炎症因子释放有关。

作者贡献度说明：

张靖：实验操作、数据分析、论文撰写；韩真真、王思宇：实验操作；苏培培、邵灿灿：技术支持及指导；李晓冰、郭洪涛、何小鹃：实验设计及论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82274342)

河南省中医药传承与创新人才工程（仲景工程）中医药学科拔尖人才项目(CZ0325⁃13)

河南省中医药科学研究专项项目(2023ZXZX1145)

河南省卫生健康委国家中医临床研究基地科研专项(2022JDZX091)

河南省科技攻关项目(252102311259)