益肺通络方对肺纤维化模型大鼠IL‑17A影响的研究

Effect of Yifei Tongluo Formula regulating IL‑17A on pulmonary fibrosis model rats

摘要

目的 通过博来霉素气管滴入法构建肺纤维化动物模型，探讨益肺通络方对模型大鼠IL‑17A的影响。 方法 采用博来霉素气管滴入法构建SD大鼠肺纤维化模型，随机分为：空白对照组、模型组、强的松组、益肺通络方低剂量组和益肺通络方高剂量组，分别给予对应的干预，共干预14 d，取大鼠血清和肺组织做检测。通过肺组织形态学观察、MicroCT影像学观察、H&E染色及Masson染色评估大鼠肺纤维化程度，通过免疫组化分析α‑平滑肌肌动蛋白（α‑smooth muscle actin， α‑SMA）和波形蛋白（vimentin protein， Vimentin）等肺纤维化相关蛋白表达，通过免疫荧光检测IL‑17A等信号分子表达，通过ELISA检测大鼠血清羟脯氨酸（hydroxyproline， HYP）分泌水平及测定细胞因子IL‑17A含量，通过PCR检测IL‑17A mRNA相对表达，Western blot检测IL‑17A蛋白表达。 结果 大鼠肺组织形态观察显示益肺通络方对大鼠双肺外观、颜色、肺叶轮廓、体积弹性有明显改善作用。胸部MicroCT影像学观察显示益肺通络方能够减轻大鼠肺部炎症程度、改善纤维化征象表现。大鼠肺组织HE染色显示益肺通络方可以减轻肺组织炎症细胞浸润等病理特征。大鼠肺组织Masson染色显示益肺通络方能够改善肺组织纤维细胞和组织增生。免疫组化结果显示与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织α‑SMA、Vimentin平均阳性面积占比明显升高（P<0.05）；与模型组相比，益肺通络方组大鼠肺组织α‑SMA平均阳性面积占比均明显降低（P<0.01），尤其在高剂量益肺通络方干预后大鼠肺组织Vimentin平均阳性面积占比明显降低（P<0.05）。免疫荧光图像显示与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织IL‑17A荧光强度高，在益肺通络方干预后荧光强度明显降低。ELISA结果显示与空白对照组相比，模型组大鼠HYP、IL‑17A含量明显升高（P<0.05）；与模型组相比，益肺通络方组大鼠上述细胞因子含量均明显降低（P<0.05）。PCR结果显示与空白对照组相比，模型组大鼠明显上调IL‑17A mRNA相对表达（P<0.05）；与模型组相比，益肺通络方组大鼠IL‑17A mRNA相对表达明显减少（P<0.05）。Western blot检测结果显示与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织IL‑17A蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组相比，益肺通络方可明显抑制上述蛋白表达（P<0.05）。 结论 益肺通络方对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠具有保护作用。益肺通络方可能通过下调IL‑17A分泌改善大鼠肺纤维化。

Abstract

Objective To explore the effect of Yifei Tongluo Formula on regulating IL‑17A in the model rats， constructing an animal model of pulmonary fibrosis using bleomycin tracheal instillation method. Methods SD rat pulmonary fibrosis model was constructed using bleomycin tracheal instillation method， and randomly divided into the control group， the model group， the prednisone group， the low‑dose Yifei Tongluo Formula group， and the high‑dose Yifei Tongluo Formula group. Corresponding interventions were given for 14 days， and rat serum and lung tissue were taken for testing. The degree of pulmonary fibrosis in rats was evaluated by morphological observation of lung tissue， MicroCT imaging observation， H&E staining， and Masson staining. Immunohistochemistry was used to analyze the expression of pulmonary fibrosis related proteins such as α‑smooth muscle actin （α‑SMA） and vimentin protein （Vimentin）. Immunofluorescence was used to detected IL‑17A and other signaling molecule expressions. ELISA was used to detect the secretion level of hydroxyproline （HYP） in rat serum and the content of cytokines such as IL‑17A. PCR was used to detect the relative expression of IL‑17A mRNA. Western Blotting was used to detect the expression of IL‑17A protein. Results Observation of the morphology of rat lung tissue shows that Yifei Tongluo Formula has a significant improvement effect on the appearance， color， lung lobe contour， and volume elasticity of both lungs in rats. Observation of chest MicroCT imaging showed that Yifei Tongluo Formula can reduce the degree of lung inflammation and improve fibrosis symptoms in rats. H&E staining of rat lung tissue showed that Yifei Tongluo Formula can alleviate pathological features such as inflammatory cell infiltration in lung tissue. Masson staining of rat lung tissue showed that Yifei Tongluo Formula can improve fibrosis and tissue proliferation in lung tissue. The immunohistochemical results showed that compared to the control group， the average positive area of α‑SMA and Vimentin in the lung tissue of the model group rats was significantly increased （P<0.05）. Compared to the model group， the average positive area of α‑SMA in the lung tissue of rats in the Yifei Tongluo Formula group was significantly reduced （P<0.01）， especially after high‑dose Yifei Tongluo Formula intervention， the average positive area of Vimentin in the lung tissue of rats was significantly reduced （P<0.05）. Immunofluorescence images showed that compared to the control group， the IL‑17A fluorescence intensity in the lung tissue of the model group rats was higher， and the fluorescence intensity was significantly reduced after intervention Yifei Tongluo Formula. The ELISA results showed that compared to the control group， the HYP and IL‑17A levels in the model group rats were significantly increased （P<0.05）. Compared to the model group， the levels of the above‑mentioned cytokines in the Yifei Tongluo Formula group of rats were significantly reduced （P<0.05）. The PCR results showed that compared to the control group， the model group rats significantly upregulated the relative expression of IL‑17A mRNA （P<0.05）. Compared to the model group， the relative expression of IL‑17A mRNA in the Yifei Tongluo Formula group rats was significantly reduced （P<0.05）. The Western blot test results showed that compared to the control group， the expression of IL‑17A protein in the lung tissue of the model group rats was significantly increased （P<0.05）. Compared to the model group， Yifei Tongluo Formula could significantly inhibit the expression of IL‑17A protein （P<0.05）. Conclusion Yifei Tongluo Formula has a protective effect on bleomycin induced pulmonary fibrosis in rats. Yifei Tongluo Formula may improve rat pulmonary fibrosis by downregulating IL‑17A.

Graphical abstract

关键词

肺纤维化 / 益肺通络方 / IL‑17A / 实验研究

Key words

Pulmonary fibrosis / Yifei Tongluo Decoction / IL‑17A / Experimental study

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis， IPF）是一种病因不明，慢性进行性纤维化性间质性肺炎^［1］，患病率为7~1 650人/10万，发病率随着年龄的增长急剧增加^［2］，死亡率高，诊断后预期寿命为2~3年^［3］。然而，目前只有尼达尼布和吡非尼酮两种药物被批准用于肺纤维化治疗，而且这些药物只能部分延缓疾病进展^［4］。因此，明确IPF的发病机制和开发有效的治疗手段，依此来改善患者的生活质量并减轻社会的疾病负担刻不容缓。中医药具有多成分、多靶点、多通路的独特优势，临床防治IPF疗效显著^［5，6］，多根据患者的症状和体征依照“肺痿”和“肺痹”辨证论治^［7］。其病机可概括为“正气亏虚、痰浊交阻、血瘀络痹”，治则治法不离补气、化痰和活血。益肺通络方以此立法组方，整方以生脉散进行加减，全方阴阳共调，精准切中肺纤维化“痰、瘀、虚”的病机，但目前尚缺乏益肺通络方对IPF作用方面的研究。

自身免疫是IPF的显著病理特征，尤其是Th17细胞免疫，在组织炎症和组织纤维化过程中均参与并发挥作用^［8］。白细胞介素‑17A（interleukin‑17A， IL‑17A）是Th 17细胞分泌的主要细胞因子，其能够促进中性粒细胞的聚集、上调促炎细胞因子如IL‑6和IL‑1β的水平^［9］；可以诱导上皮细胞‑间充质转化，刺激成纤维细胞和纤维细胞，并抑制自噬，加速肺纤维化进程^［10］。临床研究发现，B细胞活化因子在IPF患者的肺泡灌洗液中增加，促进Th17细胞释放IL‑17A，参与博来霉素（bleomycin， BLM）引起的肺纤维化^［11］，表明IL‑17A与促纤维化效应密切相关。因此，从IL‑17A着手，探究其潜在的药物治疗新靶点对治疗IPF至关重要。

鉴于此，本实验以BLM诱导的肺纤维化大鼠为评价载体，运用肺组织形态学观察、MicroCT影像学观察、苏木精‑伊红（hematoxylin‑eosin， HE）染色、马松（masson trichrome， Masson）染色、免疫组化、免疫荧光、酶联免疫吸附测定法（enzyme‑linked immunosorbent assay， ELISA）、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）、蛋白质印迹（Western Blotting）等技术手段，阐释了益肺通络方对大鼠肺纤维化IL‑17A表达的影响，以期为益肺通络方改善大鼠肺纤维化的效应机制，及补气化痰活血法治疗IPF提供科学依据，终为IPF提供新的治疗思路和方向。

1 材料与方法

1.1 动物

30只健康雄性SD大鼠，SPF级，年龄7周，体重（180±20） g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：91370181589911068A。室内保持12 h光照，12 h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，控制室内温度为（22±1） ℃、相对湿度约40%。本研究通过山东中医药大学附属医院实验伦理委员会审查（SDSZYYAWE20240221001）。

1.2 实验药物

硫酸博来霉素（25 mg，批号：B802467，Macklin），购自广州齐湘生物科技有限公司，用生理盐水配制成5 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱中备用。醋酸泼尼松片（5 mg，批号：H37020647），购自辰欣药业股份有限公司，置乳钵内研碎加生理盐水配制成10 mg/mL混悬液，置于4 ℃冰箱中备用。异氟烷（100 mL，批号：兽药字151987015），购自济南宜科生物技术有限公司。选取道地药材组益肺通络方（人参12 g，麦冬12 g，五味子6 g，黄芪30 g，炒白果仁9 g，水蛭3 g，浙贝母12 g，蜜桑白皮15 g，丹参15 g），购自山东中医药大学附属医院。

1.3 主要试剂与仪器

大鼠羟脯氨酸（JYM0191Ra）酶联免疫分析试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司；IL‑17A Antibody（TD6127s）购自济南中楚亨通生物技术有限公司；HRP‑conjugated GAPDH Monoclonal antibody（HRP‑60004）、Vimentin Polyclonal antibody（10366‑1‑AP）、smooth muscle actin specific Recombinant antibody（80008‑1‑RR）、HRP‑conjugated Affinipure Goat Anti‑Rabbit IgG（H+L）（SA00001‑2）购自武汉三鹰生物技术有限公司；IL‑17A引物购自生工生物工程股份有限公司；RN‑GAPDH购自BBI生命科学有限公司。

酶标仪（A51119500C，赛默飞世尔科技）；PCR分析仪（Tone96，德国耶拿）；实时荧光定量PCR仪（LightCycler480 Ⅱ，Roche）；化学发光成像分析系统（Tanon 5200，北京原平皓生物技术有限公司）；医用离心机（BY‑400C型，北京白洋医疗器械有限公司）；脱水机（TSJ‑Ⅱ，常州市中威电子仪器有限公司）；包埋机（BMJ‑Ⅲ，常州郊区中威电子仪器厂）；切片机（RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；高分辨率、快速、活体台式X射线显微断层成像系统（NEW Skyscan 1276，BRUKER）。

1.4 分组、造模及给药

随机分为5组：空白对照组（Control）、模型组（Model）、强的松组（PRED）、益肺通络方低剂量组（YFTL‑L）、益肺通络方高剂量组（YFTL‑H），每组各6只。除空白对照组以外，其余各组均被制成肺纤维化模型。各组动物分别于造模第2天开始灌胃，按照每10 mL/kg给药，同时抽取与之相等剂量的生理盐水，给予模型组和空白对照组灌胃，每日1次，连续给药14 d。

参照肺纤维化大鼠模型造模方法^［12］，大鼠以自制面罩维持1.5%异氟烷吸入麻醉，待5~10 min麻醉生效大鼠完全失去知觉后，称取大鼠体重计算BLM用量（1 mL/kg），并用移液枪吸取相应体积的BLM。然后将大鼠仰卧位固定在体式显微镜操作台上，将大鼠喉镜插入口腔暴露声门，将22号无菌留置针套管经声门插入大鼠气管，拔出针芯，将移液枪吸头放置于留置针套管上方，经大鼠自主呼吸运动吸入BLM液体。在大鼠吸入过程中密切观察大鼠的呼吸状态，直至呼吸平稳后拔出留置针套管，并将大鼠体位摆置为头高下肢低、仰卧位放回饲养笼。空白对照组大鼠给予相应剂量的生理盐水，其他步骤与造模步骤相同。

按人与动物体表面积折算公式^［13］，大鼠（0.2 kg）等效剂量换算为人类（70 kg）的6.3倍，计算生药给药剂量，按照大鼠每100 g体重给药体积为1 mL，确定益肺通络方低剂量组浓度为1.026 g/mL，益肺通络方高剂量组浓度为4.104 g/mL，将原药材煎煮后浓缩为各剂量组中药液，按大鼠实际质量灌胃。强的松组大鼠给予10 mg/mL的强的松混悬液，空白对照组和模型组大鼠给予相应剂量的生理盐水。

1.5 检测指标与方法

给药14 d后，将每组大鼠充分麻醉后仰面固定，打开腹腔，腹主动脉取血约5 mL，离心后取上层血清，供ELISA检测；打开胸腔，分离肺组织，剥离双肺，右肺放入4%的多聚甲醛中固定，供H&E染色、Masson染色、免疫组化检测；左肺放入-80℃冰箱冻存，供PCR、Western Blotting检测。

1.6 统计学处理

采用独立t检验比较两组之间的数据，单因素方差分析比较多组之间的数据，采用SPSS 27.0软件统计数据，计量资料以\overline{x}\pm s表示， GraphPad Prism 10.0软件绘图，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肺组织形态学观察

空白对照组大鼠肺外观光滑润泽，呈淡红色，肺叶轮廓清晰，体积大小适中，组织柔软，富有弹性；与空白对照组相比，模型组大鼠肺外观见大量瘢痕，组织结构破坏，呈苍白色或红黑色，肺叶轮廓不清晰，体积缩小，弹性变差，质地较硬；强的松组大鼠肺外观有少量瘢痕组织，呈暗红色，肺叶轮廓较清晰，体积大小适中，弹性一般，与模型组相比，双肺外观、颜色、肺叶轮廓、体积、弹性明显改善；益肺通络方低剂量组大鼠肺组织形态学特征较模型组有所优化；益肺通络方高剂量组大鼠肺组织形态学特征改善更为明显（图1）。

2.2 大鼠胸部MicroCT影像学观察

空白对照组大鼠双肺未见明显异常；模型组大鼠与空白对照组相比，肺实质密度广泛增加，肺泡结构破坏形成大小不一、边界清晰的囊腔，伴有支气管和支气管周围结构的牵拉扩张；强的松组大鼠双肺纹理增多紊乱，散见片状高密度影，较模型组炎症和纤维化征象明显减轻；益肺通络方低剂量组大鼠双肺纹理增多紊乱，见条索样高密度影，胸膜下线条增厚，较模型组炎症和纤维化征象有所减轻；益肺通络方高剂量组大鼠双肺纹理增多紊乱，见片状或条索样高密度影，较模型组炎症和纤维化征象改善更为明显（图2）。

2.3 大鼠肺组织H&E染色

空白对照组大鼠肺组织结构保持完好，未观察到明显的形态学改变；模型组与空白对照组相比，大鼠肺泡的结构受损，表现为肺泡间隔增宽、肺泡结构破损不完整，并伴随着炎症细胞的浸润以及纤维细胞和纤维组织的过度增生；强的松组大鼠肺泡结构有轻微的紊乱，仍可见到一定程度的炎症细胞渗透和纤维细胞及组织的增生，相较于模型组有明显减轻；益肺通络方低剂量组炎症细胞浸润等上述病理特征较模型组有所减轻；益肺通络方高剂量组大鼠上述病理特征减轻更为明显（图3）。

2.4 大鼠肺组织Masson染色

空白对照组大鼠肺组织基本结构保持正常，未观察到明显的形态学改变；模型组与空白对照组相比，可见大鼠肺纤维组织呈网状广泛分布于整个视野，密度高，强度大，并伴有大量炎症细胞浸润；强的松组大鼠肺组织仍可见到一定程度的纤维组织的增生，伴有少量炎症细胞浸润，较模型组明显减轻；益肺通络方低剂量组大鼠上述纤维组织增生等病理变化较模型组有所减轻；益肺通络方高剂量组大鼠随着益肺通络方剂量的增加，上述病理特征改善更为明显（图4）。

2.5 大鼠肺组织α‑SMA、Vimentin免疫组化

与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织α‑SMA平均阳性面积占比明显升高（P<0.01）。与模型组相比，强的松组、益肺通络方低剂量组和益肺通络方高剂量组大鼠肺组织α‑SMA平均阳性面积占比均明显降低（P<0.01）（表1、图5）。

与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织Vimentin平均阳性面积占比升高（P<0.05）。与模型组相比，强的松组、益肺通络方高剂量组大鼠肺组织Vimentin平均阳性面积占比降低（P<0.05），益肺通络方低剂量组大鼠肺组织Vimentin平均阳性面积占比降低，但差异无统计学意义（P>0.05）（表2、图6）。

2.6 大鼠血清羟脯氨酸含量分析

应用ELISA法测定各组大鼠血清羟脯氨酸（hydroxyproline， HYP）含量，空白对照组大鼠平均HYP含量为（12.54±0.30） ng/mL，模型组大鼠平均HYP含量为（14.96±0.97） ng/mL，强的松组大鼠平均HYP含量为（9.65±0.02） ng/mL，益肺通络方低剂量组大鼠平均HYP含量为（9.42±0.22） ng/mL，益肺通络方高剂量组大鼠平均HYP含量为（6.53±1.44） ng/mL。结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠HYP含量明显升高（P<0.05）；与模型组相比，强的松组、益肺通络方低剂量组，尤其在益肺通络方高剂量组中，大鼠HYP含量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.000 1）。见图7。

2.7 大鼠肺组织IL‑17A免疫荧光分析

免疫荧光结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织IL‑17A荧光强度高、分布广；与模型组相比，强的松组、益肺通络方低剂量组、益肺通络方高剂量组大鼠肺组织IL‑17A的荧光强度有不同程度降低（图8）。

2.8 大鼠血清IL‑17A含量分析

应用ELISA法测定各组大鼠血清IL‑17A含量，空白对照组大鼠平均IL‑17A含量为（102.26±9.16） pg/mL，模型组大鼠平均IL‑17A含量为（154.64±16.83） pg/mL，强的松组大鼠平均IL‑17A含量为（65.78±0.44） pg/mL，益肺通络方低剂量组大鼠平均IL‑17A含量为（106.5±11.28） pg/mL，益肺通络方高剂量组大鼠平均IL‑17A含量为（94.11±4.02） pg/mL。结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠IL‑17A含量明显升高（P<0.001）；与模型组相比，强的松组大鼠IL‑17A含量明显降低（P<0.000 1），益肺通络方低剂量组和益肺通络方高剂量组也有所降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。见图9。

2.9 大鼠肺组织IL‑17A mRNA表达

应用PCR测定各组大鼠肺组织IL‑17A mRNA表达，结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠IL‑17A mRNA表达明显升高（P<0.000 1）；与模型组相比，强的松组、益肺通络方低剂量组、益肺通络方高剂量组大鼠IL‑17A mRNA表达明显降低（P<0.05），差异具有统计学意义（图10）。

2.10 大鼠肺组织IL‑17A蛋白测定

应用Western blot测定各组大鼠肺组织IL‑17A蛋白表达水平，结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织IL‑17A蛋白表达明显升高（P<0.000 1）；与模型组相比，强的松组、益肺通络方低剂量组、益肺通络方高剂量组肺组织IL‑17A蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义（P<0.000 1）。见图11。

3 讨论

3.1 益肺通络方的中医学理论基础

在中医学的理论体系中，特发性肺纤维化属于咳嗽、喘证、痰饮、肺胀等范畴，现代医家根据其病因病机特点，多从“肺痹、肺痿”论^［14］。根据历代医家对肺痿、肺痹的认识，结合肺纤维化临床特征，研究者将其主要病机概括为“正气亏虚、痰浊交阻、血瘀络痹”，治则治法不离补气、化痰和活血。益肺通络方组成为人参12 g、黄芪30 g、丹参15 g、麦冬12 g、五味子6 g、蜜桑白皮15 g、水蛭3 g、炒白果9 g、浙贝12 g。整方以生脉散进行加减，人参、麦冬、五味子，一补一润一敛，益气养阴，补益肺肾，共为君药，浙贝化痰润肺、蜜桑白皮平喘泻肺、水蛭破血逐瘀，三者清解肺中痰、热、瘀，共为臣药，佐以黄芪补益肺气、丹参活血通经、炒白果止咳敛肺，助君、臣药补气活血化痰，全方相辅相成、阴阳共调，直切肺纤维化“虚、痰、瘀”的病机。

益肺通络方作为中药复方，众多研究已表明方中主要药物组分具有抗纤维化的作用。黄芪甲苷Ⅳ可通过lncRNA‑ATB/miR‑200c/ZEB1信号通路抑制上皮‑间充质转化发挥抗肺纤维化作用^［15］。人参皂苷能够通过调节AMPK/STING信号通路减弱BLM诱导的肺纤维化^［16］。隐丹参酮通过抑制炎症过程中的NLRP3/TGF‑β1通路并平衡纤维化发展过程中MMP‑9/TIMP‑1水平，调控巨噬细胞极化来缓解肺纤维化^［17］。益肺通络方根源于传统中医理论，主要组分被现代药理学研究证实，本课题实验研究也佐证了益肺通络方干预肺纤维化的有效性，采用补气化痰活血法治疗IPF在临床上是可取的，但是，方药入血成分尚不明确，潜在活性成分及作用机制仍有待进一步研究。

3.2 BLM气管滴入法成功构建肺纤维化大鼠模型

既往研究表明，在肺纤维化的各种动物模型包括BLM、异硫氰酸荧光素、二氧化硅、辐射中，气管内BLM给药是应用最广泛、特征最明显的^［18］。在肺纤维化组织修复阶段，肌成纤维细胞大量增生并表达α‑SMA，参与细胞收缩、细胞外基质的重组和创伤区域的紧密封闭^［19］；细胞外基质包括Vimentin等大量重塑参与组织的老化、炎症反应，促进纤维化进程^［20］；其中，HYP是胶原蛋白沉积的标志物，常被用作衡量体内胶原蛋白代谢和周转情况^［21］。肌成纤维细胞的过表达、细胞外基质重塑、胶原蛋白的沉积是IPF的特征表现，BLM诱导可增强肺中上述蛋白的表达^［22］。

本课题实验研究采用BLM气管滴入法构建肺纤维化大鼠模型，实验结果显示：模型组大鼠肺组织形态表观较差，MicroCT纤维化征象明显，H&E染色及Masson染色显示炎性细胞大量浸润及纤维组织增生；此外，α‑SMA和Vimentin蛋白表达增加，HYP含量也处于较高水平。以上结果均表明模型组大鼠的肺纤维化程度高，本研究成功构建了肺纤维化大鼠模型。

3.3 益肺通络方能够改善模型大鼠的肺纤维化程度

既往研究通常根据肺功能测试的变化、影像学的变化、病理学的变化以及生物标志物的变化，来评价药物治疗动物肺纤维化的效果。肺功能测试结果，尤其是用力肺活量和一氧化碳弥散量可以用来评估通气和弥散功能是否有所改善；影像学图像可以直观对比肺纤维化和蜂窝样征象的减轻程度；病理学检测通过对肺组织样本的染色能够观察和评估样本中的细胞类型、组织结构以及纤维化的程度和模式；监测血清中待定生物标志物的水平变化能够反映对疾病进展的影响。评价肺纤维化及药物治疗效果的方法各有特点，通过组合使用可以提供关于肺纤维化病变性质、严重程度等重要信息，对评估具有重要意义。

本部分实验研究采用上述BLM气管滴入法诱导的肺纤维化大鼠模型，通过肺组织形态学观察、MicroCT影像学、H&E染色、Masson染色等手段，对大鼠肺组织病理特征进行初步评估，而后通过免疫组化分析α‑SMA和Vimentin、ELISA评估HYP水平，对大鼠肺组织纤维化相关指标进行了多角度的验证。实验结果显示了益肺通络方对BLM诱导的肺纤维化大鼠具有保护作用，这为补气化痰活血法治疗IPF提供科学依据，但是，不足之处在于益肺通络方的最佳给药剂量和给药浓度仍需进一步探索，药代动力学和毒理作用有待进一步检测。

3.4 益肺通络方能够下调肺纤维化大鼠IL‑17A的分泌水平

IPF与重复性上皮细胞损伤和慢性炎症反应相关^［23］，IL‑17A是炎症细胞因子之一，它能够通过细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶等促进炎症因子的表达，在各种炎症状况中发挥关键作用^［9］，也可以在组织修复、炎症反应和上皮‑间质细胞转化等促进纤维化的多种关键过程中扮演至关重要的角色^［24］。既往研究显示，下调IL‑17A的表达能够减轻肺纤维化效应^［25］，这与本课题实验结果相符。本课题实验研究中，采用益肺通络方干预模型大鼠后，免疫荧光结果显示肺泡上皮细胞中IL‑17A的荧光强度降低，ELISA结果显示血清中IL‑17A的水平下调，PCR结果显示IL‑17A mRNA的相对表达量减少，并通过Western blot对样品IL‑17A蛋白的检测实现了再次确认。以上实验结果均提示益肺通络方能够下调IL‑17A的分泌水平，表明益肺通络方改善大鼠肺纤维化的作用机制可能与IL‑17A有关。但是，IL‑17A下游相关炎性细胞因子表达，及IL‑17A调控的具体生物学过程和信号通路仍有待探究。

综上所述，本研究使用BLM气管滴入法成功构建肺纤维化大鼠模型，采取益肺通络方干预从而对IL‑17A的作用机制进一步评估，借助多种技术手段从不同水平进行验证，并将相关数据通过统计学方法进行科学的分析，发现益肺通络方对BLM诱导的肺纤维化大鼠具有保护作用，且可能通过下调IL‑17A分泌改善大鼠肺纤维化。为补气化痰活血法治疗IPF提供了科学依据，对今后中医药治疗IPF合理组方带来了新的治疗思路和方向。然而，本课题仍在存在一定的局限性，如入血成分尚不明确，最佳给药剂量和给药浓度仍需进一步探索；另外，实验只对IL‑17A这一关键蛋白的表达进行了验证，IL‑17A调控的具体生物学过程仍有待进一步探究。针对以上不足，后期需要不断完善，以期对益肺通络方起效的内在机制开展更加深入的研究。

作者贡献度说明：

马先：实验设计、实验实施、数据分析、文章撰写；冯家腾、李泽峰、周博文：实验实施；刘骅漫、徐飞、辛玲杰、贾新华：审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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