基于孟德尔随机化分析探讨凝血因子与肝细胞癌的因果关系

Exploring the causal relationship between coagulation factors and hepatocellular carcinoma based on Mendelian randomization analysis

摘要

目的 采用双样本孟德尔随机化（MR）方法探究凝血因子（vWF、ADAMTS13、APTT、FⅧ、FⅪ、FⅦ、FⅩ、D⁃Dimer、Fibrinogen、Prothrombin、PAI⁃1、Protein C、Plasmin）与肝细胞癌（HCC）发病风险之间的因果关系。 方法 从已发表的全基因组关联研究（GWAS）中获取13种凝血因子的遗传数据，HCC的数据来源于芬兰生物银行，采用使用逆方差加权法作为主要分析方法，辅以加权中位数法、MR⁃Egger回归法、简单模式、加权模式等分析。同时进行异质性检验、水平多效性分析、敏感性分析。多变量MR分析通过逆方差加权法矫正13种凝血因子的影响。 结果 单变量MR结果显示，ADAMTS13、FⅪ、Prothrombin以及PAI⁃1与HCC之间存在正向因果关系，Plasmin、vWF、APTT以及FⅦ均与HCC之间存在负向因果关系，其他凝血因子与肝细胞癌发生风险未存在因果关系（P>0.05）。敏感性分析结果表明因果关系稳健，MR⁃Egger截距分析未检测到潜在的水平多效性。多变量MR调整后，APTT与HCC的负相关仍然明显（OR=0.08，95%CI：0.01~0.87，P=0.037），ADAMTS13与HCC存在独立的正向因果关系（OR=1.84，95%CI：1.09~3.10，P=0.021）。反向MR结果未发现HCC与13种凝血因子存在因果关系（P>0.05）。 结论 本研究通过遗传学手段阐明了与HCC因果相关的凝血因子，为疾病干预提供了潜在的靶点，并有助于其早期筛查和预防。

Abstract

Objective ： To investigate the causal relationship between coagulation factors （vWF， ADAMTS13， APTT， FⅧ， FⅪ， FⅦ， FⅩ， D⁃Dimer， Fibrinogen， Prothrombin， PAI⁃1， Protein C， Plasmin） and the risk of hepatocellular carcinoma （HCC） using a two⁃sample Mendelian randomization （MR） approach. Methods Genetic data for 13 coagulation factors were obtained from published genome⁃wide association studies. The data for HCC came from the Finnish Biobank. The inverse variance weighted （IVW） method was used as the primary analysis approach， supplemented by the weighted median method， MR⁃Egger regression， simple mode， and weighted mode for analysis. Heterogeneity testing， horizontal pleiotropy analysis， and sensitivity analysis were also conducted. Multivariable MR analysis was performed to adjust for the effects of the 13 coagulation factors using the IVW method. Results The univariate MR results showed a positive causal relationship between ADAMTS13， FⅪ， Prothrombin， PAI⁃1， and HCC， while Plasmin， vWF， APTT， and FⅦ showed a negative causal relationship with HCC. No causal relationship was found between other coagulation factors and the risk of HCC （P>0.05）. Sensitivity analysis indicated that the causal relationships were robust， and the MR⁃Egger intercept analysis did not detect potential horizontal pleiotropy. After multivariable MR adjustment， the negative correlation between APTT and HCC remained significant （OR=0.08， 95% CI： 0.01⁃0.87， P=0.037）， while ADAMTS13 showed an independent positive causal relationship with HCC （OR=1.84， 95% CI： 1.09⁃3.10， P=0.021）.IVW method result showed no causal relationship between HCC and the 13 coagulation factors（P>0.05）. Conclusion This study elucidates the coagulation factors causally associated with HCC using genetic tools， providing potential targets for disease intervention and contributing to early screening and prevention.

Graphical abstract

关键词

孟德尔随机化 / 凝血因子 / 肝细胞癌

Key words

Mendelian randomization / Coagulation factor / Hepatocellular carcinoma

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）约占所有原发性肝癌的 80%~90%，是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，年发病率约为 50万例，也是全球癌症相关死亡的第四大原因，据统计，HCC的5年生存率为20.8%^［1，2］。尽管许多因素诸如乙型肝炎/丙型肝炎病毒感染、非酒精性脂肪性肝炎、过量饮酒、黄曲霉毒素都被认为是促成HCC发生、发展的危险因素^［3］，但HCC的病因和发病机制尚未完全阐明。因此，探究HCC的危险因素并研究危险因素与保护因素之间的关系至关重要，通过HCC与其他因素间的因果关系对揭示HCC的深层病理机制、采取有效临床干预措施具有重要意义。

异常凝血酶原（PIVKA⁃Ⅱ）是近年来发现的一种新型肝癌早期诊断标志物，是由于肝癌细胞不能依赖维生素K合成正常的凝血因子导致凝血酶原前体羧化不足而生成的，但HCC致PIVKA⁃Ⅱ升高的病理机制尚未完全明确，由于维生素K参与凝血因子Ⅱ（即凝血酶原）、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ的合成，并在凝血过程中促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白，维生素K缺乏会产生大量异常凝血酶原，导致凝血功能障碍^［4］。近期研究发现，凝血因子的表达水平与HCC的发生、恶性进展和预后存在关联。在一项队列研究中发现^［5］，凝血指标对HCC有重要的诊断意义。然而，目前仍缺乏证实凝血指标与HCC之间因果关系的遗传学证据，对于HCC中这些凝血因子的确切作用和潜在机制仍缺乏全面的研究。

传统的观察性研究往往受到混杂因素和反向因果关系的限制，难以明确因果关系。孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）提供了一种新颖的研究方法^［6］，通过利用自然发生的遗传变异作为代理变量，来确定暴露与结果关联的因果关系，提供更可靠的因果推断，同时，考虑到凝血因子之间的相关性，可以采用多变量MR的方法来同时评估相关的多个风险因素与疾病结局的关联。本研究采用传统的MR分析来确定个体凝血因子与HCC的关联，然后采用多变量MR分析来阐明哪些凝血特征在HCC的发生、发展中占据独立的、主导的因果关系，为凝血因子与HCC发病关联提供遗传学证据支持。

1 材料与方法

1.1 研究设计

MR分析必须满足3个关键假设。第一个假设是遗传变量应与暴露明显相关，第二个假设是作为暴露工具变量提取的遗传变异与其他混杂因素无关，第三个假设是遗传变异仅通过暴露来影响结局，而不能通过其他因素影响（即没有水平多效性）^［7］。本研究采用两样本孟德尔随机化设计探讨血清中凝血因子与HCC之间的因果关系。血清中凝血因子被定义为暴露因素，其中包括vWF、ADAMTS13、APTT、FⅧ、FⅪ、FⅦ、FⅩ、D⁃Dimer、Fibrinogen、Prothrombin、PAI⁃1、Protein C、Plasmin。结局变量为是否患有HCC。见图1。

1.2 数据来源

研究中所使用到的所有汇总数据合法、公开且已通过伦理审查，故无须进一步的伦理批准。本研究使用的不同凝血因子的数据集来源于各自的全基因组关联研究（genome⁃wide association studies，GWAS）^［8⁃11］。为了避免不同遗传背景人群之间的异质性而产生偏倚，本研究仅选取其中与欧洲人种有关的凝血因子的全基因组关联分析信息。HCC的GWAS摘要统计数据集来自FinnGen数据库（https：//storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_C3_HEPATOCELLU_CARC_EXALLC.gz）。其中凝血因子的数据来源于不同的队列研究，数据来源人群为各自研究招募人群；HCC的数据来源于芬兰生物银行的长期随访人群数据，二者之间的人群重叠很少。各项研究的数据来源，凝血因子的原始数据能够从相关文献中获得，见表1。本研究所涉及的数据均来源于公共数据库。

1.3 工具变量的筛选

为了考察凝血因子与HCC之间的因果关系，本研究在欧洲人群中寻找凝血因子的GWAS来确定与凝血因子相关的遗传变异，选择了vWF、ADAMTS13、APTT、FⅧ、FⅪ、FⅦ、FⅩ、D⁃Dimer、Fibrinogen、Prothrombin、PAI⁃1、Protein C、Plasmin作为被检测的凝血因子，使用单核苷酸多态性（SNP）作为工具变量，工具变量需满足以下条件^{［12，13］}：（1）设置P<5×10^-6，以筛选与凝血因子强相关的SNP；（2）为了确保SNP间相互独立及限制分析范围，设置连锁不平衡系数r²<0.001、区域宽度设定为10 000 kb；（3）合并暴露因素数据集与结局数据集，筛选同时存在于暴露因素数据集与结局数据集的SNP，并剔除不一致等位基因的SNP和回文SNP；（4）选取F>10的SNP，以最大限度剔除弱工具变量来以确保工具变量与暴露之间的强相关性^［14］。

1.4 MR分析

单变量分析使用逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）作为主要的分析方法，该方法相对简单且高效，可保证结果的假阳性率较低^［15］，采用加权中位数法（weighted median，WM）、MR⁃Egger回归法^［16］、简单模式（simple mode，SM）、加权模式（weighted mode）作为次要MR分析方法。当IVW分析结果与次要MR分析方法结果不一致时，以IVW分析结果为主。异质性检验采用Cochran's Q检验分析^［17］，当P<0.05时，提示SNPs之间存在异质性，SNP对效应量的影响不同，可采用IVW随机效应模型；当P≥0.05时，提示SNP之间不存在异质性，表明SNP对效应量的影响相似，可采用IVW固定效应模型或随机效应模型；并对IVW 随机效应模型进行敏感性分析，敏感性分析^［18］运用“留一法（Leave⁃one⁃out）”以评价SNP对于因果关联估计结果的影响大小；使用漏斗图检测结果偏倚；多效性采用MR⁃Egger回归法^［19］，通过MR⁃Egger⁃intercept检验是否存在水平多效性从而来验证结果的可靠性。

多变量MR^［20］可以通过将所有暴露纳入同一模型来估计各种风险因素共同对结局的因果影响，为了阐明不同凝血因子对肝细胞癌的影响，本研究进行了多变量MR分析，主要采用加权线性回归的IVW方法来加权线性回归的IVW方法。上述统计分析均在R Studio（版本4.3.1）软件中使用“TwoSampleMR（版本0.5.6）”、“Mendelian Randomization （版本0.7.0）”等程序包中进行。

2 结果

2.1 工具变量

通过文献检索从不同的GWAS结果中系统地筛选出与13种凝血因子（包括vWF、ADAMTS13、APTT、FⅧ、FⅪ、FⅦ、FⅩ、D⁃Dimer、Fibrinogen、Prothrombin、PAI⁃1、Protein C、Plasmin）相关的明显的SNP，这些凝血因子可以分为5组，分别为血小板黏附（vWF、ADAMTS13）、内在途径（APTT、FⅧ、FⅪ）、外在途径（FⅦ）、共同途径（Fibrinogen、FⅩ、Prothrombin）和纤溶系统（D⁃Dimer、PAI⁃1、Protein C、Plasmin）。首先，在相应的GWAS研究中保留了与每种暴露表型明显相关的SNP（P<5×10^-6）。随后，采用基于连锁不平衡（LD）的聚类方法，筛选了与LD无关的SNP（r²阈值=0.001，区域宽度=10 000 kb）。在去除连锁不平衡的单核苷酸多态性后，查阅LDlink数据库（https：//ldlink.nih.gov/？tab=ldtrait）检索相关混杂因素（如慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝病、肝硬化、糖尿病等）并剔除相关的SNPs，经 MR⁃PRESSO分析无离群值，剔除具有不一致等位基因的模糊SNP以及具有无法纠正的模糊链的回文SNP。所有的工具变量 F>10，表明纳入的 SNPs具有较高较好的预测强度，均符合独立性假设和排他性假设。

2.2 单变量MR分析

根据芬兰生物银行的GWAS肝细胞癌汇总统计数据（包含453例病例和287 137名对照）进行单变量MR分析，以估计13种凝血因子对HCC风险的因果影响，MR分析采用IVW模型、MR⁃Egger模型、WM模型、SM模型以及加权模型。研究结果显示，血浆ADAMTS13水平与HCC风险增加明显相关（IVW：OR=2.51，95%CI：1.53~4.11，P=2.60×10^-4；WM：OR=2.49，95%CI：1.27~4.88，P=0.007 9），提示高ADAMTS13可能是HCC的危险因素。同时，血浆Plasmin水平与HCC风险降低明显相关（IVW：OR=0.60，95%CI：0.45~0.80，P=6.31×10^-4；MR⁃Egger：OR=0.56，95%CI：0.35~0.89，P=0.041 9；WM：OR=0.60，95%CI：0.39~0.94，P=0.025 9），表明长期较高的血浆Plasmin水平是HCC的保护因素。此外，研究结果显示，vWF（IVW：OR=0.27，95%CI：0.07~0.95，P=0.042 5）、APTT（IVW：OR=0.12，95%CI：0.02~0.57，P=0.007 8）以及FⅦ（IVW：OR=0.75，95%CI：0.57~0.98，P=0.041 2）均与HCC之间存在轻度的负向因果关系，提示可能与较低的HCC发生风险相关；而FⅪ（IVW：OR=2.07，95%CI：1.10~3.90，P=0.024 1）、Prothrombin（IVW：OR=1.47，95%CI：1.07~2.04，P=0.019）以及PAI‑1（IVW：OR=1.79，95%CI：1.05~3.05，P=0.031 3）均与HCC之间存在轻度的正向因果关系，表明这3种凝血因子水平升高与HCC风险增加有提示性相关。然而，未发现其他凝血因子与HCC风险存在因果关系（P>0.05）。因果关系的测定结果见表2、图2A~M。

2.3 异质性分析和敏感性分析结果

使用Cochran′s Q检验检测工具变量的异质性，未检测到明显的异质性（Q⁃Pval>0.1），所有异质性分析的结果见表3。MR⁃Egger回归的截距均接近于0，不存在水平多效性（P>0.05），减少了影响MR分析结果的可能性，所有水平多效性分析的结果见表4。敏感性分析中，留一法结果表明消除任何一个SNP都不会明显影响因果相关的估计，提示MR分析结果稳健，具体结果见图3。漏斗图中呈现的因果效应分布具有基本对称性，未见明显偏倚，说明工具变量之间差异小。

2.4 多变量MR分析

为了矫正多种凝血因子对结局的影响，将Plasmin、vWF、APTT、FⅦ纳入同一模型来进行多变量MR分析，共筛选出29个SNP，结果显示，在调整了基因预测的FⅦ、Plasmin、vWF水平后，基因预测的APTT仍然与HCC存在负向因果关联（IVW：OR=0.08，95%CI：0.01~0.87，P=0.037）（表5、图4），APTT是HCC的保护性因素。

将ADAMTS13、FⅪ、PAI⁃1纳入同一模型来进行多变量MR分析，共筛选出43个SNP，结果显示，在调整了基因预测的FⅪ、PAI⁃1水平后，基因预测的ADAMTS13与HCC存在独立的、明显的因果关系（IVW：OR=1.84，95%CI：1.09~3.10，P=0.021）（表6、图5），ADAMTS13是HCC发病的危险因素。

2.5 反向MR分析

为探讨HCC与13种凝血因子的因果关系，采用两样本单变量进行反向MR分析。IVW法结果显示HCC不是13种凝血因子的影响因素，无因果关联（P>0.05）。

3 讨论

本研究基于公开的GWAS数据，通过单变量和多变量MR分析，评估了13种凝血因子与HCC之间的因果关系。单变量MR分析结果显示，血浆Plasmin、vWF、APTT、FⅦ、ADAMTS13、FⅪ和PAI⁃1水平与HCC发生存在明显的因果关联。其中，Plasmin、vWF、APTT和FⅦ与HCC的发生风险呈负相关，而ADAMTS13、FⅪ和PAI⁃1则呈正相关。进一步的多变量MR分析表明，只有APTT和ADAMTS13的关联在独立于其他凝血因子的影响后仍然明显。此外，反向MR分析未发现HCC与13种凝血因子之间存在因果关系。

尽管先前的流行病学研究已暗示高凝状态与HCC的发生之间存在潜在联系^［5］，尤其是ADAMTS13和vWF的失衡被认为与肝硬化及HCC的病理生理学密切相关^［21］，然而，这些研究大多数基于观察性数据，无法明确揭示因果关系，本研究通过MR方法提供了更强的因果证据，表明APTT和ADAMTS13可能是HCC发生的独立因果因素，强调了监测血浆APTT和ADAMTS13水平的重要性，此外，研究结果还提供了一种潜在的治疗方法，即调节血浆APTT和ADAMTS13水平，从而预防和控制HCC的发生和发展。

本研究发现，ADAMTS13的血浆水平与HCC发生风险呈正相关，而vWF则与HCC的发生呈负相关。这一结果支持了ADAMTS13在HCC发生中的重要作用，可能通过调节vWF的活性，影响血液流变学、血栓形成和血管生成，进而影响肝癌的发生。尤其是在慢性肝病背景下，凝血因子的失衡往往是肝硬化进展和HCC发生的关键因素^［22］。肝癌的发生是一个复杂的多阶段过程，其中凝血因子在血液凝固、血管生成及免疫逃逸等多个方面起着重要作用^［23］。APTT是衡量凝血系统内多种因子功能的指标，延长的APTT通常反映了肝脏功能的损伤和凝血因子合成的减弱，这可能预示着肝硬化及HCC的风险^［24］。在慢性肝病患者中，APTT延长被认为是高凝状态的标志，而高凝状态在肝癌发生中的作用可能通过促进血管生成、增加血栓形成以及促进炎症反应等机制发挥作用。多项临床回顾性研究表明^{［25⁃27］}，HCC患者的APTT通常明显延长，且这一现象仅次于肝硬化患者。APTT的延长反映了肝脏的合成能力受损，这可能导致凝血因子（如凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ等）的合成减少，并促使凝血系统的激活。因此，APTT在HCC的早期诊断中具有一定临床价值，尤其能帮助识别高凝状态。肝脏损伤持续导致凝血因子的合成受损，而肝脏的功能衰退是HCC发展的基础。因此，调节APTT水平并改善凝血因子和纤溶系统的高凝状态，可能有助于降低HCC的发生风险。然而，这一领域仍需进一步的研究，以阐明具体的分子机制和生物学路径。

另一方面，ADAMTS13是调节vWF功能的关键因子，vWF在血管内皮细胞损伤和修复过程中起着至关重要的作用。ADAMTS13水平的降低会导致vWF聚集，形成大分子vWF，这些大分子可促进血栓形成、影响微循环并可能在肝癌微环境中促进肿瘤血管生成^［28］。因此，ADAMTS13与vWF的失衡可能通过促使异常血管生成和血栓形成，推动肝癌的发生和进展。一项临床观察性研究显示，较高的血浆ADAMTS13活性或抗原水平是HCC发展的重要危险因素，并且是肝癌发生的明显预测因素，独立于其他影响HCC发展的因素，包括肝纤维化阶段的变量^［29］。Takaya等^［30］发现，ADAMTS13⁃vWF的不平衡与HCC的发展相关，并提出vWF/ADAMTS13比值可以作为肝硬化患者早期诊断HCC的新型生物标志物。而本研究的单变量结果也表明血浆ADAMTS13水平对HCC具有正向因果效应，血浆vWF水平对HCC具有负向因果效应，多变量MR分析进一步证实，血浆ADAMTS13水平与HCC的发生具有独立的明显的因果效应，而血浆vWF水平与HCC无明显的因果效应。

本研究使用了两样本MR分析，得出了可靠的结果。首先，由于MR分析基于基因变异的随机分配，能够避免反向因果关系和混杂因素，优于观察性研究，且节省了时间和资源。其次，本研究使用了暴露（凝血因子）和结果（HCC）数据的独立样本，以确保MR分析的可靠性，避免了弱工具变量偏差的影响。第三，研究还进行了异质性分析、多效性分析和敏感性分析，以验证工具变量假设的可行性。第四，进行多变量分析进一步提高了研究结果的可信度。然而，本研究也存在一些局限性。首先，由于达到全基因组意义的SNP数量有限，设置了较宽松的MR分析阈值，这也是其他研究采用的做法。其次，由于本研究的MR分析数据主要来源于欧洲血统的个体，不同种族之间的基因分布差异较大，因此在将结果外推至其他种群时，需进行进一步验证。最后，尽管MR分析提供了因果推断，但凝血因子与HCC之间的关系仍然复杂，未来的研究应深入探索其分子机制和生物学路径。

作者贡献度说明：

李炯汾：负责研究设计、数据分析及论文撰写；林镛，张衎：文章撰写指导及润色；胡梦玲，张日云，曾阳玲，王明刚：参与数据提取与分析；王挺帅，毛德文：文章整体把控、文章修改与内容审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82360912)

国家自然科学基金项目(81960841)

国家自然科学基金项目(82274434)

广西中医药多学科交叉创新团队项目(GZKJ2306)

广西自然科学基金项目(2023GXNSFBA026190)

广西中医药大学博士科研启动基金项目(2021BS028)

广西中医药大学第一附属医院科研项目(2021QN004)