金水缓纤方通过p53‑KRT8信号通路减轻HPAEPICS细胞衰老和分化障碍改善肺纤维化的作用机制

Mechanism of Jinshui Huanxian Formula on improving pulmonary fibrosis by alleviating senescence and dysdifferentiation of HPAEPIC cells via p53‑KRT8 signaling pathway

摘要

目的 探讨金水缓纤方通过调控p53‑KRT8信号通路减轻人Ⅱ型肺泡上皮细胞株HPAEPIC细胞衰老和分化障碍以改善博来霉素（bleomycin，BLM）诱导的肺纤维化的作用机制。 方法 采用0.63 µg/mL BLM诱导HPAEPIC细胞48 h构建细胞肺纤维化模型，分为空白组（CON组）、模型组（MOD组）、金水缓纤方组（JHF组，10%）、吡非尼酮组（PFD组，20 µg/mL）和p53抑制剂组（Pifithrin‑α HBr抑制剂，PFT‑α组，10 µmol/L）。CCK‑8检测细胞活力；RT‑PCR检测细胞IL‑6、IL‑8、p21、p53、SPC、KRT8、IL‑13 mRNA的表达水平；流式细胞术检测细胞周期；Western blot检测p53、KRT8、CLDN4、N‑CAD、α‑SMA蛋白表达水平；免疫荧光检测p53、p21、KRT8表达水平。 结果 与CON组相比，MOD组细胞G1期百分比和G1/G2比值明显降低（P<0.01），G2期百分比明显升高（P<0.01）；IL‑6、IL‑8、p21、p53、KRT8、CLDN4 mRNA表达水平明显上调（P<0.05），p53、KRT8、CLDN4、N‑CAD、α‑SMA蛋白表达水平明显增多（P<0.05），p53、p21、KRT8荧光表达水平明显增多（P<0.01）；与MOD组相比，JHF组和PFT‑α组G1期百分比明显升高（P<0.05），G2期百分比明显降低（P<0.01）；IL‑6、IL‑8、p21、p53、KRT8、CLDN4 mRNA表达水平明显下调（P<0.05），p53、KRT8、CLDN4、N‑CAD、α‑SMA蛋白表达水平明显减少（P<0.05），p53、p21、KRT8荧光表达水平明显减少（P<0.01），各组KRT8荧光与p21荧光的皮尔森系数>0.5。 结论 金水缓纤方可以改善BLM诱导的HPAEPIC细胞肺纤维化，其机制可能与抑制p53‑KRT8通路，减轻HPAEPIC细胞衰老和分化障碍有关。

Abstract

Objective To explore the effects and mechanisms of Jinshui Huanxian Formula on improving bleomycin （BLM）‑induced pulmonary fibrosis by alleviating type Ⅱ alveolar epithelial cells HPAEPIC senescence and dysdifferentiation via regulating the p53‑KRT8 signaling pathway. Methods HPAEPIC cells were induced by 0.63 µg/mL BLM for 48 h to establish a cellular pulmonary fibrosis model. The cells were divided into the blank group （CON group）， the model group （MOD group）， the Jinshui Huxian Formula group （JHF group， 10%）， the pirfenidone group（PFD group， 20 µg/mL） and the p53 inhibitor group （pifithrin‑α HBr inhibitor， PFT‑α group， 10 µmol/L）. Cell viability was detected by CCK‑8 assay. The mRNA expression levels of IL‑6， IL‑8， p21， p53， SPC， KRT8， and IL‑13 were detected by RT‑PCR. The cell cycle was detected by flow cytometry. The expression levels of p53， KRT8， CLDN4， N‑CAD， and α‑SMA were detected by Western blot. The expression levels of p53， p21， and KRT8 was detected by immunofluorescence. Results Compared to the CON group， the level of G1 phase percentage and G1/G2 ratio in the MOD group were significantly decreased （P<0.01）， the level of G2 phase percentage was significantly increased （P<0.01）. The mRNA expression levels of IL‑6， IL‑8， p21， p53， KRT8， and CLDN4 were significantly up‑regulated （P<0.05）. The protein expression levels of p53， KRT8， CLDN4， N‑CAD， and α‑SMA were significantly increased （P<0.05）. The fluorescence expression levels of p53， p21， and KRT8 were significantly increased （P<0.01）. Compared to the MOD group， the levels of G1 phase percentage in the JHF and PFT‑α groups were significantly increased （P<0.05）， and the levels of G2 phase percentage was significantly decreased （P<0.01）. The mRNA expression levels of IL‑6， IL‑8， p21， p53， KRT8， and CLDN4 were significantly down‑regulated （P<0.05）. The protein expression levels of p53， KRT8， CLDN4， N‑CAD， and α‑SMA were significantly reduced （P<0.05）. The fluorescence expression levels of p53， p21， and KRT8 were significantly decreased （P<0.01）. The Pearson's coefficient between KRT8 fluorescence and p21 fluorescence in all groups was >0.5. Conclusion Jinshui Huanxian Formula can improve BLM‑induced HPAEPIC cell pulmonary fibrosis， and its mechanism may be related to the alleviation of HPAEPIC cell senescence and dysdifferentiation via inhibiting the p53‑KRT8 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

肺纤维化 / 衰老 / 金水缓纤方 / KRT8 / Ⅱ型肺泡上皮细胞

Key words

Pulmonary fibrosis / Senescence / Jinshui Huanxian Formula / KRT8 / Type Ⅱ alveolar epithelial cells

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种与肺泡上皮细胞功能受损相关的年龄性疾病，肺泡上皮损伤和再生失败是其发病机制的核心^［1‑3］。多种因素反复损伤肺泡上皮细胞，可导致其活化异常和修复受损。Ⅰ型肺泡上皮细胞（typeⅠ alveolar epithelial cells，ATⅠ）比Ⅱ型肺泡上皮细胞（typeⅡ alveolar epithelial cells，ATⅡ）更容易受损甚至死亡，且ATⅠ增殖能力有限，死亡后主要依靠ATⅡ的祖细胞功能补充^［4］。正常情况下肺细胞更新非常缓慢，受损时更新加快，肺损伤的修复需要肺泡上皮细胞屏障的完整性和气体交换功能来实现，因此ATⅡ增殖并分化为ATⅠ修复受损的肺泡上皮层，对保持其完整性并防止进一步损伤至关重要^［5‑7］。在PF中，再生的ATⅡ多停留在以角蛋白8（keratin 8，KRT8）为主要标志物的ATⅡ‑ATⅠ的中间细胞状态，难以成功分化为ATⅠ^［8］。这种中间细胞状态的异常持续常提示纤维化，并与细胞衰老高度相关^［8，9］。

PF属中医“肺痹”“肺痿”范畴^［10］，以“正虚络痹积损”为主要病机，以“扶正通络化瘀”为主要疗法^［11］。金水缓纤方（人参、麦冬、熟地黄、瓜蒌等）具有补益肺肾、止咳平喘的功效，对疾病晚期疗效较为明显^{［10，12］}。研究表明，上皮祖细胞的衰老损害了肺泡的稳态和修复，同时过渡性上皮细胞容易发生衰老^［13］，PF中ATⅡ的衰老与ATⅠ细胞标志物表达受损往往同时存在^［14］，提示ATⅡ的衰老和分化障碍可能具有相关性，减轻ATⅡ的衰老可能会促进ATⅡ分化从而改善PF。目前的研究对二者的相关性以及金水缓纤方对二者的作用尚不明确。因此，本研究以人Ⅱ型肺泡上皮细胞株HPAEPIC为研究对象，采用博来霉素（bleomycin，BLM）诱导细胞PF模型^{［15，16］}，探讨金水缓纤方通过p53‑KRT8信号通路调控BLM诱导的HPAEPIC细胞衰老与分化从而改善PF的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞

雄性SPF级SD大鼠30只，5~8周龄，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。动物生产许可证号：SCXK（京）2019‑0010，动物合格证号：110324‑ 241100121987；实验动物使用许可证号：SYXK（豫）2022‑0004。在室温22~25 ℃，相对湿度（55±10）%，12 h光/暗交替环境中饲养。实验方案经河南中医药大学第一附属医院实验动物伦理审查委员会批准，伦理批文号：YFYDW2022016。

HPAEPIC细胞株购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 药物与主要试剂

硫酸BLM（HY‑17565，LookChem）；吡非尼酮（pirfenidone，PFD，H20133376，北京康蒂尼）；金水缓纤方由人参、熟地黄、炙淫羊藿、浙贝母、陈皮、炙甘草等组成，所有饮片购自河南中医药大学第一附属医院，采用水提醇沉法制为药粉，每克含2.47 g生药量^{［17，18］}；Pifithrin‑α HBr抑制剂（PFT‑α）（S2929，Selleck）。

DME/F‑12培养基（SH30023.01，购自Cytiva）、HyClone青霉素‑链霉素100 ×溶液（SV30010，购自Solarbio）；胎牛血清（FSP500，购自Excell Bio）； CCK‑8试剂盒（GK10001，购自GLPBIO）；细胞周期测定试剂盒（E‑CK‑A351，购自Elabscience）；RNAiso Plus（9108Q，购自TaKaRa）；α‑SMA Ab（#19245，购自Cell Signaling）；N‑CADAb（GTX127，购自GenTeX）；KRT8 Ab（27105‑1‑AP）、p53 Ab（10442‑1‑AP）、CLDN4Ab（16195‑1‑AP）、GAPDH Ab（10355‑1‑AP）、p21 Ab（67362‑1‑lg）购自Proteintech；MonScript^TM RTⅢ All‑in‑One Mix（MR05401）、MonAmp^TM miRNA Universal Super Specificity qPCR Mix（MQ00901）购自Monad。

1.3 主要仪器

二氧化碳（CO₂）培养箱（Forma）；超净工作台（苏州苏净集团）；垂直凝胶电泳系统（BIO‑RAD）；酶标仪（MODEL680BIO‑RAD）；荧光定量PCR仪（LightCycler^® 480 Roche）；流式细胞仪（BD FACSCelesta）；激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss AG）。

1.4 金水缓纤方含药血清和空白血清制备

使用随机数字法将大鼠分成空白血清组和含药血清组，每组15只。根据Meeh‑Rubner体表面积计算公式换算给药剂量，分别以生理盐水（2 mL/d）、金水缓纤方（15.85 g·kg^-1·d^-1）连续灌胃7 d，于第7 天灌胃后1 h给与1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，无菌分离血清，56 ℃、30 min灭活，-20 ℃保存备用。

1.5 细胞培养及分组

HPAEPIC细胞用含10% FBS、1%青‑链霉素的DME/F‑12培养基于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，常规换液、传代，待细胞处于对数生长期进行实验。分为空白组（CON组）、模型组（MOD组）、金水缓纤方组（JHF组，10%）、PFD组（20 µg/mL）和p53抑制剂组（Pifithrin‑α HBr抑制剂，PFT‑α组，10 µmol/L）。

1.6 CCK‑8

细胞经胰酶消化后，以7.5×10³个/孔接种于96孔板培养24 h，加药作用24 h后，每孔加10 µL CCK‑8试剂，在不含CO₂的培养箱中温育1~4 h，450 nm波长下检测吸光度OD值。

1.7 RT‑PCR

收集各组细胞，严格按照说明书提取总RNA，测定RNA浓度及纯度后，反转录成cDNA。以此cDNA为模板，进行PCR扩增：95 ℃活化10 min，95 ℃活化10 s；60 ℃活化30 s，共40个循环。实验所需引物由郑州点睛科技公司设计合成，见表1。

1.8 流式细胞术

细胞经胰酶消化后，以1.2×10⁵个/孔接种于6孔板中培养24 h后加药（10 % JHF、20 µg/mL PFD、10 µmol/L PFT‑α），3 h后加0.63 µg/mL BLM诱导48 h（后续6孔板均以此方法造模）。严格按照细胞周期试剂盒说明书收集各组细胞，上机检测。

1.9 Western blot

造模48 h后弃培养液，PBS洗涤，加入含1%PMSF的RIPA裂解液，收集细胞，4℃、12 000×g离心15 min，得上清液；蛋白变性，上样，电泳，转膜，封闭；TBST洗膜，加入一抗，4 ℃孵育过夜；回收一抗，TBST洗膜，加入二抗，室温下孵育1 h；回收二抗，TBST洗膜，显影，分析目的蛋白灰度值。

1.10 免疫荧光

细胞经胰酶消化后，以1.0×10⁴个/皿接种于荧光皿，造模48 h后弃培养液，PBS洗涤；经4%多聚甲醛溶液固定、10%山羊血清封闭、一抗、荧光二抗、核复染后上机，激光共聚焦显微镜下观察荧光表达并拍照。采用ImageJ软件计算荧光强度。

1.11 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析。计量资料以\overline{x}\pm s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one‑way ANOVA），两两比较采用LSD‑t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同药物浓度对细胞增殖活力的影响

与0浓度相比，1.25、2.5、5 µg/mL BLM和30 µmol/L PFT‑α细胞活力明显降低（P<0.01），其余各组各浓度细胞活差异无统计学意义（P>0.05）。根据结果采用0.63 µg/mL BLM造模，见图1A~D。

2.2 0.63 µg/mL BLM作用不同时间对细胞IL‑6、IL‑8、p21、p53、KRT8、SPC mRNA表达水平的影响

0.63 µg/mL BLM作用12、24、36、48、72 h细胞炎症因子IL‑6和IL‑8、衰老相关表型p21和p53、中间细胞标志物KRT8表达呈不断上升趋势，而ATⅡ标志物SPC呈不断下降趋势。与BLM诱导12 h组相比，BLM诱导48 h和72 h组IL‑8、p21、p53、KRT8 mRNA表达水平明显上调（P<0.05），SPC mRNA表达水平明显下调（P<0.01）。此外，BLM作用72 h组细胞大片死亡，根据实验结果采用0.63 µg/mL BLM作用48 h构建细胞模型，见图2A~F。

2.3 不同药物浓度对细胞模型中IL‑13、p53、p21、KRT8 mRNA表达水平的影响

在0.63 µg/mL BLM作用48 h的细胞模型中，与CON组相比，MOD组IL‑13、p21 mRNA水平明显升高（P<0.01）；与MOD组相比，JHF组除1%外，其他浓度IL‑13和KRT8 mRNA水平明显降低（P<0.01），各浓度p53、p21 mRNA水平有不同程度降低，差异无统计学意义（P>0.05）；与MOD组相比，PFD组各浓度IL‑13 mRNA水平明显降低（P<0.01），20、30 µg/mL浓度p53、p21、KRT8 mRNA水平有不同程度降低，差异无统计学意义（P>0.05）；与MOD组相比，PFT‑α组各浓度KRT8 mRNA水平明显降低（P<0.01）。根据实验结果采用10% JHF、20 µg/mL PFD，10 µm PFT‑α用于后续实验，见图3A~D。

2.4 金水缓纤方对BLM诱导的HPAEPIC细胞上皮间质转化（epithelial‑mesenchymal transition，EMT）和分化的影响

与CON组相比，MOD组细胞IL‑6、IL‑8、KRT8、CLDN4 mRNA水平明显上调（P<0.05）；与MOD组相比，JHF组细胞IL‑6、IL‑8、KRT8、CLDN4 mRNA水平明显下调（P<0.05），PFT‑α组细胞IL‑6、IL‑8、CLDN4 mRNA水平明显下调（P<0.05），见图4A~D。与CON组相比，MOD组细胞KRT8、N‑CAD、CLDN4、α‑SMA蛋白表达水平明显增多（P<0.01）；与MOD组相比，JHF组和PFT‑α组细胞KRT8、N‑CAD、CLDN4、α‑SMA蛋白表达水平明显减少（P<0.05），见图4E~I。结果表明，0.63 µg/mL BLM作用48 h 成功构建细胞PF模型， MOD组HPAEPIC细胞存在以KRT8高表达为标志的分化障碍和EMT，金水缓纤方可以减轻HPAEPIC细胞分化障碍和EMT。

2.5 金水缓纤方对BLM诱导的HPAEPIC细胞周期的影响

与CON组相比，MOD组细胞G1期百分比和G1/G2比值明显降低（P<0.01），G2期百分比明显升高（P<0.01）；与MOD组相比，JHF组细胞G1期百分比和G1/G2比值明显升高（P<0.05），G2期百分比明显降低（P<0.01）；PFT‑α组G1期百分比明显升高（P<0.01），G2期百分比明显降低（P<0.05），见图5A~E。结果表明，在BLM诱导的HPAEPIC细胞PF模型中，细胞多停滞在G2期，金水缓纤方可以减少细胞停滞在G2期的比例，减轻BLM诱导的HPAEPIC细胞周期阻滞。

2.6 金水缓纤方对BLM诱导的HPAEPIC细胞衰老的影响

与CON组相比，MOD组细胞p53荧光和蛋白表达水平明显增多（P<0.05）；与MOD组相比，JHF和PFT‑α组细胞p53荧光和蛋白表达水平明显减少（P<0.05），见图6A~D。与CON组相比，MOD组细胞p53、p21 mRNA表达水平明显增多（P<0.01）；与MOD组相比，JHF组和PFT‑α组细胞p53、p21 mRNA表达水平明显减少（P<0.01），见图6E、F。结果表明，BLM诱导的HPAEPIC细胞PF模型中存在严重的细胞衰老情况，金水缓纤方可以减轻BLM诱导的HPAEPIC细胞衰老。

2.7 金水缓纤方对BLM诱导的HPAEPIC细胞p21和KRT8表达的影响

与CON组相比，MOD组细胞KRT8、p53荧光表达水平明显增多（P<0.01）；与MOD组相比，JHF组和PFT‑α组KRT8、p53荧光表达水平明显减少（P<0.01）。各组KRT8荧光与p53荧光皮尔森系数>0.5，与CON组相比，各组皮尔森系数有所升高（P<0.05）；与MOD组相比，JHF组、PFD组和PFT‑α组皮尔森系数差异无统计学意义（P>0.05），见图7A~D。结果显示，BLM诱导的HPAEPIC细胞PF模型中同时存在细胞衰老和分化障碍且二者具有相关性，金水缓纤方可以减轻BLM诱导的HPAEPIC细胞衰老和分化障碍，其机制可能与抑制p53‑KRT8通路有关。

3 讨论

肺主气，肾主纳气，肺属金，肾属水，肺金可以滋生肾水，肺虚可致肾虚，肾为先天之本，肾的阴阳虚衰又可加重肺病，肺肾二脏相互配合，协调人体呼吸运动的正常进行^［19］。衰老是人体正常生命活动的自然规律，老年衰弱与五脏虚衰的表现密切相关，其中，肺气虚衰可与不耐活动相应，肾气虚衰可与行动迟缓相应^［20］。在李建生教授团队提出的PF主要病机“正虚络痹积损”中，正虚指的是肺肾气虚。肺肾气虚可致血脉瘀滞，痰浊闭阻，痰浊、瘀血稽留日益损伤正气，积损难复终致肺失所用^［10］。金水缓纤方以人参、熟地为君补益肺肾， 浙贝母、麦冬、牡丹皮、瓜蒌、陈皮等养阴化痰、活血理气，主治PF后期肺肾气虚、痰瘀互结之证^［21］。

肺损伤后再生的ATⅡ分为增殖、细胞周期停滞和转分化3种不同的细胞亚群，在细胞周期阻滞亚群中TGF‑β信号高度上调，在转分化细胞亚群中TGF‑β信号相对下调^［22］；PF中TGF‑β的持续活化使再生的ATⅡ持续处于早期分化状态，难以进入晚期分化状态^［23］。这2种说法都支持在PF ATⅡ分化为ATⅠ的过程中存在许多的中间细胞，ATⅡ难以成功分化为ATⅠ^［24］。在正常的肺中，中间细胞数量很少。而在损伤的肺中，中间细胞的数量明显增加，低表达ATⅡ和ATⅠ标记物基因，高表达相似的标志基因，如KRT8、紧密连接蛋白4（claudin 4，CLDN4）和角蛋白19（keratin 19，KRT19），并且表现出细胞衰老的迹象^{［13，25］}。最新的研究表明中间细胞并不等同于ATⅡ到ATⅠ的过渡，过渡是一种明确方向的单向过程，而中间细胞往往是一种无方向的状态，不是从ATⅡ到ATⅠ的短暂过程，实际上并不参与功能修复。特别是KRT8高表达状态，并没有实现ATⅡ到ATⅠ的转换，反而停止了上皮修复并参与纤维化^［26］。角蛋白是上皮细胞骨架的一部分，对于上皮细胞和组织的机械稳定性和完整性具有重要意义^［27］。KRT8是中间细胞特异性标志物中常见表达之一，在各种类型的肺损伤模型和人类PF中能检测到高表达的KRT8，且KRT8多在不表达SPC的鳞状细胞中高表达，同时具有p53活化和细胞衰老的转录特征^［28］。

衰老是肺部疾病的潜在驱动因子，肺泡干细胞的老化与包括肺纤维变性在内的许多慢性肺部疾病有关。年轻和衰老的肺泡干细胞在稳定状态下没有明显差异，而在BLM诱导的老年小鼠中，肺泡干细胞炎症反应增强、脂类代谢减少^［29］。在肺损伤后，肺泡干细胞增殖分化产生过渡型细胞状态，这种过渡状态直接受TP53信号调节，易发生衰老和受DNA损伤^［9］。在PF中，衰老的肺泡上皮细胞失去再生和修复的能力，并通过分泌促纤维化因子、趋化因子等，促进异常和持续的成纤维细胞活化。在BLM诱导的ATⅡ细胞PF模型中，细胞形态发生改变，细胞大小和溶酶体质量增加，并出现不可逆的生长停滞^［30］，细胞多停滞于G2期，p21、p53、IL‑8、IL‑1α等表达增多^［16］。PFT‑α是一种p53抑制剂，抑制p53依赖性的p53应答基因转录^［31］。在本研究中，BLM诱导48 h建立的HPAEPIC细胞模型中炎症因子IL‑6、IL‑8水平上调，衰老相关分泌因子p21、p53水平上调，ATⅡ分化中间细胞标志物KRT8、CLDN4上调，α‑SMA、N‑CAD蛋白水平上调，细胞多停滞在G2期，p21荧光和KRT8荧光皮尔森系数>0.5，提示该细胞模型中存在细胞衰老和分化障碍，且二者具有相关性。p53、p21、CLDN4、KRT8、α‑SMA、N‑CAD表达下降后，JHF和PFT‑α组细胞纤维化、衰老程度和分化障碍减轻，提示金水缓纤方可能通过调控p53‑KRT8信号减轻HPAEPIC细胞衰老和分化障碍。

综上所述，BLM诱导的HPAEPICS细胞纤维化模型中存在细胞衰老和分化障碍，且二者具有相关性。金水缓纤方可以改善BLM诱导的HPAEPIC细胞PF，其机制可能与抑制p53‑KRT8通路，减轻HPAEPIC细胞衰老和分化障碍有关。

作者贡献度说明：

王宇：实验操作、数据统计分析、撰写论文；余海滨：实验设计、实验内容统筹与规划；韩瑞婷、沈峻岭：动物造模及实验技术指导；王宇、游梦月、余本嫚、陈媛媛：给药干预。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家重点研究计划中医药现代化重点专项(2023YFC3502604)

河南省自然科学基金(222300420221)

河南省中医药研究重大专项(2022ZYZD04)

河南省中医药科学研究专项(2021JDZY102)

河南省中医药科学研究专项(2023ZXZX1033)

郑州市协同创新中心专项(2023XTCX043)