菟丝子有效部位筛选与抗乳腺癌作用机制研究

Screening effective sites of Cuscuta and anti‑breast cancer mechanism

摘要

目的 探讨菟丝子抗乳腺癌的有效部位，研究其作用机制。 方法 采用不同极性的有机溶剂提取菟丝子，并在药效指导下进行抗肿瘤有效部位筛选。采用噻唑蓝（MTT）比色法检测菟丝子不同提取部位对5种肿瘤细胞株增殖的影响，筛选最佳提取部位以及肿瘤敏感株；倒置显微镜观察、划痕实验、Transwell实验、Annexin V‑FITC/PI双染法分别检测菟丝子95%醇提物对MCF‑7细胞形态变化、迁移、侵袭及凋亡的影响；Western blot检测MCF‑7细胞内PI3K、p‑PI3K、AKT、p‑AKT、Bax、Bcl‑2蛋白表达。 结果 菟丝子各提取部位能抑制MCF‑7、SGC‑7901、HepG‑2、Hela和A549细胞增殖。其中，氯仿、95%乙醇提取部位对MCF‑7细胞株增殖抑制效果优于其他部位，半数抑制浓度（IC₅₀）分别为14.3、738.0 μg/mL。菟丝子95%醇提物400、800、1 200 μg/mL作用于MCF‑7后，与空白对照组相比，细胞变圆、固缩，细胞团内相邻细胞间隙加大，迁移和侵袭能力逐渐减弱、细胞凋亡率升高（P<0.05），并呈时间、剂量依赖性；Western blot结果显示菟丝子95%醇提物能够下调MCF‑7细胞内p‑PI3K、p‑AKT、Bcl‑2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，升高Bax/Bcl‑2比值（P<0.05）。 结论 菟丝子不同提取部位对5种肿瘤细胞增殖有抑制作用，其中，菟丝子氯仿、95%醇提物对MCF‑7细胞增值抑制效果较好；菟丝子95%醇提物抗乳腺癌作用机制可能与调控PI3K/AKT通路，调控下游Bcl‑2、Bax蛋白表达，参与线粒体凋亡途径有关。

Abstract

Objective To investigate the effective breast cancer sites of Cuscuta and study its mechanism of action. Methods Extraction of Cuscuta with organic solvents of different polarity and the effective parts were screened under the guidance of pharmacological effects. The effects of different extraction sites of Cuscuta on the proliferation of 5 tumor cell lines were assessed using MTT colorimetry， and the optimal extraction sites and tumor‑sensitive strains were identified. The impact of a 95% alcohol extract from Cuscuta on the morphological changes， migration， invasion， and apoptosis of MCF‑7 cells was evaluated through inverted microscope observation， strip testing， Transwell assay， and Annexin V‑FITC/PI double staining. Western blot was employed to analyze the expression levels of PI3K， p‑PI3K， AKT， p‑AKT， Bax， and Bcl‑2 proteins in MCF‑7 cells. Results The proliferation of MCF‑7， SGC‑7901， HepG‑2， Hela and A549 cells was inhibited by all the extracted parts of Cuscuta. Among them， the inhibitory effect of chloroform and 95% alcohol extract from Cuscuta on the proliferation of MCF‑7 cell line was better than the other parts. The median inhibitory concentration （IC₅₀） was 14.3 and 738.0 μg/mL， respectively. After treatment with 400， 800， 1 200 μg/mL of 95% alcohol extract of Cuscuta on MCF‑7 cells， compared to the control group， the cells became round and constricted. The space between adjacent cells in the cell mass increased and the migration and invasion ability were gradually weakened. Additionally， there was an increase in apoptosis rate （P<0.05）， in a time‑and dose‑dependent manner. Western blot results showed that Cuscuta's 95% alcohol extract could down‑regulate the expression of p‑PI3K，p‑AKT， and Bcl‑2 proteins in MCF‑7 cells while up‑regulating Bax protein expression as well as increasing the ratio of Bax/Bcl‑2 （P<0.05）. Conclusion Different extracts of Cuscuta demonstrated significant inhibitory effects on the proliferation of 5 tumor cell lines. Notably， the chloroform and 95% alcohol extract of Cuscuta exhibited enhanced inhibitory effects on MCF‑7 cells. The anti‑breast cancer mechanism attributed to the 95% alcohol extract of Cuscuta may be linked to its modulation of the PI3K/AKT pathway， regulation of downstream Bcl‑2 and Bax protein expressions， and participation in the mitochondrial apoptosis pathway.

Graphical abstract

关键词

菟丝子 / 乳腺癌 / PI3K/AKT信号通路 / 细胞凋亡

Key words

Cuscuta / Breast cancer / PI3K/AKT signaling pathway / Apoptosis

根据国家癌症中心发布的数据显示，癌症已经成为我国人口死亡的主要原因^［1］。乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，治疗策略因分子亚型而异，主要包括局部区域（手术和放射治疗）和全身治疗（化疗、激素受体阳性疾病的内分泌治疗等）两种^［2‑4］；在目前的治疗方法下，绝大部分早期非转移性乳腺癌患者有被治愈的希望，而伴有远处器官转移的晚期患者其治愈难度明显增加^［5，6］。近年来，传统中医药在抗肿瘤、抗肿瘤复发转移、逆转耐药、调控免疫等方面显示了其优越性，还可预防和治疗肿瘤的心肌毒性，其多途径、多靶点的特征更能实现系统性的治疗^［7，8］。

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子（Cuscuta australis R. Br.）或菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟种子，现代药理学研究表明，菟丝子具有抗衰老、免疫调节、保肝、降血糖、调节生殖内分泌激素水平等作用^［9，10］。菟丝子及其复方能防止体内细胞癌变，抑制致癌物质产生，促进免疫细胞再生，增强机体自身抗癌能力^{［11，12］}。

B淋巴细胞瘤‑2（B‑cell lymphoma‑2，Bcl‑2）与Bcl‑2相关X蛋白（Bcl‑2 associated X protein，Bax）分别是凋亡家族中抑制凋亡和促进凋亡的代表蛋白，二者的相对平衡是细胞内稳态的关键，Bax/Bcl‑2的高比例常被认为是促进细胞凋亡发生的重要条件^［13］。磷脂肌醇3激酶（PI3K）一旦激活会促进3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）的生成，进而诱导丝氨酸‑苏氨酸蛋白激酶（AKT）磷酸化为p‑AKT，促进细胞存活和增殖^［14］。抑制PI3K/AKT信号通路传导可升高Bax/Bcl‑2比率来调节线粒体功能，诱导细胞凋亡^［15］。课题组前期研究表明，菟丝子醇提物可明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，对菟丝子醇提物化学成分进行UPLC/Q‑TOF‑MS分析，得到46个候选化合物^［16］。在前期研究的基础上，本研究通过体外培养5种肿瘤细胞株，对菟丝子有效抗肿瘤部位进行筛选，初步研究其抗乳腺癌的机制。为开发菟丝子成为治疗乳腺癌的临床新药提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞（MCF‑7）、人胃癌细胞（SGC‑7901）、人肝癌细胞（HepG‑2）、人宫颈癌细胞（Hela）、人肺癌细胞（A549）购于中国科学院上海细胞库。菟丝子（黑龙江省萝北县菟丝子种植基地），经哈尔滨商业大学药学院鉴定为旋花科植物菟丝子（Cuscuta chinensis Lam） 的干燥成熟种子。Annexin V‑FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0220）；5‑氟尿嘧啶（5‑FU）（阿拉丁）；MTT、PMSF（自兰杰柯科技有限公司，批号分别为BL186‑250、BL507A‑8）；Matrix‑Gel™基质胶、Bradford 蛋白定量试剂盒、5×蛋白还原型上样缓冲液（上海碧云天生物科技有限公司，批号：081423230816、022521210525、070121211012）；蛋白Marker（广州赛国生物科技有限公司，批号：01146562）；PI3K、AKT、p‑AKT、Bcl‑2、Bax、GAPDH（万类生物科技有限公司，批号分别为NO3073380、NO4220003、NO4294074、NO4261556、NO4071637、NO4161114）；p‑PI3K（北京博奥森生物技术有限公司，批号：BJ07207167）；HR标记山羊抗兔（北京博奥森生物技术有限公司，批号：BJ08079044）。ECO‑170P‑230型二氧化碳培养箱（美国NBS公司）；CX21型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；MLS‑3781L‑P型高压蒸汽灭菌锅（日本panasonic公司）；iMark型酶标仪（深圳市广深德仪器制造有限公司）；DYY‑7C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Guava easyCyte型流式细胞仪（美国Luminex公司）。

1.2 方法

1.2.1 菟丝子不同提取部位的制备

取菟丝子，粉碎，分别以水、35%、55%、75%、95%乙醇为溶剂，浸泡过夜（料液比1∶10），各提取3次，微沸，每次1 h，合并滤液，分别浓缩旋蒸得水和不同浓度醇提物浸膏；95%醇提物浸膏用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿分别萃取4次，合并萃取液，浓缩即得正丁醇、乙酸乙酯、氯仿浸膏。见图1。

1.2.2 菟丝子不同提取部位对5种肿瘤细胞增殖的影响

取对数生长期的MCF‑7、SGC‑7901、HepG ‑2、Hela、A549细胞，调整密度为1×10⁵个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，另设空白对照组，各组设置3个复孔，培养24 h后，空白对照组中加入完全培养基，给药组加入含有菟丝子各个提取部位不同药物浓度的培养基，阳性对照组加入含有5‑FU的培养基；72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL ）溶液，继续培养4 h，弃上清，加入DMSO后，避光震荡10 min，使用酶标仪于490 nm波长处检测各孔的吸光度（A₄₉₀）值；计算药物作用于5种细胞株的半数抑制浓度（IC₅₀）。

1.2.3 MCF‑7细胞形态学观察

取对数生长期的MCF‑7细胞，按照1×10⁵/mL接种于6孔板中，每孔1 mL，培养24 h，待细胞完全贴壁后，加入含有400、800、1 200 µg/mL菟丝子95%醇提物［低（L）、中（M）、高（H）剂量组］的无血清培养基1 mL，同时设置空白对照组（control）、阳性药组（5‑FU，50 µg/mL）；37 ℃、5%CO₂培养箱中培养24、48 h，于倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.4 划痕实验检测MCF‑7细胞迁移能力

将MCF‑7细胞按照1×10⁶个/mL接种于6孔板，每孔1 mL。当每孔细胞长至完全融合，用200 µL无菌枪头垂直在单层细胞上划痕，PBS清洗，去除漂浮细胞，按照“1.2.3”项下方法给药，分别在药物作用0、24、48 h后用倒置显微镜在同一位置拍照，ImageJ软件测量划痕面积，计算细胞划痕愈合率。

1.2.5 Transwell实验检测MCF‑7细胞侵袭能力

将MCF‑7细胞（1×10⁶个/mL）接种于6孔板中，培养24 h，按照“1.2.3”项下方法给药，药物作用48 h后，收集各组细胞于无血清培养基中，调整细胞密度为5×10⁶个/mL，Transwell小室内加200 µL细胞悬液，24孔板下室中加500 µL含10% FBS的培养液，培养48 h后，取出小室，棉签擦去上室细胞，固定染色。显微镜下观察并计数，每个小室随机选择3个不重叠视野计数。

1.2.6 流式细胞仪检测MCF‑7细胞凋亡

取对数生长期的MCF‑7细胞，以1×10⁶个/mL接种于6孔板，培养24 h后，按照“1.2.3”项下方法给药，药物作用48 h后，弃去培养基，胰酶消化收集细胞。Binding buffer工作液重悬细胞，每组加入5 µL Annexin V‑FITC和PI染液对细胞进行染色，避光染色15 min，加入400 µL Binding buffer，尼龙网滤过，采用流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.2.7 Western blot法检测细胞蛋白表达

按照“1.2.3”项下方法对细胞进行给药，48 h后，收集细胞，加入细胞裂解液，于100 ℃恒温仪中裂解10 min，提取总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白样品经十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭2 h后分别孵育一抗与二抗，加入ECL显影成像，分析条带灰度值，计算各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

数据分析用SPSS Statistics 21.0 软件进行处理。各组计量资料结果以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 菟丝子不同提取部位制备

水提物得膏率为28.19%，35.00%、55.00%、75.00%、95.00%乙醇提物得膏率依次为26.59%、20.16%、18.24%、14.81%，正丁醇部位提取物得膏率为6.27%，乙酸乙酯部位提取物得膏率为6.40%，氯仿部位提取物得膏率为6.09%。

2.2 菟丝子不同提取部位对5种肿瘤细胞增殖抑制作用

菟丝子提取物对5种肿瘤细胞株的活性抑制顺序为：MCF‑7>HepG‑2>SGC‑7901>A549>Hela；其中，菟丝子氯仿、95%醇提物对各肿瘤细胞株的增殖抑制作用优于其他提取部位。由于氯仿试剂本身具有一定的毒性，考虑在药物提取时有氯仿残留，且得膏率极低，菟丝子95%醇提物对MCF‑7细胞的IC₅₀值为738 μg/mL，因此选择菟丝子95%醇提物，MCF‑7肿瘤细胞株作为后续实验研究对象。见表1。

2.3 倒置显微镜观察MCF‑7细胞形态学变化

Control细胞呈正常形态生长，呈椭圆形，细胞间隙小且贴壁成团生长；与Control相比，各给药组作用24、48 h后，大多数细胞形态由长梭形变为圆形，固缩，细胞团内相邻细胞间的间隙加大，并呈时间、剂量相关性。见图2。

2.4 划痕试验检测MCF‑7细胞的迁移能力

与Control相比，400、800、1 200 μg/mL的菟丝子95%醇提物明显抑制MCF‑7细胞迁移能力（P<0.05），并呈时间、剂量相关性。见图3、4。

2.5 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力

与Control相比，400、800、1 200 μg/mL的菟丝子95%醇提物可明显抑制MCF‑7细胞侵袭能力（P<0.01），并呈时间、剂量相关性，见图5。

2.6 流式细胞仪检测MCF‑7细胞凋亡

与Control相比，400、800、1 200 μg/mL的菟丝子95%醇提物明显促进MCF‑7细胞凋亡（P<0.01），呈时间、剂量相关性，见图6。

2.7 Western blot法检测MCF‑7细胞相关蛋白表达

与Control比较，400、800、1 200 μg/mL的菟丝子95%醇提物明显降低MCF‑7细胞内p‑PI3K、p‑AKT、Bcl‑2蛋白含量（P<0.01），升高Bax蛋白含量（P<0.05），使细胞内Bax/Bcl‑2比值也明显上升（P<0.05），呈剂量相关性，见图7。

3 讨论

2020年，乳腺癌首次取代肺癌，成为发病率最多的癌症^{［17，18］}。我国乳腺癌发病人数每年超过160万，死亡人数高达120万，发病率和死亡率持续上升，对女性生命健康造成了严重威胁^{［18，19］}。乳腺癌的诱因包括患者年龄、乳腺增生、高脂饮食、乳腺癌家族史、饮酒等^［20］。目前治疗乳腺癌主要以手术、药物化疗、放射治疗等一些新辅助治疗等综合治疗方法为主，但常伴有恶心、呕吐、脱发、记忆力下降、认知功能障碍等严重不良反应，患者在承受癌症痛苦的同时还要忍受不良反应^［21］，增添了心理压力、带来二次伤害^［22］。近年来随着中医药的发展，中药抗肿瘤作用受到广泛关注。菟丝子作为我国传统的补益类中药，具有补益肝肾、固精缩尿、安胎、明目之功效^{［23‑25］}，课题组前期初步研究表明菟丝子具有一定的抗肿瘤作用，但其抗乳腺癌的作用机制尚不完全明确。本研究基于体外药效实验筛选菟丝子抗肿瘤有效部位为氯仿提取物及95%醇提物，其相对敏感细胞株为MCF‑7，由于氯仿得膏率低、低毒、为可疑致癌物，后续研究选取95%醇提取部位，对其抗乳腺癌作用机制进一步探索。

PI3K/AKT信号通路参与细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程^［26］，在乳腺癌多种病理变化中起着重要作用^{［27，28］}。PI3K作为一种脂质激酶存在于细胞质中，可被受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）激活，导致3，4磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转化为3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），进一步激活AGC家族的AKT募集到细胞膜上，在多个位点被多种蛋白激酶磷酸化进入细胞质中，激活下游底物，参与细胞凋亡等途径^{［29，30］}。

细胞凋亡途径包括外源性（死亡受体介导凋亡）信号通路和内源性（细胞线粒体介导凋亡）信号通路，其中细胞线粒体介导凋亡途径主要通过调节Bcl‑2、Bax等Bcl‑2蛋白家族的表达，破坏线粒体膜促进胞内释放CytC，从而激活下游促凋亡基因Caspase‑3，产生Caspase级联反应^{［31，32］}。Western blot结果显示，菟丝子95%醇提物可明显下调MCF‑7细胞内p‑PI3K、p‑AKT、Bcl‑2蛋白表达（P<0.01），上调Bax表达（P<0.05），升高Bax/Bcl‑2比值（P<0.05），可能通过介导PI3K/AKT信号通路，启动细胞的内源性凋亡途径，促进MCF‑7细胞凋亡。

本研究发现，菟丝子95%醇提取物能更好的抑制MCF‑7细胞增殖，作用机制可能与介导PI3K/AKT信号通路调控下游Bcl‑2、Bax蛋白表达，启动线粒体介导的凋亡途径有效。菟丝子抗肿瘤作用的药效物质基础有待于进一步的探究。

作者贡献度说明：

宋辉、孙向明：文章撰写；单文猜、汤静：完成实验；王玉涵、黄晓俏、郎朗：数据处理分析；于蕾、汲晨锋：手稿修改、润色、最终审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Feng R， Su Q， Huang X， et al. Cancer situation in China： What does the China cancer map indicate from the first national death survey to the latest cancer registration［J］. Cancer Commun （Lond）， 2023， 43（1）：75‑86.

[2] Sung H， Ferlay J， Siegel RL， et al. Global cancer statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries［J］. CA Cancer J Clin， 2021，71（3）：209‑249.

[3] Sevimli TS， Ghorbani A， Gakhiyeva F， et al. Boric acid alters the expression of DNA double break repair genes in MCF‑7‑derived breast cancer stem cells［J］. Biol Trace Elem Res，2024， 202（9）：3980‑3987.

[4] Huppert LA， Gumusay O， Idossa D， et al. Systemic therapy for hormone receptor‑positive/human epidermal growth factor receptor 2‑negative early stage and metastatic breast cancer［J］. CA Cancer J Clin， 2023， 73（5）：480‑515.

[5] Gao JJ， Cheng J， Bloomquist E， et al. CDK4/6 inhibitor treatment for patients with hormone receptor ‑positive， HER2‑negative， advanced or metastatic breast cancer： A US food and drug administration pooled analysis［J］. Lancet Oncol， 2020， 21（2）：250‑260.

[6] Katsura C， Ogunmwonyi I， Kankam HK， et al. Breast cancer： Presentation， investigation and management［J］. Br J Hosp Med （Lond）， 2022， 83（2）：1‑7.

[7] 陈玉洁， 孔祥定， 陈静， 等. 中医药干预乳腺癌肿瘤微环境的研究进展［J］.河南中医， 2021， 41（9）： 1442‑1446.

[8] Chen YJ， Kong XD， Chen J， et al. Research progress of TCM intervention on tumor microenvironment of breast cancer［J］. Henan Traditional Chin Med， 2021， 41（9）：1442‑1446.

[9] Sun Q， He M， Zhang S， et al. Traditional Chinese medicine and colorectal cancer： Implications for drug discovery［J］. Front Pharmacol， 2021， 12：685002‑685024.

[10] 陈国瑞， 俞爽， 胡娟娟， 等. 菟丝子的炮制历史沿革、炮制方法及药理作用研究进展［J］.亚太传统医药， 2024， 20（12）：243‑248.

[11] Chen GR， Yu S， Hu JJ， et al. Research progress on processing history evolution， processing methods and pharmacological effects of Cuscuta chinensis ［J］. Asian Pac Tradit Med， 2024，20（12）：243‑248.

[12] 陈鲁宁， 胡扬， 辛国松， 等. 菟丝子化学成分、药理作用研究进展及其质量标志物（Q‑Marker）预测［J］.中草药， 2024， 55（15）：5298‑5314.

[13] Chen LN， Hu Y， Xin GS， et al. Research progress on chemical constituents， pharmacological effects of Cuscutae semen and its quality marker prediction［J］. Chin Tradit Herb Drugs， 2024，55（15）：5298‑5314.

[14] 刘绍明. 二仙赞育方治疗弱精子症的临床及作用机制研究［D］.南京：南京中医药大学， 2022.

[15] Liu SM. Study on the clinical and mechanism of erxian zanyu formula in the treatment of asthenospermia［D］. Nanjing：Nanjing University Chinese Medicine， 2022.

[16] 汤静， 宋辉， 孙向明， 等. 中药菟丝子抗肿瘤作用研究进展［J］.特产研究， 2023， 45（2）：131‑136.

[17] Tang J， Song H， Sun XM， et al. Research progress on the antitumor effect of Cuscuta and its compound［J］. Spec Wild Econ Anim Plant Res， 2023， 45（2）：131‑136.

[18] 宋辉， 黄晓俏， 孙向明， 等. 基于网络药理学、分子对接和动物实验探讨菟丝子醇提物抗乳腺癌作用机制［J］.中草药，2024，55（14）：4747‑4758.

[19] Song H， Huang XQ， Sun XM， et al. Mechanism of alcohol extract of Cuscuta chinensis against breast cancer based on network pharmacology， molecular docking and animal experiments［J］. Chin Tradit Herb Drugs， 2024， 55（14）：4747‑4758.

[20] Sun X， Liu Y， Zhou S， et al. Circular dorsal ruffles disturb the growth factor‑induced PI3K‑AKT pathway in hepatocellular carcinoma hep3B cells［J］. Cell Commun Signal， 2022， 20（1）：102‑117.

[21] Xu K， Liu Z， Pan S， et al. BMSCs attenuate radiation‑induced brain injury induced hippocampal neuronal apoptosis through a PI3K/Akt/Bax/Bcl‑2 signaling pathway［J］. Brain Res， 2024， 1829：148795‑148803.

[22] 汤静. 基于PI3K/AKT信号通路的菟丝子抗乳腺癌作用机制研究［D］.哈尔滨：哈尔滨商业大学， 2023.

[23] Tang J. Mechanism of Cuscuta against‑breast：Cancer based on PI3K/AKT signaling pathway［D］.Harbin： Harbin University Commerce， 2023.

[24] Cejuela M， Gil‑Torralvo A， Castilla MÁ， et al. Abemaciclib， palbociclib， and ribociclib in real world data： A direct comparison of first‑line treatment for endocrine‑receptor‑positive metastatic breast cancer［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（10）：8488‑8503.

[25] Cao W， Chen HD， Yu YW， et al. Changing profiles of cancer burden worldwide and in China： A secondary analysis of the global cancer statistics 2020［J］. Chin Med J， 2021， 134（7）：783‑791.

[26] Tao X， Li T， Gandomkar Z， et al. Incidence， mortality， survival， and disease burden of breast cancer in China compared to other developed countries［J］. Asia Pac J Clin Oncol， 2023， 19（6）：645‑654.

[27] Lei S， Zheng R， Zhang S， et al. Breast cancer incidence and mortality in women in China： Temporal trends and projections to 2030［J］. Cancer Biol Med， 2021， 18（3）：900‑909.

[28] Chang JS， Chang JH， Kim N， et al. Intensity modulated radiotherapy and volumetric modulated arc therapy in the treatment of breast cancer： An updated review［J］.J Breast Cancer， 2022， 25（5）：349‑365.

[29] 梁霄， 李娅兰， 白皓天， 等. 基于生物信息学的乳腺癌关键基因筛选及实验验证［J］.海南医学院学报， 2023， 29（1）： 51‑62，71.

[30] Liang X， Li YL， Bai HT， et al. Bioinformatics screening of breast cancer‑related genes and potential drug research［J］. J Hainan Med Univ， 2023， 29（1）：51‑62，71.

[31] Wu H， Zhu B， Li D， et al. Cuscuta chinensis Lam. Protects against light‑induced retinal degeneration： Therapeutic implications for photoreceptor degenerative disorders［J］. Front Pharmacol， 2022， 13：904849‑904864.

[32] Xu D， Lu M， Liu Y， et al. An analysis of the clinical medication rules of traditional Chinese medicine for polycystic ovary syndrome based on data mining［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2023， 2023：6198001‑6198011.

[33] 王莹， 张婧如， 田伟， 等. 菟丝子及其提取物药理机制研究进展［J］. 中国中医基础医学杂志， 2023， 29（11）：1961‑1964.

[34] Wang Y， Zhang JR， Tian W， et al. Progress on the pharmacological mechanism of Cuscuta chinensis and its extracts［J］. J Basic Chin Med， 2023， 29（11）：1961‑1964.

[35] 姜莹， 王博， 李诗雨， 等. PI3K/AKT信号通路与乳腺病变弹性特征的相关性［J］. 中国医学影像学杂志， 2024， 32（3）： 257‑262.

[36] Jiang Y， Wang B， Li SY， et al. Correlation between Pl3K/AKT signaling pathway and elastic characteristies of breast lesions［J］. Chin J Med Imaging， 2024， 32（3）：257‑262.

[37] Li W， Liu J， Zhang B， et al. Transcriptome analysis reveals key genes and pathways associated with metastasis in breast cancer［J］. Onco Targets Ther， 2020， 13：323‑335.

[38] Hoxhaj G， Manning BD. The PI3K‑AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism［J］. Nat Rev Cancer， 2020， 20（2）：74‑88.

[39] Yuan Y， Long H， Zhou Z， et al. PI3K‑AKT‑targeting breast cancer treatments： Natural products and synthetic compounds［J］. Biomolecules， 2023， 13（1）：93‑115.

[40] Kearney AL， Norris DM， Ghomlaghi M， et al. Akt phosphorylates insulin receptor substrate to limit PI3K‑mediated PIP3 synthesis［J］. Elife， 2021， 10：66942‑66973.

[41] Yu Q， Lan T， Ma Z， et al. Lobaplatin induces apoptosis in t24 and 5637 bladder cancer cells by regulating Bcl‑2 and Bax expression and inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway［J］. Translat Androl Urol， 2023， 12（8）：1296‑1307.

[42] 顾燕频， 朱光， 刘玮， 等. 紫菟二仙汤对雷公藤多苷致早发性卵巢功能不全大鼠卵巢凋亡相关蛋白的影响［J］. 新中医， 2023， 55（13）：29‑33.

[43] Gu YP， Zhu G， Liu W， et al. Effect of Zitu Erxian Decoction on ovarian apoptosis related‑proteins in rats with premature ovarian insufficiency induced by tripterygium glycosides［J］. New Chin Med， 2023， 55（13）：29‑33.

基金资助

黑龙江省自然科学基金项目(LH2024H036)

黑龙江省“双一流”学科协同创新成果项目(LJGXCG2024‑P33)

黑龙江省博士后项目(LBH‑Z20023)

黑龙江省中医药管理局中医药科研课题项目(ZHY2024‑098)