血塞通软胶囊对东莨菪碱致阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力及突触可塑性的影响研究

Effect of Xuesaitong soft capsule on learning memory ability and synaptic plasticity in mice with scopolamine‑induced Alzheimer's disease model

摘要

目的 探究血塞通软胶囊（Xuesaitong soft capsule，XST）对东莨菪碱所致阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力的影响及突触可塑性的调节作用。 方法 90只雄性昆明小鼠随机分为空白（Control）组，模型（Model）组，盐酸多奈哌齐（DPH）组及血塞通低、中、高剂量（XST‑L、XST‑M、XST‑H）组。通过腹腔注射东莨菪碱制备阿尔茨海默病模型，使用Morris水迷宫检测小鼠空间认知记忆功能改变；H&E染色观测小鼠海马CA1区和皮质区细胞形态改变；透射电镜观察海马超微结构变化；ELISA测定脑组织中环磷酸腺苷（cAMP）含量变化，免疫组化染色检测突触素（SYN）、生长相关蛋白‑43（GAP‑43）、突触后致密物‑95（PSD‑95）蛋白水平表达；Western blot检测PSD‑95、GAP‑43、SYN、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）、蛋白激酶A（PKA）在海马和皮质区的表达。 结果 Morris水迷宫结果显示，与Control组比较，Model组小鼠平均逃避潜伏时间明显延长，穿越平台次数出现减少（P<0.05），游泳轨迹冗长杂乱。与Model组相比，经XST治疗后小鼠平均逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数增加（P<0.05），探寻轨迹简短清晰。H&E染色结果显示，Model组细胞层变薄，神经元排列松散紊乱，部分细胞胞膜破裂，细胞核深染，染色质裂解，突起不同程度消失。与Model组比较，各用药组上述病理变化得到不同程度改善。透射电镜观察结果显示，Model组突触结构不完整，突触间隙模糊，突触小泡以及突触前致密物质减少，药物干预后突触结构相对完整，突触间隙清晰，突触小泡密度增加，线粒体丰富，突触前致密物增多，突触后膜增厚。ELISA结果显示，与Control组比较，Model组cAMP蛋白表达明显减少（P<0.01）；与Model组比较，海马区DPH组和XST‑H组cAMP含量明显增加（P<0.05），皮质区DPH组、XST‑M组和XST‑H组cAMP含量明显升高（P<0.05）。免疫组化结果显示，与Control组比较，Model组SYN、GAP‑43、PSD‑95蛋白表达均呈明显下降趋势（P<0.01）。与Model组相比，其余各组以上蛋白表达均有不同程度的增加（P<0.05）。Western Blot结果显示，与Control组比较，Model组PSD‑95、GAP‑43、CREB、PKA和SYN蛋白表达明显减少（P<0.05）；与Model组比较，药物干预后PSD‑95、GAP‑43、CREB、PKA和SYN表达水平不同程度增加（P<0.05）。 结论 XST能够改善阿尔兹海默病模型小鼠学习记忆能力，其作用机制可能与激活cAMP/PKA/CREB信号通路、修复突触可塑性相关。

Abstract

Objective To investigate the effects of Xuesaitong soft capsule （XST） on the cognitive functions of scopolamine‑induced Alzheimer's disease in mice and the modulation of synaptic plasticity. Methods A total of 90 male Kunming mice were randomly divided into the blank （Control） group， the model （Model） group， the donepezil hydrochloride （DPH） group， and the Xuesaitong low， medium， and high dosage （XST‑L， XST‑M， XST‑H） groups. The Alzheimer's disease model was prepared by intraperitoneal injection of scopolamine， and the spatial cognitive memory function of mice was detected by Morris water maze. Hemoxylin‑eosin staining （H&E） was used to observe the morphological changes in the CA1 and cortical areas of the mouse hippocampus. Transmission electron microscopy was used to observe ultrastructural changes in the hippocampus. ELISA was used to determine changes in the content of cyclic adenosine monophosphate （cAMP） in brain tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of synaptophysin （SYN）， growth‑associated protein‑43 （GAP‑43）， and postsynaptic densifier‑95 （PSD‑95） proteins. Western blot was performed to detect the expression of PSD‑95， GAP‑43， SYN， cyclic‑AMP response binding protein （CREB）， and protein kinase A （PKA） in the hippocampus and cortical regions. Results The results of Morris water maze showed that compared to the Control group， the mice in the Model group had a significantly longer mean escape latency， showed a decrease in the number of traversing platforms （P<0.05）， and had lengthy and disorganised swimming trajectories. Compared to the Model group， the average escape latency of mice treated with XST was significantly shorter， the number of traversing platforms increased （P<0.05）， and the exploratory trajectories were brief and clear. H&E staining results showed that the cell layer of the Model group was thinned， the neurons were loosely arranged and disordered， the cell membranes of some cells were ruptured， the nuclei of the cells were deeply stained， the chromatin was cleaved， and the protrusions disappeared to varying degrees. Compared to the Model group， the above pathological changes were improved to different degrees in each medication group. The results of transmission electron microscope observation showed that the synaptic structure was incomplete， the synaptic gap was blurred， the synaptic vesicles were reduced， and the presynaptic dense material was reduced in the Model group. The synaptic structure was relatively complete， the synaptic gap was clear， the synaptic vesicles were increased， the mitochondria were enriched， the presynaptic dense material was increased， and the postsynaptic membrane was thickened after the drug intervention. ELISA results showed that cAMP protein expression was significantly reduced in the Model group compared to the Control group （P<0.01）； cAMP contents were significantly increased in the hippocampal region DPH and XST‑H groups compared to the Model group （P<0.05）， and cAMP contents in the cortical region of the DPH， XST‑M， and XST‑H groups were significantly elevated （P<0.05）. Immunohistochemical results showed that the protein expression of SYN， GAP‑43， and PSD‑95 in the Model group showed a significant decreasing trend compared to the Control group （P<0.01）. Compared to the Model group， the expression of the above proteins in the remaining groups increased to different degrees （P<0.05）. Western blot results showed that PSD‑95， GAP‑4C3， CREB， PKA， and SYN protein expression was significantly reduced in the Model group compared to the Control group （P<0.05）； and the expression levels of PSD‑95， GAP‑4C3， CREB， PKA， and SYN were increased to varying degrees after pharmacological interventions compared to the Model group （P<0.05）. Conclusion XST improves cognitive functions in Alzheimer's disease modeled mice， and its mechanism of action may be related to the activation of cAMP/PKA/CREB signaling pathway and repair of synaptic plasticity.

Graphical abstract

关键词

血塞通软胶囊 / 阿尔茨海默病 / 突触可塑性 / 学习记忆能力

Key words

Xuesaitong soft capsule / Alzheimer's disease / Synaptic plasticity / Learning and memory ability

随着全球人口老龄化的加速，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）作为老年痴呆症的重要类型，已成为继心脑血管疾病和癌症之后全球健康面临的又一挑战^［1］。人们为预防和治疗AD实施了多种策略，然而预期效果不佳。中草药三七具有凝血、止痛、消肿等多种药用功效，主要活性成分为三七总皂苷^［2］，具有神经保护的潜在功效^［3］。血塞通软胶囊（Xuesaitong soft capsule，XST）的主要成分为三七总皂苷，可促进神经元生长，改善海马组织病理损伤，保护神经元^［4，5］，在神经系统疾病的治疗中已获得广泛应用。突触作为神经元连接和信息传递的关键部位，对学习记忆至关重要^［6］。关于XST对AD模型小鼠神经行为学的影响目前尚不明确，本研究拟采用腹腔注射东莨菪碱构建AD小鼠模型，从突触可塑性视角探究XST在预防及治疗AD方面的潜在作用及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

90只雄性昆明小鼠，购自江西中医药大学实验动物科技中心，体重（20±2） g，动物许可证号：SCXK（赣）2023‑0001。每笼5只小鼠，饲养温度（25±1） ℃。本实验已获江西中医药大学伦理委员会审批（JZLLSC20240584）。

1.2 试剂与仪器

血塞通软胶囊（每粒0.33 g，含三七总皂苷60 mg，昆明华润圣火药业，国药准字Z19990022）；东莨菪碱（美国MCE，HY‑N0296）；盐酸多奈哌齐片（卫材药业，国药准字H20050978）；苏木精‑伊红染色（hemoxylin‑eosin staining，HE）染色试剂盒（北京索莱宝，G1120）；柠檬酸盐修复液、DAB染色剂（北京中杉金桥，ZLI‑9064、ZLI‑9017）；免疫组化试剂盒（武汉博士德，SA1022）；环磷酸腺苷（cyclic‑adenosine monophosphate，cAMP）酶联免疫吸附测定试剂盒（江莱生物，JL48879）；抗体突触素（synaptophysin，SYN）、PSD‑95、GAP‑43（武汉三鹰17785‑1‑AP、30255‑1‑AP、16971‑1‑AP）；环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclic‑AMP response binding protein，CREB）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）（贝茵莱生物RMAB49164、PAB36705）；Super ECL检测试剂盒（凯基生物KGP1127）；电镜固定液（武汉塞维尔）；丙酮（西陇科学）；甲苯胺蓝染液（国药集团化学试剂）；醋酸双氧铀（北京中镜科仪）。石蜡包埋机、切片机、超薄切片机（德国LEICA）；Morris水迷宫实验仪器（北京思诺达）；光学显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；透射电子显微镜（日本电子JEOL）；多功能酶标仪（美国赛默飞）；电泳仪、电转仪（上海天能）；多功能凝胶成像仪（日本思拓凡Amersham ImagerQuant 800）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及给药

将小鼠随机分为空白（Control）组，模型（Model）组，血塞通低剂量（XST‑L，50 mg/kg）、中剂量（XST‑M，100 mg/kg）、高剂量（XST‑H，200 mg/kg）组，盐酸多奈哌齐（donepezil hydrochloride，DPH）（0.9 mg/kg）组，每组15只。每日按照上述剂量灌胃，Control组及Model组灌胃等体积生理盐水，连续灌胃7 d。第8天开始，除Control组外其余各组灌胃30 min后腹腔注射东莨菪碱（3 mg/kg），持续14 d。第15天起腹腔注射东莨菪碱30 min后进行水迷宫实验，持续7 d。

1.3.2 Morris水迷宫实验

将Morris水迷宫注满水，平均划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个区域，逃生平台放置于第Ⅳ象限内，水面高于平台2 cm左右，并在水中加入墨水，水温保持在（25±1） ℃，适应性游泳1 d。第2天起，从水池4个象限顺时针依次将小鼠放入水中，记录小鼠在90 s内找到平台的时间，记为逃避潜伏期，连续进行5 d。第7天，撤去逃生平台，进行空间探索实验，观察小鼠90 s内游泳轨迹，穿过平台的次数和目标象限的停留时间。

1.3.3 取材

每组随机选取10只小鼠，经心脏灌注取脑，左、右侧脑组织分别存放于4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定24 h以上。其余小鼠快速开颅取脑，于冰台上将海马与皮质分离并存放于冻存管中，置于-80 ℃冰箱备用。

1.3.4 H&E染色

修剪组织至所需部位，依次脱水、透明和包埋，沿视交叉冠状面连续切取4 μm厚度切片，40 ℃烤干。石蜡切片60 ℃烤片2 h，将切片放入二甲苯Ⅰ8 min、二甲苯Ⅱ5 min脱蜡，依次浸入100%、95%、85%、75%乙醇及纯水中各3 min梯度复水，苏木素滴染4 min，纯水洗去浮色，分化液分化3 min，自来水冲洗两遍，每次2 min，伊红滴染1 min，倾倒多余液体，自来水中浸泡2 s，75%、85%、95%、100% Ⅰ、100% Ⅱ乙醇中各脱水2 s，充分晾干后将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各1 min，中性树胶封片。

1.3.5 透射电镜

选取小鼠脑组织中海马部位修剪至1 mm³，放入装有2.5%戊二醛的EP管中进行预固定，随后使用1%四氧化锇进行进一步固定；丙酮浓度按30%、50%、70%、80%、90%、95%、100% Ⅰ、100% Ⅱ、100% Ⅲ的梯度进行脱水；以3∶1、1∶1及1∶3比例混合脱水剂和Epon‑812包埋剂，依次渗透；Epon‑812纯包埋剂包埋；用超薄切片机作60~90 nm超薄切片捞至铜网上；先用醋酸铀染色10~15 min，再用柠檬酸铅染色1~2 min后透射电镜观察、拍照。

1.3.6 酶联免疫吸附测定法（ELISA）

组织匀浆后5 000×g离心10 min取上清，分别将样品和不同浓度标准品按照50 μL每孔加入相应孔中，再每孔加入50 μL Biotin‑抗体工作液。盖上封板膜后37 ℃温育1 h，洗板3次，加入酶结合物工作液，37 ℃温育30 min，洗板5次，加底物37 ℃温育15 min，加入终止液后立即在450 nm波长处测定各孔的OD值。应用ELISACalc计算cAMP含量。

1.3.7 免疫组化染色

切片脱蜡复水，3% H₂O₂滴加于切片上孵育10 min，将切片完全浸泡于pH 6.0的柠檬酸修复液中，微波炉加热至沸腾后立即断电，静置7 min，重复3次后冷却至室温。5% BSA 37 ℃封闭30 min，滴加抗体SYN（1∶1 000）、突触后致密物‑95（post‑synaptic density protein‑95，PSD‑95）（1∶100）、生长相关蛋白‑43（growth‑associatedprotein‐43，GAP‑43）（1∶200）4 ℃孵育过夜。次日将孵育抗体的切片37 ℃复温45 min，滴加二抗37 ℃孵育30 min， DAB（1∶20）染色10 s，苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度脱水后封片观察。

1.3.8 Western blot

提取组织蛋白，采用Bicinchoninic Acid Assay法对蛋白浓度进行测定，与5×还原SDS‑PAGE上样缓冲液稀释，100 ℃水浴加热10 min。根据分子量大小制作适宜浓度的分离胶和浓缩胶，每个泳道按顺序加入20 μg样本进行电泳，200 mA恒流电转1.5 h转至PVDF膜上。5% BSA封闭1 h，-4 ℃孵育过夜PSD‑95（1∶5 000）、GAP‑43（1∶2 000）、CREB（1∶500）、PKA（1∶1 000）、SYN（1∶20 000）。二抗摇床孵育1 h。超敏化学发光显影液滴加于膜上，多功能凝胶成像仪曝光。运用ImageJ测定条带灰度值，以β‑actin为参照计算相对表达量。

1.4 统计学处理

使用SPSS26.0统计分析，以均数±标准差（\overline{x}\pm s）的形式表示结果。定位航行实验结果采用重复测量多因素方差分析，其他实验结果采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 XST对AD小鼠学习记忆的影响

2.1.1 定位航行实验

定位航行结果显示，随着训练次数增加，各组小鼠平均逃避潜伏期均逐渐缩短。Model组与Control组相比，第2天平均逃避潜伏期明显延长（P<0.05），随后3 d出现明显差异（P<0.01），寻找目标轨迹路线冗长且杂乱；用药组与Model组比较，从第3天开始平均逃避潜伏期均不同程度的缩短（P<0.05），寻找目标路程减短。见表1、图1。

2.1.2 空间探索实验

空间探索实验结果显示，与Control组比较，Model组小鼠穿越原平台次数及目标象限停留时间明显减少（P<0.01）；与Model组比较，DPH与XST‑M和XST‑H组穿越原平台次数增加（P<0.05），XST‑L组无明显差异（P>0.05）；DPH组以及XST各剂量组与Model组比较，目标象限停留时间都有不同程度的增多（P<0.05）。见图2、3。

2.2 XST对AD小鼠脑组织病理学的影响

与Control组比较，Model组小鼠海马CA1区细胞层变薄，神经元排列松散紊乱，突起消失，部分胞膜破裂，细胞核深染，染色质裂解。与Model组比较，DPH组和XST各剂量小鼠海马CA1区细胞排列紧密，胞膜完整，胞浆丰富，细胞核呈紫蓝色，核仁清晰明显。与Control组比较，Model组皮质区细胞核深染，染色质裂解；与Model组相比，用药组细胞出现不同程度地改善，胞膜相对完整，胞核呈紫蓝色，核仁明显。见图4。

2.3 XST对AD小鼠脑组织突触超微结构的影响

突触结构包括突触前膜、突触间隙和突触后膜。与Control组比较，Model组突触数量减少，结构不完整且不清晰，突触间隙模糊，突触小泡和突触后致密物质均有所下降，胞浆内细胞器稀疏，线粒体变形肿大明显。与Model组相比，各用药组突触结构相对完整，突触前后膜分界清晰，线粒体丰富，突触前致密物增多，突触小泡较多，突触后膜增厚。见图5。

2.4 XST对AD小鼠海马与皮质区cAMP含量的影响

与Control组比较，Model组小鼠海马及皮质区神经元cAMP蛋白表达明显减少（P<0.01）；与Model组比较，海马区DPH组和XST‑H组cAMP含量明显增加（P<0.05），皮质区DPH组、XST‑M组和XST‑H组cAMP含量明显升高（P<0.05）。见表2。

2.5 XST对AD小鼠突触可塑性相关蛋白表达的影响

2.5.1 XST对AD小鼠海马和皮质区SYN表达的影响

SYN是位于突触囊泡膜上的丰富膜蛋白，与突触功能和结构密切相关，神经元周边棕黄色即为其阳性表达。与Control组比较，Model组小鼠海马及皮质区神经元SYN蛋白表达明显减少（P<0.01）；与Model组比较，海马区DPH组和XST‑M组和XST‑H组SYN蛋白表达增加（P<0.05），XST‑L组无明显差异（P>0.05），皮质区XST‑M组和XST‑H组蛋白表达增加（P<0.05），其余组别无明显差异（P>0.05）。见图6、表3。

2.5.2 XST对AD小鼠海马和皮质区GAP‑43表达的影响

GAP‑43是神经组织特异性磷酸蛋白，分布于神经元等处，GAP‑43表达于胞膜上，呈现为棕黄色免疫反应产物沉积。与Control组比较，Model组小鼠海马与皮质区神经元GAP‑43蛋白表达明显减少（P<0.01）；与Model组比较，各治疗组小鼠海马区GAP‑43蛋白表达不同程度增加（P<0.05），DPH组、XST‑M组和XST‑H组小鼠皮质区GAP‑43蛋白表达不同程度增加（P<0.05），XST‑L组无明显差异（P>0.05）。见图7、表4。

2.5.3 XST对AD小鼠海马和皮质区PSD‑95表达的影响

PSD‑95在神经元胞浆和突起内表达，呈现棕黄色免疫反应产物沉积。与Control组比较，Model组小鼠海马及皮质区神经元PSD‑95蛋白表达明显减少（P<0.01）；与Model组比较，DPH组、XST‑M组和XST‑H组海马PSD‑95蛋白表达不同程度增加（P<0.05），XST‑L组无明显差异，DPH和XST各剂量组皮质区PSD‑95蛋白表达不同程度增加（P<0.05）。见图8、表5。

2.6 XST对AD小鼠PSD‑95、GAP‑43、CREB、PKA和SYN蛋白表达的影响

与Control组比较，Model组小鼠海马及皮质区PSD‑95、GAP‑43、CREB、PKA和SYN蛋白表达明显减少（P<0.05）；与Model组比较，各给药组海马区GAP‑43、CREB、SYN表达水平不同程度增加（P<0.05），DPH组、XST‑M组和XST‑H组PSD‑95、PKA蛋白表达水平明显升高（P<0.05），XST‑L组无明显差异；皮质区给药组PSD‑95、GAP‑43蛋白表达不同程增加（P<0.05），XST‑M组和XST‑H组CREB、SYN表达量明显增加（P<0.05），DPH组和XST‑L组无明显差异，DPH组、XST‑M组和XST‑H组PKA蛋白表达不同程增加（P<0.05）。见图9~11。

3 讨论

AD是导致痴呆症的主要原因之一，表现为记忆力减退、精神和行为异常以及日常活动能力受损。在过去的30多年中，AD的发病率和死亡率都明显上升^［7］。AD在中医属于“痴呆”范畴，其主要病机为髓海失养，神机失用，多属本虚标实之证，本虚以阴精、气血不足为主，标实以痰、气、瘀痹阻脑络为主。XST具有活血祛瘀，通脉活络的功效，主要成分为三七总皂苷。现代研究表明，三七总皂苷具有神经元保护作用^［8］。本研究选用XST作为干预药物，Morris水迷宫结果表明，相较于Model组，各治疗组小鼠逃避潜伏期显现出不同程度的缩短（P<0.05）；目标象限停留时间也有所上升（P<0.05）；同时，DPH组、XST‑M/H组穿越平台次数明显增加（P<0.05），证实XST可改善东莨菪碱致AD神经损伤，为后续研究提供了支持。

突触是神经元之间信息传递的关键部位^［9］，由一个神经元的轴突末梢与另一个神经元的细胞体或树突相互接触，构成完整的神经网络^［10］，对于神经系统学习和记忆具有重要的基础作用。且有研究表明，AD与淀粉样蛋白‑β老年斑的形成、磷酸化tau神经纤维缠结、突触丧失和神经元损伤等一系列神经病理学变化息息相关^［11］。海马作为大脑参与处理记忆和情绪的特定区域^［12］，其相关突触传递和可塑性是学习和记忆不可或缺的因素^［13］。在外部刺激的作用下，突触的超微结构会出现变化，表现为突触间隙的宽度、突触后致密区的厚度以及突触小泡的数量等方面的调整。研究表明，AD与突触及其相关囊泡的信息传递变化有着密切联系，这种动态变化可导致记忆能力的波动^［14］。研究显示，在老年人的海马体脑组织样本中，神经元的树突分支、树突棘以及单位长度棘的密度等突触结构受到损害。同时，突触囊泡相关基因的表达通常表现出下调的趋势^［15］。本课题选定海马CA1区与皮质区为研究对象，以观测XST对AD模型小鼠的学习记忆能力及突触可塑性的影响。H&E结果显示，与Control组比较，Model组海马及皮质区神经元坏死现象明显，小鼠海马CA1区突触超微结构异常，突触结构模糊，突触间隙变宽或完全闭锁，突触小泡数量明显减少，线粒体明显肿胀。经治疗后各组完整突触结构数量增加，突触小泡密集，突触间隙宽度适宜，突触前致密物增加，突触后膜增厚，线粒体大小相对正常。研究结果表明XST对AD模型小鼠病理学变化有改善作用，能起到保护神经元和突触的作用。

当突触间信息传递时，释放的神经递质可作用于突触前后神经细胞，从而引起突触的变化，这一现象通常称之为突触可塑性。突触可塑性主要体现在突触形态结构和功能的动态调整。突触功能的可塑性是指神经元之间通过神经递质或相关蛋白等元素在信息传输过程中所表现出的影响与调节能力，当神经元受损时，突触间的传递效率会发生相应的变化。分布于突触前膜的SYN、GAP‑43和位于突触后膜的PSD‑95是突触的特异性标记蛋白，能够间接地反映突触活性和功能，影响突触神经递质传递，参与突触的可塑性调节^［16］。SYN是一种钙结合糖蛋白，广泛分布于神经突触前膜的囊泡膜上，被认为是突触密度和突触发生的标志物，参与神经递质的释放、突触小泡的形成和循环^［17］。同时，SYN也是突触前终端突触小泡动态的关键调节因子，它的表达能准确反映突触密度、分布面积和功能状态，从而反映可塑性^［18］。GAP‑43是一种富含生长因子的神经组织特异性磷蛋白，与突触可塑性、轴突再生和神经系统密切相关^［19］。研究表明，在神经系统发育的早期阶段，神经元胞浆中的GAP‑43含量增加。随着大脑的发育，GAP‑43的表达量逐渐减少；但当脑损伤发生时，其表达量会随着损伤修复时间的增加而增加，并在损伤区域逐渐减少^［20］。PSD‑95作为重要的突触后标记物，不仅是调控突触发育的关键支架分子^［21］，还负责控制突触后膜蛋白的稳定性、参与和运输^{［22，23］}。通过本研究免疫组化染色和Western blot发现，突触相关标志物蛋白表达发生一定的变化，Model组与Control组相比，SYN、GAP‑43、PSD‑95蛋白表达有明显下降趋势（P<0.01），药物治疗后能够一定程度上增加蛋白SYN、GAP‑43、PSD‑95的表达（P<0.05）。本研究结果表明XST对突触蛋白存在调节作用，通过上调以上相关蛋白水平，参与突触可塑性调节，保护突触微结构，进而改善学习记忆功能。

cAMP是生命信息传递的“第二信使”，参与神经节突触传递、细胞内的物质代谢调节和生物学反应，与各种神经疾病相关，可适当调节大脑功能，包括神经元记忆、纹状体可塑性和突触功能等^［24］。cAMP增强大脑特定部位的PKA活性，其中，PKA是cAMP的关键调节因子，激活下游信号通路的转录反应，参与突触可塑性和长期记忆的形成^［25］。CREB是被磷酸化的转录因子，也是细胞核内的“第三信使”，在神经细胞内广泛存在，参与细胞信号转导，在神经元生长和发育、细胞修复、突触可塑性、记忆功能等方面发挥重要作用，在神经元损伤中起神经保护作用^［26］。本研究结果显示，XST干预后小鼠脑组织的cAMP的含量增加，DPH组、XST‑M和XST‑H组PKA蛋白表达升高（P<0.05），小鼠海马区CREB明显增加（P<0.01），皮质区XST‑M和XST‑H组CREB明显升高（P<0.05）。本研究中XST治疗后cAMP、PKA、CREB水平升高，表明XST可能激活cAMP/PKA/CREB信号通路干预突触可塑性，从而改善认知功能。

综上所述，XST能够改善东莨菪碱所致AD的学习记忆障碍，作用机制可能与cAMP/PKA/CREB信号通路和调节突触突触可塑性有关，其深层机制有待进一步探究。

作者贡献度说明：

胡小童：参阅文献和完成实验，采集和分析数据，起草和撰写文章；黄雄峰、胡卓瑶：对实验进行技术指导，统计分析；曹秀敏、安欣：协助实验；陈乔：设计实验，对论文进行指导，修改论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Zhang J， Zhang Y， Wang J， et al. Recent advances in Alzheimer's disease： Mechanisms， clinical trials and new drug development strategies［J］. Signal Transduct Target Ther， 2024，9（1）：211‑235.

[2] Liu S， Wang M， Xiao H， et al. Advancements in research on the effects of Panax notoginseng saponin constituents in ameliorating learning and memory disorders［J］. Heliyon， 2024，10（7）：e28581‑e28591.

[3] Qu J， Xu N， Zhang J， et al. Panax notoginseng saponins and their applications in nervous system disorders： a narrative review［J］. Ann Transl Med， 2020，8（22）：1525‑1534.

[4] 肖新宇， 张瑾， 李秀华， 等. 三七总皂苷对机械通气致脑损伤大鼠海马神经元及突触相关蛋白PSD‑95、GAP‑43的影响［J］. 中国老年学杂志， 2023，43（19）：4814‑4818.

[5] Xiao XY， Zhang J， Li XH， et al. Effects of total saponins of Panax notoginseng on hippocampal neurons and synapse‑associated proteins PSD‑95 and GAP‑43 in rats with mechanical ventilation‑induced brain injury［J］. Chin J Gerontol， 2023，43（19）：4814‑4818.

[6] Han GJ， Min XZ， Ma SS， et al. Xuesaitong combined with dexmedetomidine improves cerebral ischemia‐reperfusion injury in rats by activating Keap1/Nrf2 signaling and mitophagy in hippocampal tissue［J］. Oxid Med Cell Longev， 2022，15（12）：5126042‑5126060.

[7] 杨美丽， 吴振纲， 肖尧， 等. 突触可塑性与学习记忆关系的研究进展［J］. 现代医药卫生， 2022，38（17）：2946‑2949.

[8] Yang ML， Wu ZG， Xiao Y， et al. Progress of research on the relationship between synaptic plasticity and learning memory［J］. Mod Med Health， 2022，38（17）：2946‑2949.

[9] Li X， Feng X， Sun X， et al. Global， regional， and national burden of Alzheimer's disease and other dementias， 1990‑2019［J］. Front Aging Neurosci， 2022，14（10）：937486‑937502.

[10] Huang J， Xu Z， Yang S， et al. Identification of differentially expressed profiles of Alzheimer's disease associated circular RNAs in a Panax notoginseng saponins‑treated Alzheimer's disease mouse model［J］. Comput Structu Biotechnol J， 2018，16（11）：523‑531.

[11] 赵清扬， 张帅， 杜文静， 等. 经颅磁声电刺激下皮层钙信号及突触传递特性的仿真与实验分析［J］. 河北大学学报（自然科学版）， 2023，43（3）：310‑319.

[12] Zhao QY， Zhang S， Du WJ， et al. Simulation and experimental analysis of cortical calcium signals and synaptic transmission under transcranial magnetoacoustic stimulation［J］. J Hebei Univ （Nat Sci Ed）， 2023，43（3）：310‑319.

[13] Sudhof TC. The cell biology of synapse formation［J］. J Cell Biol， 2021，220（7）： e202103052‑e202103069.

[14] Alfaro‑Ruiz R， Martin‑Belmonte A， Aguado C， et al. Selective disruption of synaptic NMDA receptors of the hippocampal trisynaptic circuit in Abeta pathology［J］. Biol Res， 2024，57（1）：56‑72.

[15] Li W， Su X， Hu N， et al. Astrocytes mediate cholinergic regulation of adult hippocampal neurogenesis and memory through M1 muscarinic receptor［J］. Biol Psychiatry（1969）， 2022，92（12）：984‑998.

[16] Moreno‑Jimenez EP， Terreros‑Roncal J， Flor‑Garcia M， et al. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans［J］. J Neurosci， 2021，41（12）：2541‑2553.

[17] Peng S， Zeng L， Haure‑Mirande JV， et al. Transcriptomic changes highly similar to Alzheimer's disease are observed in a subpopulation of individuals during normal brain aging［J］. Front Aging Neurosci， 2021，13（12）：711524‑711539.

[18] Ferrer‑Raventos P， Beyer K. Alternative platelet activation pathways and their role in neurodegenerative diseases［J］. Neurobiol Dis， 2021，159（11）：105512‑105521.

[19] Fracassi A， Marcatti M， Tumurbaatar B， et al. TREM2‑induced activation of microglia contributes to synaptic integrity in cognitively intact aged individuals with Alzheimer's neuropathology［J］. Brain Pathol， 2023，33（1）：e13108‑e13123.

[20] Hami J， Vafaei‑Nezhad S， Sadeghi A， et al. Synaptogenesis in the cerebellum of offspring born to diabetic mothers［J］. J Pediatr Neurosci， 2017，12（3）：215‑221.

[21] Zhu X， Wang P， Liu H， et al. Changes and significance of SYP and GAP‑43 expression in the hippocampus of CIH rats［J］. Int J Med Sci， 2019，16（3）：394‑402.

[22] Qiang Q， Skudder‑Hill L， Toyota T， et al. CSF GAP‑43 as a biomarker of synaptic dysfunction is associated with tau pathology in Alzheimer's disease［J］. Sci Rep， 2022，12（1）：17392‑17401.

[23] Saloner R， Fonseca C， Paolillo EW， et al. Combined effects of synaptic and axonal integrity on longitudinal gray matter atrophy in cognitively unimpaired adults［J］. Neurology， 2022，99（20）：e2285‑e2293.

[24] Wang R， Kang S， Zhao Z， et al. Chicoric acid ameliorated beta‑amyloid pathology and enhanced expression of synaptic‑function‑related markers via L1CAM in Alzheimer's disease models［J］. Int J Mol Sci， 2024，25（6）：3408‑3420.

[25] Mansouri Z， Khodagholi F， Zaringhalam J， et al. Intranasal CEPO‑FC prevents attention deficits in streptozotocin‑induced rat model of Alzheimer's disease： Focus on synaptic plasticity‑related factors［J］. EXCLI J， 2024，23（4）：491‑508.

[26] 刘丽星， 朱陵群， 刘炜， 等. 血塞通注射液对局灶性脑梗死大鼠不同恢复时点大脑皮层SYP和PSD‑95蛋白表达的影响［J］. 中西医结合心脑血管病杂志， 2014，12（2）：217‑219.

[27] Liu LX， Zhu LQ， Liu W， et al. Effects of haemosiderophore injection on SYP and PSD‑95 protein expression in cerebral cortex of rats with focal cerebral infarction at different recovery time points［J］. J Cardiovasc Cerebrovasc Dis Chin West Med， 2014，12（2）：217‑219.

[28] Lee YY， Park JS， Leem YH， et al. The phosphodiesterase 10 inhibitor papaverine exerts anti‑inflammatory and neuroprotective effects via the PKA signaling pathway in neuroinflammation and Parkinson's disease mouse models［J］.J Neuroinflammation， 2019，16（1）：246‑262.

[29] Shahoha M， Cohen R， Ben‑Simon Y， et al. cAMP‐dependent synaptic plasticity at the hippocampal mossy fiber terminal［J］. Front Synaptic Neurosci， 2022，14（1）：861215‑861229.

[30] 冀俊林，周玉兰.丁苯酞对糖尿病大鼠认知功能及PKA‑CREB通路的影响［J］. 中国老年学杂志，2019，39（4）：927‑930.

[31] Ji JL， Zhou YL. Effects of butylphthalide on cognitive function and PKA‑CREB pathway in diabetic rats［J］.Chin J Gerontol，2019，39（4）：927‑930.

基金资助

江西省一流学科江西中医药大学中西医结合(zxyylxk20220103)

江西省中医药管理局科技计划项目(2020B0331)

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ211211)