复方苗药九仙罗汉接骨汤通过提高自噬促进MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞分化防治骨质疏松

Compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction prevents osteoporosis by enhancing autophagy to promote MC3T3‑E1Subclone14 osteoblast differentiation

摘要

目的 探讨复方苗药九仙罗汉接骨汤对MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞增殖分化的影响以及PI3K/AKT/mTOR信号通路和细胞自噬在其中的作用。 方法 选取对数生长期大鼠前体成骨细胞株MC3T3‑E1Subclone14，用不同浓度的复方苗药九仙罗汉接骨汤（0%~20%）干预，通过CCK8观察细胞活力确定复方苗药九仙罗汉接骨汤的最佳作用浓度；用最佳浓度复方苗药九仙罗汉接骨汤处理MC3T3‑E1Subclone14细胞，将成骨细胞分为A组（成骨分化诱导组），B组（成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h组），C组［成骨分化诱导+5 mmol/L 3‑甲基嘌呤（3‑MA）组］，D组（成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h+5 mmol/L 3‑MA组）和空白对照组。采用茜素红染色检测各组相对矿化结节含量；CCK8观察各组成骨细胞增殖率；Western blot检测各组成骨分化蛋白Runx2、Osterix表达水平及自噬相关蛋白LC3、p62表达水平；q‑PCR检测各组成骨分化基因Runx2、Osterix mRNA和自噬相关基因LC3、p62 mRNA及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因PI3K、AKT、mTOR mRNA表达情况；免疫荧光染色检测各组LC3、p62在细胞内的表达情况；透射电镜检测各组细胞内自噬小体的形成情况。 结果 复方苗药九仙罗汉接骨汤能促进成骨细胞的增殖、分化，浓度为10%效果最明显（P<0.01）。成骨分化诱导组矿化结节形成明显多于空白对照组。与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤组矿化结节形成明显增加（P<0.01），细胞增殖率明显升高（P<0.01）。与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤上调成骨分化标志物Runx2、Osterix及自噬相关标志物LC3蛋白及基因的表达（P<0.01），同时下调p62蛋白及基因的表达（P<0.01）。加入3‑MA抑制自噬后能够拮抗这些效应。免疫荧光显示，与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤组能够促进LC3在细胞内的表达（P<0.01），同时抑制p62在细胞内的表达（P<0.01）；加入3‑MA后，抑制LC3在细胞内的表达（P<0.05），同时促进p62在细胞内的表达，且细胞增值率及活性明显降低（P<0.01）。透射电镜显示复方苗药九仙罗汉接骨汤组自噬小体增加，3‑MA抑制自噬小体增加。与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤组PI3K、AKT、mTOR mRNA表达明显增加（P<0.01），加入3‑MA抑制自噬后PI3K、AKT、mTOR mRNA表达明显减少（P<0.01）。 结论 复方苗药九仙罗汉接骨汤可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路和增强自噬促进MC3T3‑E1Subclone14细胞成骨分化，其作用机制可能与调节Runx2、Osterix、LC3、p62蛋白及基因表达有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of the compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction on the proliferation and differentiation of MC3T3‑E1Subclone14 osteoblasts as well as the roles of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and cellular autophagy in it. Methods The precursor osteoblast cell line MC3T3‑E1Subclone14 was selected from logarithmic growth stage rats， and intervened with different concentrations of compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction （0%‑20%）， and the optimal concentration of the compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction was determined by the observation of cell viability through CCK8； the optimal concentration of compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction was used for treating MC3T3‑E1Subclone14 cells. E1Subclone14 cells， the osteoblasts were divided into Group A （osteogenic differentiation induction group）， Group B （group A + compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction containing serum）， Group C （group A + 5 mmol/L autophagy inhibitor 3‑methylpurine （3‑MA））， Group D ［group B + 5 mmol/L autophagy inhibitor 3‑methylpurine （3‑MA）］ and the blank control group. Alizarin red staining was used to detect the relative mineralized nodule content of each group； CCK8 assay was used to observe cellular value‑added rate in each group； Western Blot was used to detect the expression levels of osteogenic differentiation proteins Runx2 and Osterix， and autophagy‑related proteins LC3 and p62； q‑PCR was used to detect the expression levels of osteogenic differentiation genes Runx2 and Osterix mRNA， autophagy‑related genes LC3， p62 mRNA， and signaling pathway‑related genes PI3K， AKT， mTOR mRNA expression； immunofluorescence staining was used to detect the expression of LC3， p62 in the cells of each group； transmission electron microscopy to detect the formation of autophagic vesicles in the cells of each group. Results Compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction could promote the proliferation and differentiation of osteoblasts， and the effect was most obvious when the concentration was 10% （P<0.01）； the mineralized nodule formation in the osteogenic differentiation induction group was significantly more than that in the blank control group； the mineralised nodule formation in the compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction group was significantly more than that in the osteogenic differentiation induction group （P<0.01）， and the cellular viability and activity significantly increased（P<0.01）； compared to the osteogenic differentiation induction group， the expression of osteogenic differentiation markers Runx2 and Osterix and autophagy‑related markers LC3 gene and protein were up‑regulated by the compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction （P<0.01）， while the expression of p62 gene and protein was down‑regulated （P<0.01）， and the addition of 3‑MA to inhibit autophagy was able to antagonise these effects （P<0.01）. The immunofluorescence showed that osteogenesis differentiation inducing group was able to promote the expression of LC3 in the cells while inhibiting the expression of p62 in the cells compared to the compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction （P<0.05）； the addition of 3‑MA suppressed the expression of LC3 in the cells， while promoting the expression of p62 in the cells and the cellular viability and activity significantly reduced（P<0.01）； transmission electron microscopy showed that the compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction promoted the increase of autophagic vesicles in osteoblasts， and 3‑MA inhibited the increase of autophagic vesicles； compared to the osteogenic differentiation induction group， the expression of PI3K， AKT， and mTOR mRNA in the group of the compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction was significantly increased （P<0.01）， the expression of PI3K， AKT and mTOR mRNA was significantly reduced after the addition of 3‑MA to inhibit autophagy （P<0.01）. Conclusion Compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction may promote osteogenic differentiation of MC3T3‑E1Subclone14 cells through activation of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and enhancement of autophagy， and its mechanism of action may be related to the regulation of Runx2， Osterix， LC3， p62 proteins and gene expression.

Graphical abstract

关键词

复方苗药九仙罗汉接骨汤 / 自噬 / 成骨细胞 / 细胞分化 / PI3K/AKT/mTOR信号通路

Key words

Compound Miao medicine Jiuxian Luohan Jiegu Decoction / Autophagy / Osteoblasts / Cell differentiation / PI3K/AKT/mTOR signalling pathway

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨量减少和骨微结构破坏为主要特征的骨代谢性疾病^［1］，患者多伴有腰背痛或骨脆性增加而发生骨折，严重影响患者生活质量。最新的流行病学研宄显示，我国50岁以上人群OP患病率为19.2%，65岁以上人群OP患病率达到32.0%^［2］。因此，寻找有效防治OP的药物是当前临床必须解决的关键所在。

成骨细胞是骨骼形成和维持骨重建动态平衡的核心功能细胞，其通过分泌骨形成相关胶原纤维和蛋白多糖促进骨细胞增殖、分化从而增加骨形成；同时，也可通过调节破骨细胞的生成进而抑制骨的吸收，以此来维持其矿化平衡及自身的结构完整^［3］。成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收失衡是导致OP发生的主要发病机制^［4］。当成骨细胞功能减弱或活性降低时，导致骨形成不足以弥补骨吸收的增加，造成骨稳态失衡、骨重建功能障碍，引起骨质流失、骨小梁结构改变和骨脆性增加，进而导致OP的发病^［5］。近年来，越来越多的研究表明自噬是骨维持的一个新参与者，在维持骨骼稳态、骨代谢平衡和防治OP等方面发挥重要的调节作用，保持一定的自噬水平可有效促进成骨细胞的增殖和分化^［6］。

苗药九仙罗汉接骨汤是课题组基于苗医“瘀毒”理论为基础，根据苗医理论“三位一体”和“立方简要”的配伍原则以苗药地罗汉、仙桃草、九节茶组成的一种民族传统中药制剂。课题组前期实验研究证明，苗药九仙罗汉接骨汤具有改善骨微循环、增加骨基质钙、磷盐沉积提高骨密度等作用促进成骨细胞分化，加速骨折愈合^［7‑9］，但其抗骨质疏松的机制缺乏研究报道。因此，本次实验在前期实验的基础上将中医“肾主骨生髓”理论和苗医“瘀毒”理论相结合，加入“补肾活血、祛风除湿、强筋壮骨”类药物组成复方苗药九仙罗汉接骨汤，通过成骨诱导分化液体外诱导的MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞分化模型探讨复方苗药九仙罗汉接骨汤能否通过自噬调控成骨细胞的增殖、分化的作用机制，以此来验证对OP的潜在治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

MC3T3‑E1Subclone14细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司（批号：CL‑0378）。

1.2 实验动物

SPF级SD雄性大鼠6~8周龄，（220±40） g，购自北京斯贝福生物技术有限公司［SCXK（京）2024‑0001］，大鼠生活环境为SPF级动物房，注射、取材等操作遵守实验室相关规定；实验动物的饲养与伦理审查经过贝赛模式生物中心伦理委员会批准（伦理批准号：BSMS动福第2024‑04‑12C号）。

1.3 药物

复方苗药九仙罗汉汤由地罗汉20 g（批号：240124），仙桃草20 g（批号：240113），九节茶20 g（批号：240220），杜仲12 g（批号：240122），淫羊藿12 g（批号：240109），千年健12 g（批号：240225），路路通9 g（批号：231217），三七9 g（批号：240310），自然铜9 g（240209），续断9 g（批号：240305）组成，以上饮片由贵州中医药大学第二附属医院中药房及煎药房提供。

1.4 主要试剂及仪器

CCK8细胞增殖与活性检测试剂盒（中国HYCEZMBIO公司，货号：HYCCK8‑500T）；茜素红S（上海碧云天生物技术公司，货号：C0148S）；细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基公司，货号：KGA1026）；小鼠单抗GAPDH（武汉三鹰生物技术有限公司；货号：60004‑1‑Ig）；山羊抗兔、山羊抗鼠二抗HRP（武汉博士德生物工程有限公司；货号分别为：BA1054、BA1051）；Osterix抗体（美国AFFINIYTY公司，货号：DF7731）；Runx2抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：20700‑1‑AP）；LC3抗体（美国CST公司，货号：83506）；p62抗体（英国Abcam公司；货号：ab109012）；3‑甲基腺嘌呤（3‑MA）（MCE公司，货号：HY‑19312）；BCA蛋白浓度测定试剂（GBCBIO，货号：G3522）。

电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表有限公司）；水平电泳仪（东胜创新生物科技有限公司）；垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；荧光实时定量聚合酶链反应仪（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；荧光图像分析系统（上海天能科学有限公司）；透射电子显微镜（日本HITACHI公司）；酶标仪（Molecular Devices公司）；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；化学发光成像系统（杭州申花科技有限公司）；水平琼脂糖电泳槽（北京龙方科技有限公司）；量移液器（Eppendprf公司）。

1.5 细胞复苏及培养

将MC3T3‑E1Subclone14细胞从液氮中取出，迅速置于37 ℃的水浴罐中快速溶解，将保存在冻存管的细胞轻摇；溶出后，将该细胞传送至含有5 mL介质的离心分离，并在1 000 r/min的旋转速度下进行5 min的离心，将其接种于α‑MEM培养基中（含体积分数10%胎牛血清和体积分数1%青链霉素），37 ℃、5% CO₂下静置培养。等待细胞生长到对数期时，PBS清洗3遍，加入胰蛋白酶液消化细胞，加入完全培养基，沿壁轻轻吹打均匀，然后传代。密切观察细胞生长状态，当细胞生长融合率达到80%时，传代1次，取第3、4代细胞进行实验。

1.6 含药血清的制备

雄性SD大鼠20只，适应饲养7 d后按随机数字表法设置空白对照组、复方苗药九仙罗汉接骨汤组，每组10只大鼠，复方苗药九仙罗汉接骨汤的成人（70 kg）每日剂量为1.88 g/kg，复方苗药九仙罗汉接骨汤各组给药剂量按人和大鼠的体表面积，根据文献得出等效剂量约为人的6.3倍^［10］。故接骨汤含药血清组以基础给药剂量为11.8 g/kg，空白对照组予等量生理盐水，每日2次，共7 d，末次灌胃给药2 h后，腹腔注射1%巴比妥钠麻醉大鼠，剪开大鼠胸腔，由腹主动脉采血至医用采血管，收集空白组及药物组大鼠的血液。将提取血液处于常温下静置2 h后置入离心管，静置1 h，3 000 r/min离心10 min分离血清，用移液枪吸取上层血清，采用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌处理后将其保存在-80 ℃储存备用。

1.7 CCK8法检测细胞活性情况及复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清浓度筛选

取处于对数生长期，生长状态良好的MC3T3‑E1Subclone14细胞用10%胎牛血清培养基进行传代培养24 h后制备成细胞悬液，后用无菌PBS缓冲液清洗各组细胞，将种有悬液的96孔板置于细胞培养箱中（37 ℃，5% CO₂的条件下），待细胞贴壁后，吸弃96孔板上细胞表面培养基，再直接往各孔中加入10 µL的CCK‑8溶液，放于培养箱内继续孵育2 h，随后分别加入稀释后的含药血清，分组设置为空白对照组和2.5%、5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清组共8个浓度梯度，分别干预培养细胞24、48 h，加入CCK8工作液，照CCK8试剂盒要求测定各组450 nm处的吸光度（OD）值。从该浓度梯度中筛选出复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清对MC3T3‑E1Subclone14细胞增殖最佳含药血清给药浓度，用于后续实验。

1.8 成骨细胞诱导分化培养

取处于对数生长期，生长状态良好的MC3T3‐E1细胞，接种至96孔板中，使用成骨分化诱导培养基（诱导分化培养分化培养基是在未分化培养基的基础上，加入β‑甘油磷酸（5×10^-3 mol/L），抗坏血酸（0.1 g/L），维生素K（10^-8 mol/L），1，25‑二羟维生素D₃［1，25（OH）₂D₃］（10^-7 mol/L），孵箱培养条件为5% CO₂、39.4 ℃，成骨分化诱导每2天换1次液，诱导3周。

1.9 实验分组

将诱导后的MC3T3‑E1Subclone14细胞分为4组，即A组（成骨分化诱导组），B组（成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h组），C组（成骨分化诱导+5 mmol/L 3‑MA组），D组（成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h+5 mmol/L 3‑MA组）。

1.10 CCK8法检测各组成骨细胞增值率

根据不同分组和细胞处理设置分别处理细胞，与1.7所示检测方法相同，酶标仪测定各组450 nm处的OD值。

1.11 茜素红染色及定量分析

MC3T3‑E1Subclone14细胞（1×10⁵/孔）接种于24孔板内生长致融合，细胞分组以及培养方法同上；分组处理后予4%多聚甲醛浸泡30 min固定细胞形态，PBS冲洗3次。配置体积分数为1%的茜素红染液染色30 min，染色后的细胞用PBS冲洗3次。镜下观察细胞是否有红色或橘红色矿化结节并拍照，分析计算其结节数量在其爬片上所占比例。

1.12 Western blot检测Runx2、Osteri、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62蛋白表达情况

收集第4代细胞，按照2×10⁵个活细胞/孔的密度每孔2 mL把细胞种植于6孔板中。细胞分组以及培养方法同上；提取单层贴壁细胞总蛋白PBS沿着细胞板壁缓慢加入，平放轻轻摇动，然后弃去洗液按1 mL裂解液加10 μL PMSF（100 mmol/L）、10 μL磷酸酶抑制剂，摇匀置于冰上，加入120 μL含PMSF的裂解液，裂解完后，于4 ℃下12 000 r/min离心5 min，将离心后的上清分装转移倒0.5 mL的离心管中放于-20℃保存。后将蛋白样品进行适当稀释，将BSA标准品进行稀释，将PBS稀释过的蛋白样品、标准蛋白分别加入96孔板内用DG‑3022A酶标仪测定OD562将制备好的胶固定到电泳槽上取出凝胶，检测成骨细胞中含锌指的转录因子（Zinc finger‑containing transcription factor，Osterix/Sp7）、Runt相关转录因子2（Runt family transcription factor 2， Runx2）、微管相关蛋白1A/1B‑轻链3（microtubule‑associated protein 1A/1B‑light chain 3，LC3）Ⅱ、LC3Ⅰ、螯合体1（sequestosome1，SQST M1/p62）相应灰度值进行分析。

1.13 q‑PCR检测Runx2、Osterix、LC3、p62、PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达情况

取第4代细胞，按照2×10⁵个活细胞/孔的密度每孔0.5 mL细胞种植于6孔板中，然后置于37 ℃、体积分数5% CO₂的培养箱中培养，细胞分组以及培养方法同上；24 h后弃原液，分别加入10%的复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清和5 mmol/L 3‑MA自噬免疫抑制剂至2 mL/孔，各组全部培养细胞3 d后提取RNA。具体步骤：根据说明书用Trizol提取RNA，在反转录仪中进行反转录生成cDNA后，并扩增DNA。反应步骤为：第一步预变性，1个循环，95 ℃ 30 s；第二部PCR反应，40个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。采用RT‑PCR测定Runx2、Osterix、LC3、p62、靶向磷脂肌醇3‑激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表达情况，采用2^-∆∆Ct法并以GAPDH为内参计算上述基因的相对表达量，用于统计学分析。引物序列表见表1。

1.14 免疫荧光检测细胞测成骨分化过程中LC3、p62蛋白的表达

爬片置于6孔板中，按照2×10⁴个活细胞/孔的密度将中细胞涂布到爬片上。使用4%多聚甲醛固定15 min，0.5%TritonX‑100通透20 min，封闭30 min，后用PBS清洗3次，滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜；去除一抗，PBS清洗爬片3次，滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS清洗4次，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.15 透射电镜观察自噬小体

按照2×10⁵个活细胞/孔的密度把细胞种植于6孔板中。细胞经分组处理后消化、离心，去上清，弃去培养基，用PBS漂洗3次，每次10 min，弃掉培养基，迅速加入电镜固定液2.5%戊二醛，室温固定4 h；用细胞刮轻轻刮下细胞，用PBS漂洗3次，每次15 min；后用PBS配置的1%锇酸溶液室温固定2 h，PBS清洗3次，每次静置15 min；室温脱水，渗透包埋，包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h，取出树脂块于超薄切片机超薄切片，采用JEOL2000FX透射电子显微镜下观察，采集图像。

1.16 统计学处理

采用SPSS26.0统计软件对实验数据进行统计学分析，实验结果以\overline{x}\pm s形式表示。数据呈正态分布且方差齐多组间数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较进行LSD检验，P<0.05为差异具有统计学意义，使用GraphPad Prism绘制统计图。

2 结果

2.1 复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清对MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞最适浓度的筛选

与空白对照组相比，培养24 h及48 h后，7.5%、10%、12.5%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清MC3T3‑E1Subclone14细胞的增殖能力均提高（P<0.05），且24 h时细胞增值效果最好。当复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清浓度为10%时，细胞增殖达到最理想状态。故后续成骨分化诱导实验采用24 h下10%此药物浓度。见图1。

2.2 成骨分化诱导及茜素红染色

MC3T3‑E1Subclone14细胞经过21 d的诱导，经茜素红染色后，其中对照组的细胞有一定程度的外矿化，成骨分化诱导组出现少量散在红色钙结节。见图2。

2.3 最适浓度复方苗药九仙罗汉接骨汤及3‑MA自噬抑制剂各组MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞增殖率

与成骨分化诱导组相比，含药血清组细胞活性及增殖率显著升高（P<0.01）；自噬3‑MA抑制剂组细胞活性及增殖率明显降低（P<0.01）。与含药血清组相比，3‑MA自噬抑制剂组细胞活性及增殖率明显降低（P<0.01）。由此说明复方苗药九仙罗汉接骨汤可以提高MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞活性及促进成骨细胞增殖；在加入自噬抑制剂后可其细胞活性及增殖率明显降低，由此可见，抑制自噬可逆转含药血清的对成骨细胞增值效果，降低其细胞活性。见表2。

2.4 最适浓度复方苗药九仙罗汉接骨汤及3‑MA自噬抑制剂对各组MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞生物学性能的影响

MC3T3‑E1Subclone14细胞矿化诱导21 d后，经茜素红染色矿化结节呈现红色，与成骨分化诱导组相比，含药血清组矿化结节形成较为明显。见图3。

2.5 茜素红染色的半定量分析结果

相比于A组，B组相对钙化结节含量显著增加（P<0.01），C组相对钙化结节含量降低（P<0.05），D组相对钙化结节含量有所增加（P<0.05）；相比于B组，C组、D组相对钙化结节含量降低（P<0.05）。结果说明复方苗药九仙罗汉接骨汤能够促进MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞的钙结节的形成从而促进成骨分化，而3‑MA能够减弱复方苗药九仙罗汉接骨汤的矿化促进作用从而抑制成骨分化。见图4。

2.6 Western blot检测复方苗药九仙罗汉接骨汤在各组MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞中成骨分化相关蛋白Runx2、Osterix的表达情况

Western blot结果显示：与A组相比，B组Osterix、Runx2蛋白表达水平均明显增加（P<0.01），C组Osterix、Runx2蛋白表达降低（P<0.05），D组Osterix、Runx2蛋白表达有所增加（P<0.05）；与B组相比，C组及D组Osterix、Runx2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。结果表明，Western blot分析结果和茜素红染色结果大体一致，说明复方苗药九仙罗汉接骨汤可通过调节成骨细胞分化相关蛋白促进MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞成骨分化，并可以抑制自噬逆转10%复方苗药九仙罗汉接骨汤促进MC3T3‑E1Subclone14细胞成骨分化。见图5。

2.7 Western blot检测复方苗药九仙罗汉接骨汤在各组MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62的表达情况

Western blot结果显示：与A组相比，B组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值增强（P<0.01），同时p62蛋白表达水平降低（P<0.01），C组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值降低（P<0.05），p62蛋白表达水平增加（P<0.05），D组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及p62蛋白表达水平变化无统计学意义（P>0.05）；与B组相比，C组及D组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值降低（P<0.01），同时p62蛋白表达水平增加（P<0.01）。进一步表明，复方苗药九仙罗汉接骨汤能通过增强细胞自噬促进MC3T3‑E1Subclone14细胞成骨分化，且可有效逆转3‑MA对MC3T3‑E1Subclone14细胞自噬的抑制作用。说明在复方苗药九仙罗汉接骨汤促进成骨细胞分化过程中，自噬发挥了重要的调节作用。见图6。

2.8 实时荧光定量q‑PCR检测的Osterix、Runx2、p62、LC3 mRNA表达情况

q‑PCR结果显示：与A组相比，B组MC3T3‐E1Subclone14细胞Osterix、Runx2、LC3 mRNA表达量明显提高（P<0.01），同时p62 mRNA表达量明显降低（P<0.01），C组MC3T3‑E1Subclone14细胞Osterix、Runx2、LC3 mRNA表达量明显降低（P<0.01），同时p62 mRNA表达升高（P<0.05），D组MC3T3‑E1Subclone14细胞Osterix、Runx2、LC3 mRNA表达量有所提高（P<0.05），同时p62 mRNA表达有所降低（P<0.05）；与B组相比，C组及D组的Osterix、Runx2、LC3 mRNA表达量明显降低（P<0.01），p62 mRNA表达明显提高（P<0.01）。上述结果与Western blot结果基本一致，说明复方苗药九仙罗汉接骨汤可通过促进MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞自噬来提高成骨细胞增殖。见图7。

2.9 免疫荧光检测不同处理组MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞自噬相关蛋白LC3、p62的强度及其表达情况。

结果发现，相比于A组，B组p62的表达明显降低（P<0.01），但LC3的表达明显升高（P<0.01），C组p62的表达明显升高，但LC3的表达降低（P<0.05），且联合使用3‑MA明显抑制了复方苗药九仙罗汉接骨汤的作用（P<0.05）；相比于B组，C组及D组p62表达均明显升高（P<0.01），LC3表达明显降低（P<0.01）。以上结果证明了复方苗药九仙罗汉接骨汤可以有效激活MC3T3‑E1Subclone14细胞的自噬水平，且这种促进作用可以通过使用自噬抑制剂减弱。见图8、9。

2.10 透射电镜检测不同处理组MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞分化过程中自噬体的形成

电镜下观察各组的自噬体（箭头标记处）数目，可以看到A组有少量自噬体形成；B组较A组明显增加；C组自噬体明显减少或无；D组自噬体有少量自噬体形成。说明复方苗药九仙罗汉接骨汤能促进MC3T3‑E1Subclone14细胞的自噬，而3‑MA可以拮抗这种促进作用。见图10。

2.11 实时荧光定量q‑PCR检测MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表达水平

与A组相比，B组的通路蛋白PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平明显升高（P<0.01），C组通路蛋白PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平明显降低（P<0.01），D组通路蛋白PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平有所增高（P<0.05）；与B组相比，C组及D组通路蛋白PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平明显降低（P<0.01）。表明PI3K/AKT/mTOR信号通路介导的自噬参与复方苗药九仙罗汉接骨汤的促成骨分化过程，可能与激活PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。见图11。

3 讨论

中医学将OP归为“骨枯”“骨萎”等疾病范畴。《素问·痿论》中提到：“肾主身之骨髓……骨枯而髓减，故足不任身，发为骨痿。”认为肾藏精主骨生髓，当肾精亏虚，无源生津填髓以充养骨骼，骨骼失养而痿弱骨枯，精亏髓空则百骸痿废，致骨失所主，髓失所养，最终形成OP等相关骨病^［11］。苗族医学将OP归为“索松索趵”“嘎丢蒙”等范畴，也就是“腰痛”“腰背痛”，认为任何能导致机体脏腑功能失调，代谢紊乱的物质统称为“毒”，有“毒为百病之源，百病皆由毒生”之说。风寒湿等外生之毒客于骨骼关节，留而不去，痹阻气血经脉，酝久化热壅聚成内生毒邪，瘀毒内蕴，瘀阻于内，致使骨骼失于濡养，加速骨质流失破坏，进而诱发OP的发生。

苗医理论与中医理论对OP的认识虽有细节上的差异，但本质是相通的，都是对OP病因病机的高度概括。因此，课题组将中医“肾主骨生髓”理论与苗医“瘀毒”理论相结合，以地罗汉、仙桃草、九节茶为领头药，祛瘀止痛，强筋壮骨；三七、自然铜、千年健、续断为监护药，活血行气，续筋接骨；路路通、杜仲、淫羊霍为铺底药补肾益精，强筋壮骨。方中以三味苗药为主药，辅以补益、活血、祛风中药，十药共用组成复方苗药九仙罗汉接骨汤，诸药共凑补益肝肾、强筋壮骨、活血止痛之功效。现代药理学研究表明，该方中地罗汉、仙桃草、九节茶可以促进MC3T3‑E1Subclone14细胞增殖分化，并抑制其凋亡，加快骨形成^［12］；三七中含有的三七总皂苷可促进血管内皮生长因子表达，增加骨质面积和维持骨小梁结构完整性，其机制与调节PI3K/AKT/mTOR信号通路有关^［13］；自然铜中富含Fe、Cu等微量元素可提高骨矿物质含量、骨密度和恢复骨生物力学特性^［14］；千年健可改善骨微结构功能，抑制骨吸收来增强对OP的防治作用^［15］；续断中活性成分川续断皂苷Ⅵ可提高骨密度、骨胶原形成和调节骨代谢，从而起到抗OP的作用^［16］；路路通中有效活性成分没食子酸具有抗氧化作用，可调节细胞内氧化应激，抑制骨吸收，进而达到治疗OP的目的^［17］；杜仲可有效提高骨密度、改善骨微结构和减少破骨细胞生成及活性^［18］；淫羊藿中关键活性成分淫羊藿苷可以提高骨组织自噬水平，提高成骨细胞活性，增加骨形成并抑制骨质流失^［19］。这也与现代医学中多种药物联合作用，具有多靶点、多通路、多效应治疗OP以改善骨局部的血液循环和促进骨质新生的主张相契合^［20］。

本研究采用不同浓度的复方苗药九仙罗汉接骨汤干预MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞，并通过CCK8检测MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞的OD值来观察其增殖活力，结果显示，随着浓度的升高MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞的增殖活力呈现上升趋势，在浓度为10%时MC‑3T3‑E1成骨细胞的增殖活力显著增强（P<0.01）。表明复方苗药九仙罗汉接骨汤可以促进成骨细胞增殖、分化。

骨形成和骨吸收失衡是导致OP发生的主要发病机制。成骨细胞的分化由多种因子共同调节，其中Runx2和Sp7是成骨细胞分化中最主要的转录因子，在骨形成和骨重塑中起着关键作用^［3，20］。Runx2是成骨细胞分化的上游转录因子，可以调节相关骨基质蛋白的表达促进骨基质的合成^［21］。Osterix位于Runx2的下游，可以激活OCN、OPN、Runx2等因子的表达，促使钙、磷盐等矿物质沉积及骨基质矿化，从而诱导成骨细胞向成骨表型转化^［22］。相关研究发现Runx2和Osterix的表达减低，可抑制成骨细胞增殖、分化及矿化，上调Runx2和Osterix的表达可以提高骨密度、促进骨形成，起到抗OP作用^{［23，24］}。在本研究中，复方苗药九仙罗汉接骨汤组相对钙化结节含量显著增加，成骨细胞增值率明显提高，Runx2和Osterix的蛋白表达及mRNA表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）。表明复方苗药九仙罗汉接骨汤可以通过上调Runx2、Osterix的表达促进成骨细胞增殖、分化。

自噬是维持细胞内环境稳定的重要机制，严格调节人体生理多种功能活动，可以将受损的细胞、细胞器以及蛋白质自行降解以维持细胞内环境稳定、细胞自身更新及细胞分解代谢等^［25］。LC3和p62是细胞发生自噬的标志物，也是评价自噬水平的重要指标^{［26，27］}。当自噬激活时，LC3由Ⅰ型转化为Ⅱ型，并可以介导自噬体与溶酶体融合，促使自噬囊泡中p62溶酶体酶降解^{［28，29］}。因此，LC3Ⅱ的含量或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值大小与自噬活性呈正相关，p62的表达量与自噬活性呈负相关。相关研究发现，当大鼠成骨细胞自噬下降之后导致骨形成、骨吸收及骨转换减少，最终导致OP等相关骨疾病的发生，增强自噬后，其骨形成显著增加^{［30，31］}。因此，自噬通过参与调控成骨细胞的增殖、分化和活性，严格调控着骨细胞内稳态和骨代谢平衡，与OP关联密切。本实验结果显示，复方苗药九仙罗汉接骨汤组LC3蛋白表达及mRNA表达显著上升，免疫荧光强度明显增加，差异均有统计学意义（P<0.01）；p62蛋白表达及mRNA表达显著降低，免疫荧光强度明显减弱，差异均有统计学意义（P<0.01）。

自噬小体的形成在成骨自噬过程中尤为重要，成骨细胞的增殖分化亦受到自噬的影响。为证实自噬对复方苗药九仙罗汉接骨汤促进成骨细胞增殖和分化的影响，本研究用3‑MA自噬抑制剂处理复方苗药九仙罗汉接骨汤组后，其LC3、Runx2和Osterix的蛋白表达及mRNA表达明显降低，成骨细胞增值率明显减少，差异具有统计学意义（P<0.01），LC3免疫荧光强度明显下降，差异具有统计学意义（P<0.01）；p62蛋白表达及mRNA表达明显增加，免疫荧光强度明显提高，差异具有统计学意义（P<0.01）。透射电镜视野下见少量或未见典型自噬溶酶体和自噬小体结构。以上结果说明激活成骨细胞自噬可有效促进成骨细胞的增殖及骨形成，3‑MA抑制自噬部分逆转了复方苗药九仙罗汉接骨汤对大鼠成骨细胞增殖和分化的促进作用。因此推测复方苗药九仙罗汉接骨汤可能通过激活自噬实现促进大鼠成骨细胞增殖和分化的作用。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是参与成骨增殖、自噬、骨重建的重要枢纽^［6，32］。PI3K介导的活化促使下游因子蛋白激AKT磷酸化，从而调节重要的细胞过程，如细胞代谢，增殖，AKT可以通过激活mTOR整合来自细胞环境的信号通路，最终调节细胞自噬反应对细胞的生长、增殖和存活具有重要意义^［33］。相关实验研究亦表明通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路调节相关基因的表达，促进成骨细胞自噬进而抑制凋亡促进其增殖、分化和骨再生^{［34，35］}。本实验分析了在10%浓度下复方苗药九仙罗汉接骨汤剂干预后MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因的表达，结果显示复方苗药九仙罗汉接骨汤组MC‑3T3‑E1成骨细胞PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达水平显著增加，差异具有统计学意义（P<0.01）。为了进一步验证PI3K/AKT/mTOR信号通路与自噬在复方苗药九仙罗汉接骨汤促进细胞增殖的关系，采用3‑MA自噬抑制剂干预MC3T3‑E1Subclone14成骨细胞，结果显示，3‑MA组细胞中PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达水平明显低于复方苗药九仙罗汉接骨汤组，差异具有统计学意义（P<0.01）。因此，笔者认为复方苗药九仙罗汉接骨汤可以通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路激活成骨细胞自噬达到调节成骨细胞增殖、分化的作用，可能是骨质疏松的防治机制之一。

综上所述，复方苗药九仙罗汉接骨汤可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路表达，激活细胞自噬，促进成骨细胞增殖、分化，为复方苗药九仙罗汉接骨汤在骨质疏松临床防治中的应用提供了实验基础。但本实验也存在一定的局限性，此次实验仅在体外研究了复方苗药九仙罗汉接骨汤通过激活自噬促进成骨细胞增殖分化的作用，而OP的发病机制很复杂，具体机制还需深入探索。因此，在未来的研究中会结合体内及临床实验，深入验证复方苗药九仙罗汉接骨汤对防治OP的作用机制。

作者贡献度说明：

宁众：实施实验及撰写文稿；唐良华：实验技术指导；余梁、殷天坪：数据分析；李义、杨彦君：样本收集及审校；王洪发：设计实验。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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