复方苗药九仙罗汉接骨汤通过提高自噬促进MC3T3-E1Subclone14成骨细胞分化防治骨质疏松

摘要

目的：探讨复方苗药九仙罗汉接骨汤对MC3T3-E1Subclone14成骨细胞增殖分化的影响以及PI3K/AKT/mTOR信号通路和细胞自噬在其中的作用。方法：选取对数生长期大鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1Subclone14，用不同浓度的复方苗药九仙罗汉接骨汤（0%～20%）干预，通过CCK8观察细胞活力确定复方苗药九仙罗汉接骨汤的最佳作用浓度；用最佳浓度复方苗药九仙罗汉接骨汤处理MC3T3-E1Subclone14细胞，将成骨细胞分为A组（成骨分化诱导组），B组（成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h组），C组[成骨分化诱导+5 mmol/L 3-甲基嘌呤（3-MA）组]，D组（成骨分化诱导+10%复方苗药九仙罗汉接骨汤含药血清3 h+5 mmol/L 3-MA组）和空白对照组。采用茜素红染色检测各组相对矿化结节含量；CCK8观察各组成骨细胞增殖率；Western blot检测各组成骨分化蛋白Runx2、Osterix表达水平及自噬相关蛋白LC3、p62表达水平；q-PCR检测各组成骨分化基因Runx2、Osterix mRNA和自噬相关基因LC3、p62 mRNA及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因PI3K、AKT、mTOR mRNA表达情况；免疫荧光染色检测各组LC3、p62在细胞内的表达情况；透射电镜检测各组细胞内自噬小体的形成情况。结果：复方苗药九仙罗汉接骨汤能促进成骨细胞的增殖、分化，浓度为10%效果最明显（P<0.01）。成骨分化诱导组矿化结节形成明显多于空白对照组。与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤组矿化结节形成明显增加（P<0.01），细胞增殖率明显升高（P<0.01）。与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤上调成骨分化标志物Runx2、Osterix及自噬相关标志物LC3蛋白及基因的表达（P<0.01），同时下调p62蛋白及基因的表达（P<0.01）。加入3-MA抑制自噬后能够拮抗这些效应。免疫荧光显示，与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤组能够促进LC3在细胞内的表达（P<0.01），同时抑制p62在细胞内的表达（P<0.01）；加入3-MA后，抑制LC3在细胞内的表达（P<0.05），同时促进p62在细胞内的表达，且细胞增值率及活性明显降低（P<0.01）。透射电镜显示复方苗药九仙罗汉接骨汤组自噬小体增加，3-MA抑制自噬小体增加。与成骨分化诱导组相比，复方苗药九仙罗汉接骨汤组PI3K、AKT、mTOR mRNA表达明显增加（P<0.01），加入3-MA抑制自噬后PI3K、AKT、mTOR mRNA表达明显减少（P<0.01）。结论：复方苗药九仙罗汉接骨汤可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路和增强自噬促进MC3T3-E1Subclone14细胞成骨分化，其作用机制可能与调节Runx2、Osterix、LC3、p62蛋白及基因表达有关。

关键词

复方苗药九仙罗汉接骨汤 / 自噬 / 成骨细胞 / 细胞分化 / PI3K/AKT/mTOR信号通路