3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架修复犬种植体周围炎伴骨缺损

3D Printed nano‑hydroxyapatite/chitosan composite with Minocycline repairs dog bone defects & peri‑implantitis

摘要

目的 探究3D打印载米诺环素纳米羟基磷灰石（nano‑hydroxyapatite，nHA）/壳聚糖（Chitosan，CS）复合支架对犬种植体周围炎伴骨缺损的修复效果。 方法 6只雄性比格犬下颌后牙即刻种植后在植体颈部利用丝线栓结法4周建立种植体周围炎模型，并回植支架材料。将犬双侧下颌分为对照C1（nHA）组、对照C2（米诺环素）组、实验T0（nHA/CS）组、实验T1（nHA/CS/米诺环素）组。使用计算机断层扫描（CBCT）和组织病理学分析支架对患有种植体周围炎伴骨缺损的比格犬的影响。并于即刻种植及支架回植术后3、7、30 d后采用ELISA检测种植体周围龈沟液中IL‑8和IL‑34的水平。 结果 支架回植术后，ELISA检验显示实验T1组在各个测量时间点的IL‑8和IL‑34水平均低于实验T0组，且在术后30 d其IL‑8和IL‑34水平均低于对照C2组，差异具有统计学意义（P<0.05）。CT显示实验T1组在术后1个月植体颈部牙槽嵴顶未见明显吸收影像，其余各组仍存在骨缺损。各组DD值、DW值、BL值差异均具有统计学意义（F=19.232、216.008、71.985，P<0.05）。H&E组织学染色结果实验T1组成骨效果最佳，可见大量成纤维血管化及成骨细胞且有明显的可降解性。 结论 3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架对犬种植体周围炎骨缺损的修复效果较好，复合载药支架具有较好的抑炎效果，能有效地促进牙槽骨缺损修复。

Abstract

Objective To explore the repair effect of 3D‑printed nano‑metronidazole hydroxyapatite （nano‑hydroxyapatite， nHA）/chitosan （Chitosan， CS） composite scaffolds on periodontal disease with bone defect in dogs. Methods A total of 6 male beagle dogs had their posterior mandibular teeth immediately implanted. After 4 weeks， a periodontal disease model was established around the implants using the suture ligation method， and the scaffold material was reimplanted. The bilateral mandibles of dogs were divided into control C1 （nHA） group， control C2 （minocycline） group， experimental T0 （nHA / CS） group and experimental T1 （nHA / CS / minocycline） group. Analysis of stent effects on beagle dogs with peri‑implantitis bone defects using computerized tomography （CBCT） and histopathology. And the levels of IL‑8 and IL‑34 in the peri‑implant gingival crevicular fluid were measured by ELISA on 3rd， 7th and 30th day after immediate implantation and stent reimplantation. Results After stent reimplantation， ELISA test showed that the IL‑8 and IL‑34 levels in the experimental T1 group were lower than the experimental T0 group at each measurement time point， and the IL‑8 and IL‑34 levels were lower than the control C2 group at 30th day after surgery， showing a statistically significant difference （P<0.05）. CT showed no obvious resorptive shadow in the experimental T1 group in the implant 1 month after surgery， while bone defect was still present in the other groups. DD， DW and BL values were significant in each group （F=19.232， 216.008， 71.985， P<0.05）. The histological staining of H&E showed the best effect of the experimental T1 bone composition， and a large number of fibroblastic vessels and osteoblasts were obviously biodegradable. Conclusion 3D printed nHA/CS carrier Minocycline composite scaffold shows a promising repair effect on canine implant‑related periodontitis with bone defects. That has a good antibacterial effect and can effectively promote the repair of alveolar bone defects.

Graphical abstract

关键词

3D打印 / 纳米羟基磷灰石（nHA） / 壳聚糖（CS） / 米诺环素 / 载药支架 / 种植体周围炎 / 骨缺损 / 比格犬

Key words

3D printing / Nano‑hydroxyapatite / Chitosan / Minocycline / Vehicle holder / Peri‑implantitis / Bone defect / Beagle dog

近年来，种植修复已成为治疗缺失牙患者的首选方法，长期的随访研究显示口腔种植体成功率5~10年内可达90%~96%^［1］，但种植体周围炎仍是最主要的并发症^［2］。种植体周围炎表现为种植体周围软组织炎症，继续发展就造成种植体周围支持骨的吸收^［3］，严重者还会导致种植体松动脱落以及种植修复失败^［4］。

众所周知，牙菌斑是导致种植体周围炎的始动因子。口腔为有菌环境，种植治疗中出现的医源性因素^［5，6］、患者不良习惯^［7］以及口腔卫生护理的失当和牙周疾病^［8］等因素也会导致种植体周围炎的发生^［9］。因此，治疗主要原则就是积极控制风险的同时给予抗感染治疗，控制龈下的菌斑微生物，然而目前治疗方法还未形成体系，如何长期、稳定地控制种植体局部菌斑，恢复种植体周围足够的骨量和良好的骨质是目前亟待解决的问题^［10］。临床上针对种植体周围炎治疗的主要原则就是给予抗感染治疗，而使用最普遍的药物是盐酸米诺环素，其具有易渗透、药效强、作用持久及不良反应小等临床特点^［11］。对于种植体周围炎骨缺损的再生修复，手术治疗并不总是被患者所普遍接受^［12］，而组织工程技术的发展提供了新的思维方式和方法。通过构建复合型材料，以改善单一类型材料的性能^［13］，是近年来学者们的研究重点。现已有诸多研究报道将nHA/CS复合物作为药物载体，在实现药物缓释作用的同时控制骨缺损进一步发展^［14］。

3D打印技术以其高度精准性和对复杂结构的适应性，为临床上解决个性化的骨缺损和缺失的修复提供了革命性解决方案。在临床治疗中，3D打印技术应用越来越广泛，其可根据患者骨缺损的形态实现个性化设计和制造，提高材料与骨组织的适配性^［15］。

笔者希望通过3D打印技术，将nHA和CS混合并负载米诺环素制成一种既可以修复骨缺损又可在局部缓慢释放药物的多功能新型骨支架材料。本课题组前期已经成功构建了3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架材料，并且验证了其具有良好的理化性能和细胞生物相容性，且米诺环素浓度为5 µmol/L的复合支架具有较好的生物相容性及低细胞毒性^［16］。因此本研究将选取3D打印nHA 2.5 g、CS 1 g并载米诺环素1 mg的复合支架作为实验支架用以进行动物实验。将该支架回植入种植体周围炎骨缺损动物模型中，观察种植体周围炎动物牙周组织的疗效，为临床修复个性化牙周组织缺损提供理论基础及实践依据，同时也为骨组织材料的改良提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康雄性清洁型成年比格犬6只［12~14个月，13~14 kg，SCXK（苏）2021‑0015，江苏亚东实验动物研究院有限公司，饲养环境：温度20~26 ℃，湿度40%~70%］，样本量根据80%的实验功效和0.05的显著性水平计算得出^［17］。动物实验方案经江西中洪博元生物技术有限公司实验动物伦理审查伦理委员会审核批准，批准号为LL‑202302230001。

1.1.2 实验试剂、材料和仪器

米诺环素（天津阿拉丁试剂有限公司，型号M102970）、纳米羟基磷灰石（上海阿拉丁试剂有限公司，型号H106378）；法国安多健种植系统（型号：φ3.4 mm×10 mm）；Whatman3#滤纸条（上海必泰生物科技有限公司）；犬白介素34（IL‑34）ELISA试剂盒（MM‑8526201，检测范围：4~220 pg/mL）；犬白介素8（IL‑8）ELISA试剂盒（MM‑057001，检测范围：8~240 pg/mL）；全自动酶标仪（WD‑2012B，北京六一）；牛血清蛋白（上海源叶生物科技有限公司）；PBS缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；CBCT（德国KaVo）；光学显微镜；切片机（德国LEICA）。

1.2 实验方法

1.2.1 即刻种植

比格犬6只，按25 mg/kg硫喷妥钠计量全麻下，碘配消毒口腔后，微创拔除双侧下颌第一、二、三前磨牙和第一磨牙，拔牙窝内行彻底刮治，减小创伤。在拔牙后即种植植体，利用小球钻定位种植点，扩孔钻逐级预备，0.9%等渗盐水冲洗牙槽窝并去除残余骨屑后即刻植入法国安多健种植体，每只犬每侧下颌骨各2枚种植体（共24枚）。预备种植窝时钻速约为500 r/min，植入扭矩约为35 N/cm，获得初始固位后不松动，完成种植模型的制备过程。牙龈黏膜覆盖缝合（图1A），术后肌肉注射庆大霉素并观察伤口出血及肿胀情况。术后1周，每天利用2 g/mL苯扎溴胺清洁1次口腔，以预防感染，半流食1周，常规护理。期间密切观察伤口愈合及精神、活动情况。在即刻种植1周后牙龈黏膜恢复，拆除缝线并提取种植体周围龈沟液（图1B），检测IL‑8、IL‑34水平作为基线。

1.2.2 种植体周围炎动物模型的建立

采用丝线拴结法诱发种下颌后牙植体周围炎，用丝线在每只犬种植体颈部龈缘水平进行结扎，并沿根尖方向压入龈沟内（使细菌和食物残渣等滞留在丝线上，刺激炎症形成来诱导种植体周围炎），从而形成实验性种植体周围炎（图1C）。另一侧的种植体用同样方法制造种植体周围炎，动物喂以高糖软食以引入菌斑及炎症4周^{［18，19］}（图1D）。模型建立4周后，停止双侧下颌种植体周围炎的诱发干预并拍摄CBCT片确立种植体周围炎骨缺损模型成功建立并测量骨缺损高度作为基线数据。

1.2.3 实验分组

将犬左侧下颌骨两枚植体分为对照C1组和对照C2组，右侧下颌骨两枚植体为实验T0组和实验T1组，共4组。6只犬均按上述分组。

1.2.4 支架回植

同样按25 mg/kg硫喷妥钠计量全麻下，打开犬双侧下颌骨黏膜，充分暴露种植体及骨缺损区域，分别将支架材料植入骨缺损内。对照C1组：植入成品单纯nHA粉末2.5 g（n=6）；对照C2组：植入5 μmol／L米诺环素粉末1 mg（n=6）；实验T0组：植入3D打印nHA/CS复合支架材料，nHA/CS配比：nHA 2.5 g、CS 1 g（n=6）；实验T1组：植入3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架材料，nHA/CS配比：nHA 2.5 g、CS 1 g，5 μmol／L米诺环素1 mg（n=6）（图2）。术后口腔护理1周预防感染。

1.3 观察指标

1.3.1 影像学检查

模型建立后即刻、1个月后分别摄CBCT片（0.125立体像素，层厚0.125 mm），测量C1、C2、T0、T1组种植体远中、颊侧、近中和舌侧骨缺损指标（取均值）。骨缺损指标包括：DD（种植体顶部到骨缺损底部的垂直距离，精确到0.1 mm）、DW（骨缺损冠方顶点到种植体表面的水平距离，精确到0.1 mm）、BL（牙槽嵴冠方顶点到种植体顶部的垂直距离，精确到0.1 mm）。

1.3.2 ELISA检测IL‑8、IL‑34水平

支架植入3、7、30 d后，清洁种植体周围，用2 mm×20 mm大小的Whatman3#滤纸条插入植体龈沟内至有阻力时停止，静置30 s后取出，用游标卡尺测量并记录滤纸条被完全浸湿的长度，计算浸湿面积，剪去干燥部分后将滤纸条放入200 μL含1%牛血清蛋白PBS缓冲液的EP管中，-70 ℃冷藏保存，室温平衡至4 ℃后，利用双抗体夹心ABC‑ELISA法检测龈沟液内IL‑8及IL‑34，计算出采集样品中IL‑8及IL‑34的水平。

1.3.3 组织学评价

种植体周围炎动物模型建立并进行支架回植的1个月后及3个月后分别放血处死动物，取下颌骨术区及周围骨块，去尽周围结缔组织，甲醛固定24 h，甲酸脱钙、乙醇梯度脱水、浸蜡、石蜡包埋、近远中向制作厚80 μm的切片，进行HE染色：置于苏木素中染1 min，盐酸酒精分化，漂洗，氨水水溶液返蓝，冲洗；放入伊红染液中染色数秒，放入75%、85%、无水乙醇各脱水1~2 min，浸泡在二甲苯中透明处理，中性树胶封片。在20倍光学显微镜下观察植体颈部骨组织改变，观察有无成骨细胞、纤维血管化及骨小梁等结构出现。

1.4 统计学处理

利用SPSS 26.0软件进行统计分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，计量资料做正态性和方差齐性检验，骨缺损3项指标组内比较均利用基线数据和术后1个月数据进行配对t检验，骨缺损3项指标及IL‑8、IL‑34水平的组间比较进行ANOVA方差统计分析，组内两两比较采用LSD‑t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 影像学检查

CBCT显示种植体颈部牙槽嵴高度明显下降并可见明显凹陷性骨缺损及螺纹暴露（图3），证实种植体周围炎骨缺损模型的成功建立。支架植入1个月后，各组骨缺损模型均有不同程度的新形成的骨向缺损内长入，特别是实验T1组新骨生长更为明显，牙槽嵴顶几乎未见明显吸收暗影，与种植体间未见明显骨缺损，而其他组植体颈部仍存在部分骨缺损。术后1个月，各组测量骨缺损指标的数值（DD值、DW值、BL值）与基线值存在差异，且差异均有统计学意义（P<0.05）。其余3组（对照C1组、对照C2组、实验T0组）术后1个月的骨缺损指标测量值与基线的差值均与实验T1组有差异，差异均有统计学意义（F=19.232、216.008、71.985，P<0.05）（图4）。

2.2 ELISA检测IL‑8、IL‑34水平

各组不同测量时间IL‑8、IL‑34水平值。4组白介素水平值在基线时差异无统计学意义（F=0.517，P>0.05）。与实验T0组相比，实验T1组在支架回植后3、7、30 d，IL‑8和IL‑34水平值明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。此外，与对照C2组相比，实验T1组在支架回植后3 d和7 d的IL‑8和IL‑34差异无统计学意义（P>0.05），但在30 d时，IL‑8和IL‑34水平下调，差异具有统计学意义（P<0.05）（图5）。

2.3 组织学评价

1个月末，对照C1组有少量成骨细胞及成骨化表现；对照C2组见成纤维结缔组织；实验T0组支架周围可见破骨细胞，有成骨样结构及细胞出现，见部分炎性细胞浸润；实验T1组可见支架空隙周围存在大量破骨细胞、成骨样结构及细胞。

3个月末，对照C1组支架周围见大量成纤维血管化细胞；对照C2组骨周围大量成纤维结缔组织；实验T0组支架材料已出现明显降解，且周围见成骨样结构及大量成纤维组织；实验T1组支架材料可见明显降解，且支架周围见大量纤维血管化、骨小梁结构及成骨样细胞（图6）。

3 讨论

种植体周围炎起初表现为种植体周黏膜炎症，严重时甚至可出现经典对称的“浅碟型”骨缺损^［20］，而大多种植体松动失败都是由骨缺损导致的。目前颌骨缺损最理想的修复方式是骨组织工程，因其对受体创伤小、低免疫原性，可实现个性化修复组织缺损。羟基磷灰石（HA）是在哺乳动物的骨骼（如牛）等生物来源中发现，是磷灰石家族的成员之一。HA也可通过各种技术进行合成，根据所需的形状、颗粒大小和化学成分调整^［21］。nHA是HA在纳米级尺度的细微颗粒，可以模拟与人体骨骼相似的化学和物理特性，具有良好的生物降解性，使药物能够结合并缓慢释放到骨上，已被广泛用于传递各种药物或生物活性分子。近年来，HA和有机聚合物的新型复合材料可以弥补纯HA的弱力学性能，已经成为人们的研究热点。CS是天然聚合物，无毒性且具有一定的抗菌性和较强的可塑造性等。nHA/CS复合材料最近已被作为组织工程的良好候选材料，特别是骨和软骨支架领域^［22］。nHA/CS复合支架还可搭载抗生素及其他抑菌剂，达到药物的缓慢释放。目前种植体周围炎的治疗以控制菌斑为主，但最常用的抗生素的细胞内渗透能力较差^［23］，细胞内感染仍然难以根除。米诺环素，属于四环素类抗菌药物，其渗透能力强，将其注入牙周袋中能直接对病灶产生作用、局部浓度高、药效强，小剂量即可起效，有助于改善牙周指数及炎症微环境^［24］。其作用机制是与细菌的转运RNA结合，抑制蛋白合成，从而实现缓解、治疗早期种植体周围炎的目的。目前，米诺环素已被广泛用于治疗临床牙周炎和种植体周围炎^［25］，此外，米诺环素不仅可以抑制骨组织的吸收、加速骨代谢^［26］，还能抑制多种牙周致病菌，从而促进牙周软硬组织的再生恢复^［27］。

本课题组通过3D打印技术打印出的复合载药支架材料具有一定的强度、孔隙率、良好的物理性能和细胞生物相容性。因此，该支架被用于进一步的体内测试。任何一种新型支架材料的研发都离不开动物体内实验的检测，基础理论为有效的临床治疗提供支持，种植体周围炎的临床治疗均需动物实验进行验证。在大型动物模型中，犬的颌骨组织结构以及牙齿的解剖、生长模式和病理生理学，与人类较为相似^［28］。已有研究证实了比格犬在牙周病研究中的有效性。雄性比格犬下颌后牙区骨量相对更加丰满，是实验性植入种植体的理想区段^［29］，因此口腔种植相关的动物模型常选用成年雄性比格犬^［30］。

研究表明，种植体周围炎的发生、发展可刺激龈沟液中某些炎症因子的释放和表达，如IL‑6、IL‑8等^［31］。随着时间的发展，种植体周围骨缺失的风险与IL‑8相关^［32］。IL‑8可由内皮细胞、巨噬细胞等细胞分泌，参与牙周病的发生和发展。已有研究证明IL‑34对单核吞噬细胞谱系细胞的分化和增殖的影响以及破骨细胞的形成和在炎症反应中起到关键作用^［33］。IL‑34作为M‑CSF受体的功能性配体，能激活下游的相关信号通路，促进破骨细胞形成，因此这可能预示其在种植体周围炎性骨吸收中的决定性作用^［34］。因此，IL‑34、IL‑8参与协同调节免疫细胞，促进骨组织的破坏和加速骨吸收的形成。本研究的各组ELISA检测结果及统计学分析表明：支架植入术后各组IL‑8、IL‑34水平在种植体龈沟液内均明显高表达，而表达越高表明炎症反应越强烈。随时间的推移IL‑8及IL‑34水平值均有所下降，各测量时间4组龈沟液中白介素水平下降程度不同。与实验T0组相比，实验T1组在支架回植后3、7、30 d，IL‑8和IL‑34水平值均明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05），此结果表明米诺环素在种植体周围炎早期即形成有效的抑炎作用，可以使炎性因子低表达，减轻炎性微环境，从而缓解炎症。此外，与对照C2组相比，实验T1组在支架回植后3 d和7 d的IL‑8和IL‑34没有明显差异，但在30 d时，种植体周龈沟液中IL‑8和IL‑34水平下降，差异具有统计学意义（P<0.05）。这进一步反映了3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架可能对米诺环素有缓释作用，3D打印复合载药支架可能延长抗生素作用的持续时间。以上数据表明，3D打印复合载药材料有利于抗生素更好地发挥作用，从而抑制炎症微环境。

本研究影像学检查及统计学分析结果表明：对照C1组、对照C2组与实验T0组植体颈部的骨缺损虽然得到了一定程度修复，但仍有部分骨缺损存在，实验T1组种植体周围牙槽嵴顶几乎未见明显吸收影像，颈部周围骨缺损几乎不可见。表明实验T1组3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架的成骨效果最佳，组织学检查也支持了这一结论，实验T1组在1个月末时可见支架空隙周围有大量破骨细胞、成骨样结构及细胞出现且3个月末可见支架周围见大量纤维血管化、骨小梁结构及成骨样细胞。而支架材料在3个月末已成功与种植体结合并未发现有继发骨吸收和破坏。表明实验T1组植入的3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架的成骨效果最佳，而单纯的3D打印nHA/CS支架虽然可以填补骨缺损，但未能有效控制种植体周围炎，造成种植体周围永久的骨吸收，这种情况的出现对于种植远期疗效产生影响。实验T0、T1组支架材料在3个月末均出现明显降解，但限于课题客观因素，本实验暂未纳入材料的降解速率观察指标，后期实验将会继续深入研究。

综上所述，3D打印载米诺环素nHA/CS复合支架在生理环境、模拟种植体周围炎环境下，具有较好的抑炎效果，并促进细胞成骨向分化，阻止种植体周骨缺损进一步发展，促进牙槽骨缺损修复。

作者贡献度说明：

李紫含：参与实验研究、数据分析、相关文献搜集与整理及论文撰写；方君怡：协助完成实验实施，采集及分析数据；杨楠、汪振华：研究设计构思、文章修改审阅、项目经费资助。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Anitua E， Piñas L， Begoña L， et al. Long‑term retrospective evaluation of short implants in the posterior areas： Clinical results after 10‑12 years［J］. Clin Periodontol， 2014， 41（4）： 404‑411.

[2] Atieh MA， Almutairi Z， Amir‑Rad F， et al. A retrospective analysis of biological complications of dental implants［J］. Int J Dent， 2022， 2022： 1545748.

[3] Wada M， Mameno T， Otsuki M， et al. Prevalence and risk indicators for peri‑implant diseases： A literature review［J］. Jpn Dent Sci Rev， 2021， 57： 78‑84.

[4] Schwarz F， Derks J， Monje A， et al. Peri‑implantitis［J］. J Periodontol， 2018， 89（）： S267‑S290.

[5] Staubli N， Walter C， Schmidt JC， et al. Excess cement and the risk of peri‑implant disease‑a systematic review［J］. Clin Oral Implants Res， 2017， 28（10）： 1278‑1290.

[6] 黄枚钰， 沈玉凤， 姜丹丹， 等. 穿龈轮廓与骨水平种植体周围炎的相关性研究［J］.口腔医学研究， 2022， 38： 1042‑1046.

[7] Huang MY， Shen YF， Jiang DD， et al. Correlation of the gingival profile and peri‑implantitis at the bone level ［J］. Oral Med Res， 2022，38：1042‑1046.

[8] 梁建飞， 刘益兵， 金羽. 吸烟对健康人群种植体周围微生物多样性及其功能的影响［J］. 口腔生物医学， 2024， 15（5）： 271‑275.

[9] Liang JF， Liu YB， Jin Y. Effects of smoking on microbial diversity and its function in healthy populations ［J］. Oral Biomed， 2024，15 （5）： 271‑275.

[10] Isler SC， Soysal F， Ozcan E， et al. Evaluation of adipokines and inflammatory mediator expression levels in patients with periodontitis and peri‑implantitis： A cross‑sectional study［J］. Clin Oral Investig， 2021， 25（6）： 3555‑3565.

[11] 杨成雪， 喻正文， 范芹. 种植体周围病的病因及危险因素［J］. 临床口腔医学杂志， 2020， 36（5）： 313‑316.

[12] Yang CX， Yu ZW， Fan Q. Etiology and risk factors of peri‑implant disease ［J］. J Clin Oral Med， 2020，36 （5）： 313‑316.

[13] Louropoulou A， Slot DE， Van der Weijden F. The effects of mechanical instruments on contaminated titanium dental implant surfaces： A systematic review［J］. Clin Oral Implants Res， 2014， 25（10）： 1149‑1160.

[14] 叶刚. 盐酸米诺环素软膏与碘甘油治疗慢性牙周炎的疗效及对患者系统炎症状况的影响研究［J］. 中国实用医药， 2015， 10（9）： 5‑7.

[15] Ye G. Study on the efficacy of minocycline hydrochloride ointment and iodoglycerine in treating chronic periodontitis and its influence on the systemic inflammation condition of patients ［J］. China Pract Med， 2015，10 （9）： 5‑7.

[16] Decker AM， Sheridan R， Lin GH， et al. A prognosis system for periimplant diseases［J］. Implant Dent， 2015， 24（4）： 416‑421.

[17] Vrba J， Janca R， Blaha M， et al. Modeling of brain tissue heating caused by direct cortical stimulation for assessing the risk of thermal damage［J］. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng， 2019， 27（3）： 440‑449.

[18] Palazzo B， Gallo A， Casillo A， et al. Fabrication， characterization and cell cultures on a novel composite chitosan‑nano‑hydroxyapatite scaffold［J］. Int J Immunopathol Pharmacol， 2011， 24（1 ）： 73‑78.

[19] 陈艺菲， 郑赛男， 阙林. 3D打印复合材料骨组织工程支架及其在颌面骨再生中的研究进展［J］. 山东医药， 2022， 62（25）： 83‑86.

[20] Chen YF， Zheng SN， Que L. 3D printed composite bone tissue engineering scaffold and its progress in maxillofacial bone regeneration ［J］. Shandong Med J， 2022，62 （25）： 83‑86.

[21] 牛婉琼， 杨楠， 刘佳怡， 等. 3D打印n‑HA/壳聚糖/米诺环素复合支架的构建与其理化性能、细胞毒性研究［J］.新疆医科大学学报， 2023， 46： 1009‑1016.

[22] Niu WQ， Yang N， Liu JY， et al. Construction of a 3D printed n‑HA / chitosan / Minocycline composite scaffold with its physicochemical properties and cytotoxicity study ［J］. J Xinjiang Med Univ， 2023，46：1009‑1016.

[23] 曹策， 李玲美， 訾明杰， 等. 医学研究中动物实验样本量的确定方法［J］. 中国比较医学杂志， 2023， 33（2）： 99‑105.

[24] Cao C， Li LM， Zi MJ， et al. Method of determining the sample size of animal experiments in medical research ［J］. Chin J Compar Med， 2023，33 （2）： 99‑105.

[25] Park SY， Kim KH， Rhee SH， et al. An immediate peri‑implantitis induction model to study regenerative peri‑implantitis treatments［J］. Clin Oral Implants Res， 2017， 28（1）： 36‑42.

[26] Boldeanu LC， Boariu M， Rusu D， et al. Histomorphometrical and CBCT evaluation of tissue loss progression induced by consecutive， alternate ligatures in experimental peri‑implantitis in a dog model： A pilot study［J］. J Clin Med， 2022， 11（20）：6188.

[27] Ting M， Suzuki JB. Peri‑implantitis［J］. DENT J， 2024， 12（8）：251.

[28] Firdaus Hussin MS， Abdullah HZ， Idris MI， et al. Extraction of natural hydroxyapatite for biomedical applications‑a review［J］. Heliyon， 2022， 8（8）： e10356.

[29] Nikpour MR， Rabiee SM， Jahanshahi M. Synthesis and characterization of hydroxyapatite/chitosan nanocomposite materials for medical engineering applications［J］. Compos Part B‑Eng， 2012， 43（4）： 1881‑1886.

[30] Abed N， Couvreur P. Nanocarriers for antibiotics： A promising solution to treat intracellular bacterial infections［J］. Int J Antimicrob Agents， 2014， 43（6）： 485‑496.

[31] 费晓磊. 盐酸米诺环素治疗慢性牙周炎的前瞻性随机研究［J］. 航空航天医学杂志， 2022， 33（9）： 1088‑1090.

[32] Fei XL. A prospective， randomized study of Minocycline hydrochloride in the treatment of chronic periodontitis ［J］. J Aerosp Med， 2022，33（9）： 1088‑1090.

[33] 闫志刚. 盐酸米诺环素软膏联合替硝唑对慢性牙周炎患者氧化应激反应及龈沟液炎症因子水平的影响［J］. 中国医药导报， 2021， 18（30）： 121‑124.

[34] Yan ZG. Effect of Minocycline hydrochloride ointment combined with Tenidazole on oxidative stress response and inflammatory factor levels in gingival crevicular fluid in patients with chronic periodontitis ［J］. China Med Herald， 2021，18 （30）： 121‑124.

[35] Ma Y， Song J， Almassri HNS， et al. Minocycline‑loaded PLGA electrospun membrane prevents alveolar bone loss in experimental peridontitis［J］. Drug Deliv， 2020， 27（1）： 151‑160.

[36] 邱雪冰， 曹健云， 吴丽丽. Er∶YAG激光联合盐酸米诺环素对药物性牙龈增生患者龈沟液中TGF‑β1、IL‑1β水平的影响［J］. 实用口腔医学杂志， 2020， 36（4）： 658‑661.

[37] Qiu XB， Cao JY， Wu LL. Effect of Er： YAG laser combined with Minocycline hydrochloride on TGF‑β1 and IL‑1β levels in the gingival groove fluid of patients with drug‑induced gingival hyperplasia ［J］. J Pract Oral Med， 2020，36 （4）： 658‑661.

[38] Watanabe K， Kikuchi M， Barroga EF， et al. The formation of apical delta of the permanent teeth in dogs［J］. J Vet Med Sci， 2001， 63（7）： 789‑795.

[39] Zhang Z， Gan Y， Guo Y， et al. Animal models of vertical bone augmentation （Review）［J］. Exp Ther Med， 2021， 22（3）： 919.

[40] 梁俊威， 林海燕. 犬类种植体周围炎模型构建的研究进展［J］. 浙江医学， 2024， 46（4）： 434‑439.

[41] Liang JW， Lin HY. Progress in the construction of peri‑implantitis model in dogs ［J］. Zhejiang Med， 2024，46 （4）： 434‑439.

[42] Severino VO， Napimoga MH， de Lima Pereira SA. Expression of IL‑6， IL‑10， IL‑17 and IL‑8 in the peri‑implant crevicular fluid of patients with peri‑implantitis［J］. Arch Oral Biol， 2011， 56（8）： 823‑828.

[43] Clark R， Zwicker S， Bureik D， et al. Expression of colony‑stimulating factor 1 and interleukin‑34 in gingival tissue and gingival fibroblasts from periodontitis patients and controls［J］. J Periodontol， 2020， 91（6）： 828‑835.

[44] Zhou RP， Wu XS， Xie YY， et al. Functions of interleukin‑34 and its emerging association with rheumatoid arthritis［J］. Immunology， 2016， 149（4）： 362‑373.

[45] Sergiu D， Mihai GD， Marilena CC， et al. Could pro‑inflammatory cytokines levels IL‑6， IL‑8， TNFα， total antioxidant status and lactate dehydrogenase be associated with peri‑implant bone loss？ A pilot study［J］. Appl Sci， 2021， 11（22）： 11012.

基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2020D01A28)