臭椿酮通过HSP90/PKM2/STAT3信号通路抑制HCC细胞的活性

Ailanthone inhibits the activity of HCC cells through HSP90/PKM2/STAT3 signaling pathway

摘要

目的 探讨臭椿酮（Ailanthone， AIL）诱导人肝癌SMMC‑7721细胞死亡的作用及潜在的作用机制。 方法 体外培养SMMC‑7721细胞，实验分为对照组和AIL给药组；采用CCK‑8法检测细胞增殖活性；Transwell侵袭和划痕实验检测细胞侵袭迁移能力；试剂盒检测乳酸生成量和葡萄糖含量；流式细胞术检测细胞凋亡水平的变化；Western blot检测HSP90/PKM2/STAT3信号通路及凋亡相关蛋白Bax和Bcl‑2的表达；免疫荧光检测各组细胞中PKM2和HSP90及PKM2与STAT3蛋白之间的相互作用。 结果 AIL抑制SMMC‑7721细胞活性，减弱细胞侵袭和迁移的能力，抑制乳酸生成及增加葡萄糖含量（P<0.05）；流式细胞术结果表明AIL呈浓度依赖性诱导SMMC‑7721细胞凋亡，且凋亡相关蛋白Bax表达增加，Bcl‑2表达降低（P<0.05）。此外，AIL显著抑制PKM2和STAT3蛋白表达（P<0.05），但对HSP90的抑制作用无明显影响（P>0.05）；免疫荧光双染实验结果表明，AIL抑制PKM2/HSP90和PKM2/STAT3复合体形成。 结论 AIL通过HSP90/PKM2/STAT3信号通路来调控细胞糖酵解诱导人肝癌SMMC‑7721细胞凋亡。

Abstract

Objective To investigate the effect and potential mechanism of Ailanthone （AIL） in inducing human hepatocellular carcinoma SMMC‑7721 cell death. Methods SMMC‑7721 cells were cultured in vitro and the experiment was divided into the control group and the AIL administration group. Cell proliferation activity was detected by CCK‑8 assay. Transwell invasion assay and cells scratch assay were used to detect the invasion and migration ability of cells. Lactic acid production and glucose content were detected by the kit. The apoptosis level was detected by flow cytometry. The expressions of HSP90/PKM2/STAT3 signaling pathway and apoptosis‑related proteins Bax and Bcl‑2 on SMMC‑7721cells were detected with Western blot. The interaction between PKM2 and HSP90 and between PKM2 and STAT3 protein were detected by immunofluorescence. Results AIL inhibited the viability of SMMC‑7721 cells， weakened the ability of cell invasion and migration， inhibited lactic acid production and increased glucose content （P<0.05）. The results of flow cytometry showed that AIL induced SMMC‑7721 cell apoptosis in a concentration‑dependent manner， and the expression of apoptosis‑related protein Bax increased， while the expression of Bcl‑2 decreased （P<0.05）. In addition， AIL significantly inhibited the expression of PKM2 and STAT3 （P<0.05）， but had no significant effect on the inhibition of HSP90 （P>0.05）. The results of immunofluorescence double staining showed that AIL inhibited the formation of PKM2/HSP90 and PKM2/STAT3 complexes. Conclusion AIL regulates cellular glycolysis through the HSP90/PKM2/STAT3 signaling pathway induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma SMMC‑7721 cells.

Graphical abstract

关键词

臭椿酮 / 糖酵解 / 肝癌 / PKM2

Key words

Ailanthone / Glycolysis / Hepatocellular carcinoma / PKM2

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康^［1］。根据GLOBOCAN 2022的数据，肝癌已成为全球癌症第三大死亡原因。早期肝癌的治疗方法主要包括肝切除和肝移植、局部经皮消融干预、免疫治疗和全身静脉化疗等多种方式，尽管这些方法提高了肝癌的治疗效果，但复发率高、预后差、病变转移率高等仍然较为严重^［2，3］。有氧糖酵解（Warburg效应）是肿瘤细胞代谢的主要方式，在氧气存在的情况下，大多数癌细胞也会增加葡萄糖消耗并产生乳酸^［4，5］。许多类型的癌细胞，包括肝癌细胞，可以同时增强糖酵解和抑制线粒体三羧酸循环，促进肿瘤进展^［6‑9］。因此，有氧糖糖酵解途径成为HCC治疗的潜在靶点。

近年来，中药由于疗效好，不良反应少，在抗肿瘤治疗中已经得到了广泛应用。臭椿酮（Ailanthone， AIL）是中药臭椿茎皮中提取的主要活性化合物，已被证明具有抗炎、抗疟疾、抗微生物、改善纤维化等生物学活性^{［10‑14］}。已有研究发现，AIL在体内和体外对几种癌症的生长具有抑制作用，如在人肝癌Huh‑7细胞中，AIL可以影响细胞周期进程、细胞凋亡，在抗肝癌治疗中发挥重要作用^［15］。在非小细胞肺癌中，AIL可以抑制异种移植和原位肺癌模型中的肿瘤生长，从而延长了两种荷瘤小鼠的生存期^［16］。此外，AIL抗前列腺癌效果较为显著，是有效的雄激素受体（androgen receptor，AR） 抑制剂，其作用机制主要是通过直接结合p23、抑制AR与热休克蛋白90（heat shock protein 90， HSP90）之间的相互作用、导致AR蛋白质降解，进而抑制下游基因表达实现的^［17］。

然而，AIL在人肝癌SMMC‑7721细胞代谢重编程中的作用与潜在机制尚不明确。因此，本研究旨在探讨AIL通过糖酵解途径抑制肝癌细胞生长的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人肝癌SMMC‑7721细胞（上海葵赛生物QuiCell细胞库）；AIL（MCE，批号：HY‑N1943）；二甲基亚砜（DMSO）（广州赛国生物科技有限公司，批号：1084ML500）；DMEM（赛默飞，批号：11995500）；胰酶细胞消化液、PBS（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G4013、G4202）；CCK‑8（APExBIO，批号：K1018）； BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS‑PAGE凝胶配制试剂盒、4%多聚甲醛固定液、Loading Buffer（碧云天生物技术有限公司，批号：P0012、P0012A 、P0099、P0015）；乳酸检测试剂盒、葡萄糖检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A019‑2‑1、F006‑1‑1）；细胞凋亡试剂盒（贝博生物科技有限公司，批号：BB4101）；山羊抗兔AlexaFluor594、山羊抗小鼠AlexaFluor488（北京博尔迈生物技术有限公司）；一抗：丙酮酸激酶M2型（pyruvate kinase typeM2PK，M2）、HSP90、信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、Bcl2、Bax（武汉三鹰生物技术有限公司）；二抗：山羊抗兔、山羊抗小鼠（白鲨生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

人肝癌SMMC‑7721细胞用DMEM培养基（含10%胎牛血清和1.5%青霉素‑链霉素）于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养，待细胞生长覆盖至80%培养面，按照1∶2或1∶3比例传代。

1.2.2 CCK‑8检测

人肝癌SMMC‑7721细胞以5 000/孔密度接种于96孔板，培养24 h待细胞状态良好后，给予不同浓度的AIL（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L）处理细胞24 h，随后每孔加入10 μL CCK‑8溶液，于培养箱内避光孵育90 min后用酶标仪测定A_{450 nm}处的吸光度值（A）。每个浓度设5个复孔，重复实验3次。计算：细胞抑制率=（对照组A-实验组A）/对照组A×100%，细胞存活率（%）=（实验组A/对照组A）×100%。

1.2.3 Transwell侵袭实验

将基质胶与无血清培养基按照1∶5的比例混合后加入Transwell小室50 μL，制备侵袭小室。随后将各组细胞用无血清培养基稀释成2×10⁴/孔的细胞悬液接种于小室中，将600 μL含血清培养基放入下室，培养24 h后，取出小室，4%多聚甲醛固定细胞30 min，结晶紫染色20 min，清洗，风干小室后，显微镜下拍照。

1.2.4 细胞划痕实验

人肝癌SMMC‑7721细胞以5×10⁵/孔密度接种于6孔板中培养，待细胞密度达90%以上，使用20 μL移液器枪头在孔板中央轻轻划痕，PBS清洗后加入无血清含AIL培养基，在显微镜下拍照记录，24 h后再次进行拍照记录。

1.2.5 Western blot实验

AIL作用细胞24 h后，收集细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，通过SDS‑PAGE分离蛋白后，转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭150 min，PBS清洗后于所测定蛋白一抗中4 ℃孵育过夜后，在相对应二抗中室温孵育90 min后，化学试剂显色发光，采用多功能成像系统进行曝光。

1.2.6 乳酸生成量检测

按3×10⁵/孔将细胞接种于6孔板中，给予不同浓度的AIL（0.2、0.4、0.8 μmol/L）处理细胞24 h后，取细胞上清液作为待测样本，按照试剂盒检测方法进行检测。

1.2.7 葡萄糖含量检测

按3×10⁵/孔将细胞接种于6孔板中，给予AIL处理细胞24 h后，取细胞上清液作为待测样本，样品中加入工作液250 μL，37 ℃避光孵育10 min，测各管吸光度值A_{505 nm}。

1.2.8 Annexin V‑FITC/PI双染实验

按3×10⁵/孔将细胞接种于6孔板中，给予AIL处理细胞48 h后，用不含EDTA胰酶消化细胞，300 g离心5 min，细胞沉淀采用PBS洗2遍，待测样品采用试剂盒检测方式进行测定。

1.2.9 免疫荧光双染实验

按6×10⁴/孔将细胞接种于共聚焦小皿中，培养24 h至细胞生长状态良好，给予AIL处理24 h后。采用4%多聚甲醛固定30 min，免疫荧光通透液通透15 min，5% BSA室温封闭30 min后，加入混合稀释的一抗300 μL，4 ℃孵育过夜。第2天加入300 μL相对应的混合荧光二抗室温避光孵育1 h，最后加入200 μL核染色剂Hoechst 33258室温避光孵育30 min，PBS清洗后加1 mL PBS用蔡司显微镜观察拍摄^［18］。

1.3 统计学处理

数据采用GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，统计数据用\overline{x}\pm s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AIL抑制HCC细胞增殖

AIL分子结构见图1A。CCK‑8实验结果显示，在AIL处理24 h后SMMC‑7721细胞活性呈浓度依赖性降低（IC₅₀=0.402 7）（图1B）。

2.2 AIL抑制HCC细胞的侵袭迁移

采用Transwell实验和细胞划痕实验探讨了AIL对HCC细胞侵袭迁移的影响。结果表明，AIL处理细胞24 h后，细胞穿过基质胶的能力减弱（图2A），以及细胞迁移减慢（图2B）。

2.3 AIL诱导HCC细胞凋亡

AIL作用于SMMC‑7721细胞48 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡，由结果可知，细胞凋亡水平呈浓度依赖性增高（图3A），并且Western blot结果显示AIL上调Bax蛋白表达，下调Bcl‑2蛋白表达（图3B），差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.4 AIL抑制HCC细胞糖酵解水平

采用不同浓度AIL处理细胞24 h后，检测乳酸生成量和葡萄糖含量的变化，实验结果表明AIL呈浓度依赖性抑制乳酸生成，而增加培养基中葡萄糖含量（图4A、B），同时Western blot实验证实（图5A），AIL抑制SMMC‑7721细胞中糖酵解关键酶PKM2蛋白表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.5 臭椿酮通过HSP90/PKM2/STAT3信号通路对HCC细胞糖酵解的影响

Western blot结果显示，AIL处理SMMC‑7721细胞24 h后，PKM2和STAT3蛋白表达受到抑制（P<0.05）但HSP90表达量变化不明显（图5A）。免疫荧光双染实验结果表明，AIL抑制PKM2/HSP90和PKM2/STAT3复合物的形成，破坏了PKM2与HSP90及PKM2与STAT3相互作用（图5B、C）。

3 讨论

HCC因其经常复发和转移而被认为是一种侵袭性肿瘤，通常在晚期被诊断出来，且死亡率高，预后差^［19］。近年来，药用植物常常被用于癌症治疗，AIL是从中草药臭椿中提取的一种重要的准甾类天然植物^［20］，已被报道对多种癌细胞具有抗增殖作用。本研究采用不同浓度的AIL处理人肝癌SMMC‑7721细胞，发现AIL以浓度依赖性抑制SMMC‑7721细胞活性，进一步通过Transwell实验以及细胞划痕实验检测AIL对SMMC‑7721细胞侵袭和迁移的影响，由结果可知，AIL可以减弱SMMC‑7721细胞的侵袭和迁移能力，说明AIL可以显著抑制HCC细胞活性。细胞生长抑制往往与细胞死亡具有一定的联系，然而，AIL诱导SMMC‑7721细胞死亡的作用方式及其具体作用机制尚未见报道。

PKM2在多种癌症中可促进癌细胞生长^［21］，抑制PKM2的表达可抑制体外肝癌细胞的增殖和侵袭，引发细胞死亡，限制转移^［22］。近期有研究显示，HSP90是HCC诊断的潜在生物标志物^［23］，可作为分子伴侣与PKM2结合，增强PKM2蛋白质稳定性和减少蛋白酶体来增加PKM2在HCC细胞中的丰度^［24］。STAT3是各种人类肿瘤中组成型激活的致癌蛋白，是抗癌药物设计的有效靶标，PKM2/STAT3通路在癌症进展中的作用越来越受到关注^［25］。本研究检测了AIL对SMMC‑7721细胞凋亡的影响，结果表明，AIL以浓度依赖性诱导人肝癌SMMC‑7721细胞凋亡并且上调Bax蛋白的表达以及下调Bcl2蛋白的表达。同时，进一步实验结果显示AIL破坏PKM2、HSP90与PKM2、STAT3之间的相互作用，抑制PKM2、HSP90和STAT3蛋白表达。因此，笔者猜测AIL可能通过破坏PKM2与HSP90之间的相互作用，降低PKM2稳定性从而破坏PKM2/STAT3复合体的形成并抑制PKM2/STAT3信号通路来诱导细胞凋亡。

有氧糖酵解在HCC的发生、发展中扮演着重要角色，是研究HCC代谢特性和开发新疗法的重要靶点^［26］。PKM2是 Warburg效应中的关键限速酶。既往研究表明，HSP90以PKM2依赖的方式促进肝癌细胞的糖酵解和增殖，抑制细胞凋亡^［13］。STAT3也可以通过调节糖酵解关键酶和糖酵解调节剂的表达来促进多种恶性肿瘤的糖酵解代谢，如STAT3激活可以通过上调PKM2蛋白表达促进乳腺癌和黑色素瘤糖酵解作用来促进肿瘤细胞生长^{［27，28］}。本研究发现，AIL可以增加培养基中葡萄糖含量，降低乳酸含量，抑制PKM2蛋白表达并且破坏PKM2/HSP90和PKM2/STAT3相互作用。鉴于此，本课题组证实AIL可能通过抑制HSP90/PKM2/STAT3信号通路，破坏HSP90/PKM2/STAT3之间的相互作用来抑制糖酵解进而促进HCC细胞凋亡，进一步为肝癌治疗提供新的思路。

作者贡献度说明：

林城：负责完成实验、数据分析及手稿撰写；于耕艺、林楚涵：协助完成实验、相关文献搜集；万悦、王恬恬、汪康：协助数据整理，文章格式校对；程秀：写作指导、 项目管理和方法论指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

安徽省教育厅项目(2023AH051922)

安徽省生化工程中心科研平台项目(2023SYKFZ02)

蚌埠医学院研究生科研创新项目(Byycx23052)