孟德尔随机化分析探讨组织蛋白酶与酒精性肝病的因果关系

Mendelian randomization analysis to explore the causal relationship between cathepsins and alcoholic liver disease

摘要

目的 通过两样本孟德尔随机化分析（Mendelian randomization， MR）探讨组织蛋白酶与酒精性肝病之间的因果关系。 方法 设计一个双向双样本MR来评估组织蛋白酶和酒精性肝病之间的因果关系，使用单核苷酸多态性作为工具变量。从公共数据库全基因组关联研究（genome‑wide association studies， GWAS）中提取11种组织蛋白酶和酒精性肝病的GWAS汇总数据。在正向MR分析中，以每种组织蛋白酶作为暴露，以酒精性肝病作为结局。在反向MR分析中，以酒精性肝病作为暴露，以每种组织蛋白酶作为结局。双向MR分析均使用逆方差加权作为主要分析方法，并采用其他方法作为补充参考以评估因果效应。同时还进行了异质性和多效性检验并使用留一法分析评估结果的稳定性。 结果 遗传预测的组织蛋白酶V与酒精性肝病的风险降低相关（IVW：OR=0.853，95%CI=0.743~0.980），酒精性肝病与组织蛋白酶B的增高相关（IVW：OR=1.054，95%CI=1.006~1.105）。 结论 高水平的组织蛋白酶V可能降低酒精性肝病的风险，酒精性肝病的存在可增加组织蛋白酶B的表达，其他组织蛋白酶与酒精性肝病的研究及其他反向研究中并未发现因果关联，结果需要进一步的实验室研究进行验证，以及未来更大样本量的研究提供证据支持。

Abstract

Objective To investigate the causal relationship between cathepsins and alcoholic liver disease by two‑sample Mendelian randomization （MR）. Methods A two‑way two‑sample MR was designed to assess the causal relationship between cathepsins and alcoholic liver disease， using single nucleotide polymorphisms as instrumental variables. Aggregate genome‑wide association studies （GWAS） data for 11 cathepsins and alcoholic liver disease were extracted from GWAS in public databases. In the forward MR analysis， each cathepsin was used as the exposure and alcoholic liver disease was used as the outcome. In reverse MR analysis， alcoholic liver disease was used as the exposure and each cathepsin was used as the outcome. Inverse variance weighted was used as the primary analysis method for both directions and other methods were used as supplementary references to assess causal effects. Heterogeneity and pleiotropy tests were also performed and the stability of the results was assessed using the retention one method. Results Genetically predicted cathepsin V was associated with a reduced risk of alcoholic liver disease （IVW：OR=0.853， 95%CI=0.743‒0.980）， and alcoholic liver disease was associated with an increase in cathepsin B （IVW：OR=1.054， 95%CI=1.006‒1.105）. Conclusion High levels of cathepsin V may reduce the risk of alcoholic liver disease， the presence of which increases the expression of cathepsin B， and the absence of a causal association between other cathepsin and alcoholic liver disease studies and other reverse studies， and the results need to be validated by further laboratory studies and evidence from future studies with larger sample sizes.

Graphical abstract

关键词

孟德尔随机化分析 / 因果关系 / 组织蛋白酶 / 酒精性肝病

Key words

Mendelian randomization analysis / Causality / Cathepsins / Alcoholic liver disease

酒精性肝病（alcoholic liver disease）是一种由长期过量饮酒引起的肝脏损害，是全球范围内一个严重的健康问题。当人体摄入过多的酒精时，肝脏会遭受损害，逐渐发展为酒精性肝病，它包括可逆的脂肪变性，纤维化进展最快的酒精性脂肪性肝炎，肝脏结构发生改变的肝纤维化，最后发展为危及生命和不可逆的肝硬化，最终可能发生肝细胞癌，导致高死亡率^［1］。酒精性肝病的发病机制包括遗传变异等多个方面，涉及各种风险因素^［2］，其中肝细胞维持内部稳态的能力起着至关重要的作用^［3］。这意味着肝细胞需要调节物质周转，特别是蛋白质周转，以维持代谢平衡。因此，高水平的蛋白水解系统活性对于维持肝细胞的生理功能是必不可少的。

组织蛋白酶（Cathepsins）是半胱氨酸蛋白酶家族的主要成员，其在保持内环境稳态方面发挥着重要作用^［4］。这些蛋白酶参与基本生物学事件的起始、调节和终止，例如免疫应答、调节细胞信号传导、炎症调节、疼痛传导、凋亡等^［5，6］。由于参与了这些重要过程，各种组织蛋白酶在包括肝病在内的不同疾病中发挥着关键作用^［7］。

先前的研究揭示了几种组织蛋白酶在调控多种肝病中的作用，包括参与非酒精性脂肪性肝病的脂质代谢与自噬，肝纤维化的发生、发展和消退，肝细胞癌的自噬、凋亡、侵袭和转移以及作为肝细胞癌的预后标志物等^［7］。然而，只有有限数量的观察性研究和临床试验调查了组织蛋白酶与酒精性肝病之间的关联。有研究表明，组织蛋白酶A在酒精性肝病中参与细胞质质量控制和减轻氧化应激损伤^［8］。此外，组织蛋白酶S在酒精活化的小鼠肝星状细胞和人肝星状细胞中均被上调^［9］，可能作为酒精性肝病抗纤维化治疗的靶点，但这些基因在酒精诱导的肝纤维化和酒精性肝病患者临床前模型中的生理作用仍有待确定。组织蛋白酶V，又称组织蛋白酶L2，由于其表达和/或其活性的失调可能有助于多种疾病的进展^［10］。最近的研究报道了酒精性肝病患者中组织蛋白酶B升高^［11］。各种类型的组织蛋白酶与酒精性肝病风险之间的因果关系尚未得到充分研究。因此，有必要进一步研究以阐明不同类型的组织蛋白酶与酒精性肝病之间的因果关系。

随着基因组学的发展，越来越多的证据揭示了遗传在疾病病因学中的作用^［12］。孟德尔随机化（Mendelian randomization， MR）依赖于全基因组关联研究（genome‑wide association studies，GWAS），利用一个或多个遗传变异作为工具变量，这些工具变量与暴露密切相关，且不受混杂物的影响。MR可以推断暴露对结局的因果影响^［13］。在此背景下，通过双向双样本MR分析方法，研究了不同类型的组织蛋白酶和酒精性肝病之间风险的因果影响。

1 资料与方法

1.1 研究设计

本研究通过双向双样本孟德尔随机化分析评估了11种组织蛋白酶与酒精性肝病之间的因果关系。MR分析必须满足3个假设。第一，选择作为工具变量的遗传变异必须与作为暴露的组织蛋白酶或酒精性肝病水平显著相关。第二，选择的工具变量必须不受任何混杂因素的影响。第三，工具变量只能通过影响暴露来影响结局，即工具变量对结局无水平多效性效应^［14］。以11种组织蛋白酶为暴露，酒精性肝病为研究结局进行正向MR分析；以酒精性肝病为暴露，11种组织蛋白酶为研究结局进行反向MR分析。

1.2 数据来源

暴露变量及结局数据均来源于IEU OpenGWAS project（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/）数据库。该数据库中组织蛋白酶的数据来源于INTERVAL研究中的血液样本^［15］。本研究基于现有公共数据库，基本信息详见表1。

1.3 工具变量筛选

首先，通过筛选GWAS数据，包含的相关SNPs满足P值小于1×10^-5的阈值^［16］。此外，为了防止SNPs的连锁不平衡影响分析结果^［17］，将参数r阈值设定为0.001，并将SNPs的距离设定为10 000 kb进行分析，选出符合条件的暴露SNPs，整合结局数据库中的暴露相关SNPs，去除回文SNPs序列，以使工具变量对组织蛋白酶与酒精性肝病的影响是来自相同的SNPs。通过计算F值检验工具变量的强度，当F<10时，工具变量和暴露之间的关联较弱^［18］。

1.4 统计学处理

本研究中的MR分析使用TwoSampleMR软件包在R 4.2.2软件中完成。P<0.05为差异具有统计学意义。逆方差加权法（inverse variance weighted，IVW）是不存在水平多效性时获得无偏估计的主要方法^［19］，将其作为主要的MR分析方法，以及其他4种方法辅助分析以评估因果效应。此外，还利用各种敏感性分析来评估结果的有效性。（1）利用Cochran's Q检验来评估SNP的异质性^［20］，以评估IVW方法中工具变量之间的差异程度；当P<0.05时，认为工具变量间存在异质性。（2）使用MR‑Egger检测水平多效性^［21］。MR Egger方法的一个关键特征是它允许截距不等于零，截距的估计值可以被用于判断水平多重性是否存在。如果截距显著偏离零，这可能表明存在水平多效性；相反，如果截距接近零，这表明工具变量之间没有显著的偏差，或水平多效性不明显。（3）使用留一法敏感性分析（leave‑one‑out sensitivity analysis）逐一排除每个SNP，再基于剩余的SNP重新进行MR结果计算。如果剔除后的MR结果与完整的MR结果没有较大差异，说明MR结果是稳健的^［22］。

2 结果

2.1 工具变量

所得工具变量的F值的区间为19.51~1 098.28，F值均大于10，表明所选工具变量的稳健性，不存在弱工具变量。

2.2 双样本孟德尔随机化结果

组织蛋白酶为暴露，酒精性肝病为结局：各组织蛋白酶筛选出的SNP数量见表2，以IVW法作为主要统计方法，其中组织蛋白酶V的P<0.05，其余组织蛋白酶P>0.05。以组织蛋白酶V为暴露的5种孟德尔随机化分析的结果，见表3。森林图（图1）展示了组织蛋白酶V对酒精性肝病的影响。散点图（图2）展示了5种孟德尔随机化分析方法得到的因果效应方向。漏斗图（图3）肉眼可见SNP大致对称分布即无明显异质性。使用留一法（图4）进行的敏感性分析，可见没有离群SNP或影响结果的SNP。表明组织蛋白酶V增多对酒精性肝病具有保护作用。

酒精性肝病为暴露，组织蛋白酶为结局：筛选到的SNP数量见表4，以IVW法作为主要统计方法，组织蛋白酶B为结局时，P<0.05，其余结局P>0.05。森林图（图5）展示了酒精性肝病对组织蛋白酶B的影响。散点图（图6），展示了5种孟德尔随机化分析方法得到的因果效应方向。漏斗图（图7），肉眼可见SNP大致对称分布即无明显异质性。使用留一法（图8）进行的敏感性分析，可见没有离群SNP或影响结果的SNP，提示酒精性肝病的发展会导致组织蛋白酶B的增多。

2.3 异质性和多效性

MR正向和反向分析的阳性结果，组织蛋白酶V和酒精性肝病分别作为暴露时的异质性和多效性见表5。使用IVW和MR‑Egger方法进行Cochran's Q检验，结果显示SNP间不存在异质性。同时，MR‑Egger方法的截距接近零，表明工具变量之间没有显著的水平多效性。

3 讨论

酒精性肝病的发生、发展是一个复杂过程，蛋白水解事件在其中起着重要作用^{［23‑25］}。在与这些活动有关的重要成员中，组织蛋白酶引起了人们极大的兴趣。本研究中，使用遗传工具系统地分析了11种不同的组织蛋白酶与酒精性肝病风险之间的因果关系。

基于单变量分析的结果，笔者认为组织蛋白酶V可能对酒精性肝病具有保护作用，并且没有发现组织蛋白酶V与酒精性肝病的反向因果关系。组织蛋白酶V属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶，由于其独特的内肽酶活性，在人体内起着重要的作用，控制着体内平衡和病理过程^［26］。研究表明，组织蛋白酶V水平可通过牙龈卟啉单胞菌的刺激增加^［27］。组织蛋白酶V的上调促进双特异性磷酸酶6和双特异性磷酸酶7的降解、细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2的磷酸化和随后的核易位、信号转导与转录激活因子（STAT）1的磷酸化以及白细胞介素（IL）‑6、IL‑8和肿瘤坏死因子（TNF）‑α的表达^［28］。双特异性磷酸酶对ERK的失活表现出相当广泛的特异性^［29］。ERK1/2参与细胞黏附、细胞周期进程、细胞迁移、细胞存活、分化、代谢、增殖和转录等生物学过程。双特异性磷酸酶的降解进一步增强了ERK1/2对酒精性肝病的保护作用^［30］。IL‑6是一种保肝细胞因子，改善急性期酒精性肝损伤。在肝脏中，已显示IL‑6在诱导急性期反应、肝再生、肝保护等方面发挥重要作用。IL‑6可激活下游的STAT3，STAT3作为一种重要的细胞存活信号传导分子，已在非酒精性脂肪性肝病中被证实具有保护肝细胞免受损伤的功能^［31］。然而慢性酒精摄入会抑制肝脏中的STAT3活化，并且在酒精性肝病进展的过程中逐渐丧失保护作用^［32］。同时，IL‑6也能够激活下游的STAT1^［33］。研究表明，利匹韦林（Rilpivirine）可以通过STAT1介导肝星状细胞凋亡，从而减轻肝纤维化的程度^［34］。然而，也有研究表明，STAT1的表达升高与谷丙转氨酶水平呈正相关，表明其可促进酒精性肝病的进展^［35］。STAT1在酒精性肝病中的作用还需要更多的研究来定论。这些途径表明组织蛋白酶V可能在酒精性肝病中发挥着预防损伤的保护性作用。而炎性细胞因子IL‑8和TNF‑α会加重酒精性肝损伤^［36］。TNF‑α可以通过应激活化蛋白激酶的激活来增加组织蛋白酶V活性^［37］。这些研究表明，组织蛋白酶V对酒精性肝病多种调控的保护作用远大于损伤作用。因此，组织蛋白酶V表现出对酒精性肝病的保护作用。此外，研究表明，高水平的组织蛋白酶V参与先天免疫反应^［38］，具有免疫保护特性^［39］。酒精性肝病的发病机制主要与氧化应激、肠道微生物、遗传变异、自噬以及microRNA有关^［1］。长期饮酒可导致肠内毒素蓄积和肠壁通透性增加，有助于内毒素以脂多糖的形式从肠道转移至肝脏，脂多糖对肝细胞具有毒性^［40］。脂多糖是革兰氏阴性菌的细胞表面成分，可激活先天免疫^［41］，宿主免疫细胞可以识别脂多糖并建立防御机制来清除病原微生物^［42］。提示高水平的组织蛋白酶V可能通过参与先天免疫反应来改善酒精性肝病。总而言之，本研究结果表明，组织蛋白酶V对酒精性肝病可能具有保护作用，详细机制有待进一步研究。

此外，反向MR分析的结果表明，酒精性肝病增加了组织蛋白酶B的表达。酒精性肝病作为一种慢性肝脏疾病，组织蛋白酶B在其进展过程中扮演了至关重要的角色。在酒精性肝病的背景下，肝脏组织中的组织蛋白酶B表达明显升高^［43］。这种升高不仅与肝纤维化的进展紧密相关，还进一步促进了肝硬化的形成，甚至可能加剧肝癌的发展。酒精摄入后，通过一系列复杂的机制导致混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）磷酸化，进而促使p‑MLKL转移到溶酶体膜上，诱导溶酶体膜透化（LMP）。这一过程导致组织蛋白酶B从溶酶体中泄漏出来，介导了NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎性小体的激活，从而在酒精性肝病中加剧了炎症反应和纤维化进程^［44］。值得注意的是，组织蛋白酶B不仅在肝脏组织中发挥作用，还在多种癌症中过表达，包括肝癌、结直肠癌、胰腺癌等^{［45‑47］}。在肝癌细胞中，组织蛋白酶B的上调促进了细胞的迁移和侵袭能力，介导了肝癌的侵袭表型^［48］。此外，组织蛋白酶B的高表达还与肝癌患者的不良预后密切相关，包括生存期缩短和肿瘤复发等^［49］。在酒精性肝病导致的肝纤维化过程中，组织蛋白酶B通过调节NLRP3炎性小体的激活，进一步激活了肝星状细胞。肝星状细胞的激活是肝纤维化过程中的关键步骤，它促进了细胞外基质的产生和沉积，从而加剧了纤维化的进展^［50］。此外，组织蛋白酶B还参与了溶酶体的稳定性和DNA损伤的调控，进一步增加了酒精性肝病的复杂性^［51］。总而言之，组织蛋白酶B在酒精性肝病的发展过程中起着至关重要的作用，它不仅促进了肝纤维化和肝硬化的形成，还与肝癌的发生和发展密切相关。因此，组织蛋白酶B的高表达可能预示着酒精性肝病的进展，针对组织蛋白酶B的干预策略可能为酒精性肝病的治疗提供新的思路和方法^［52］。

已有研究探索了组织蛋白酶A与酒精性肝病可能的相关机制，但本MR研究结果未发现基因介导的组织蛋白酶A水平与酒精性肝病之间的关联。现有的横断面、观察性研究可能受到环境混杂因素的影响。MR研究补充了传统的基于随机对照试验的因果推断，得出组织蛋白酶A与酒精性肝病无因果作用的更明确的证据。此外，研究表明组织蛋白酶S在酒精活化的人肝星状细胞和小鼠肝星状细胞中上调，但MR分析结果同样没有发现组织蛋白酶S水平与酒精性肝病之间的关联。因此，MR分析结果表明基因决定的组织蛋白酶A和组织蛋白酶S的水平变化与酒精性肝病风险之间不存在因果关系，组织蛋白酶在酒精性肝病中的作用机制变得更加复杂，需要进一步的研究来阐明组织蛋白酶在酒精性肝病中的作用。

目前为止，除了戒酒之外，尚无一种特效药物可以有效治疗酒精性肝病。但本研究借助MR分析，利用遗传变异作为工具，深入探索了不同组织蛋白酶对酒精性肝病的潜在因果效应。通过实施反向MR分析，有效地降低了反向因果偏差的影响，从而获得了更为可靠的结果，并增强了最终的因果推断力度。这一分析策略为寻找和研究有效的酒精性肝病治疗靶点提供了有力工具。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，在筛选工具变量时，采用P<1×10^-5的P值标准，这可能导致所选工具变量的相关性不够强，尽管它们有助于更全面地评估组织蛋白酶与酒精性肝病之间的相关性。其次，本研究的数据来源于欧洲人群相关的GWAS数据库，相较于庞大的GWAS数据库，本研究中的样本量偏小，并且研究中的所有暴露和结局变量都局限于欧洲血统的个体。这是一个明显的局限性，虽然欧洲人群内部也存在一定的基因多样性，但这种限制可能导致研究结果不能推广到其他族群。不同族群在遗传背景、生活方式、环境因素等方面存在差异，这些因素可能影响组织蛋白酶与酒精性肝病的关系。最后，尽管通过Q检验和Egger截距验证了异质性和水平多效性在统计学上可消除，但在临床环境中，这种保证并不能完全排除异质性和水平多效性的存在。

此外，MR分析组织蛋白酶V对酒精性肝病影响的结果表明，MR Egger和IVW法结果的OR值方向不一致。这并不意味着MR分析本身失去了意义。相反，这种不一致性提供了进一步探究和验证的机会。孟德尔随机化的5种分析方法中，以IVW法为主要分析方法，其余4种为辅助评估，其中加权中位数法、加权模式、简单模式的结果，均与IVW法方向一致，支持组织蛋白酶V对酒精性肝病的保护作用。本研究还进行了敏感性分析，以评估结果对潜在偏差和违反基本假设的稳健性。使用IVW和MR‑Egger方法进行Cochran's Q检验，结果显示P值均大于0.05，表明在当前显著性水平下，SNPs间不存在异质性。同时，MR‑Egger方法的截距接近零，表明工具变量之间没有明显的水平多效性。这进一步说明SNPs不存在异质性和水平多效性，表明了数据的稳健性。

组织蛋白酶V对酒精性肝病的影响还需要进一步探究。在酒精性肝病的研究中，组织蛋白酶V扮演着双重角色，其与先天免疫反应、酒精性肝病和癌症之间的复杂关系值得深入探讨。从酒精性肝病的发展进程来看，酒精性脂肪性肝病、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化，以及最终可能导致的肝癌，是一个拥有不同阶段且复杂的过程。在这一过程中，持续的肝脏损伤和炎症反应往往促进了癌症的形成，其中组织蛋白酶V和先天免疫反应起到了重要作用。本研究表明，组织蛋白酶V对酒精性肝病表现出一定的保护作用，同时，也可能存在一些损伤作用。除了对酒精性肝病的保护作用，组织蛋白酶V还显示出对其他系统疾病的保护作用，有研究表明，组织蛋白酶V表达的降低可导致系统性硬化症中皮肤纤维化的发展^［53］，表明了组织蛋白酶V改善纤维化的作用，这可能提示组织蛋白酶V对改善酒精性肝病的纤维化阶段也具有一定的保护作用。此外，组织蛋白酶V的高表达还与肝癌相关。体外和体内实验表明，组织蛋白酶V的高表达与癌组织中巨噬细胞浸润相关，预示不良预后，与肝细胞癌治疗的有效性相关，并且与患者总生存率降低之间存在显着关联^{［54，55］}。此外，组织蛋白酶V还可通过参与先天免疫反应来改善酒精性肝病，而先天免疫反应与癌症之间存在着复杂的联系。研究表明，先天免疫反应在癌症的预防和早期清除中起着重要作用^［56］。然而，近年来的研究表明，某些先天免疫细胞在特定条件下可能会促进肿瘤的生长和转移^［57］。即组织蛋白酶V可能通过参与先天免疫反应来改善酒精性肝病，但高表达时却与肝癌及其不良预后相关，这提示在不同的疾病阶段或病理条件下，组织蛋白酶V的功能可能发生变化。此外，GWAS数据库将酒精性肝病的多个阶段的汇总数据仅统一归类为酒精性肝病，这可能是导致MR Egger和IVW法结果矛盾的主要原因。组织蛋白酶V对纤维化具有保护作用，而在肝癌中则与不良预后有关，因此，笔者猜测，当酒精性肝病的纤维化进展到一定程度，到肝硬化、肝癌等不可逆阶段，组织蛋白酶V的调控方式可能发生改变，表现出明显的损伤作用。简而言之，组织蛋白酶V在酒精性肝病的调控中呈现出复杂的作用，其可能表现出相反的调控作用。本研究结果表明组织蛋白酶V对酒精性肝病可能具有保护作用，其可能是保护作用大于损伤作用表现出的总效应，但这种调控作用不是一成不变的，可能随着酒精性肝病的进展而改变。虽然MR Egger和IVW法的OR值方向不一致可能带来一定的挑战和困惑，但这并不妨碍利用MR分析来探索遗传变异与组织蛋白酶V及酒精性肝病之间的因果关系。研究人员需要通过综合多种方法和证据进行综合分析，以及更全面的GWAS数据库，以阐明组织蛋白酶V与酒精性肝病的关联及其影响机制。

总之，这项研究的初步遗传学证据表明，高水平的组织蛋白酶V可能降低酒精性肝病的风险。此外，酒精性肝病的存在可增加组织蛋白酶B的表达。这一发现可能有助于识别生化标志物，为酒精性肝病的治疗提供新的靶点。

作者贡献度说明：

杨驰：设计实验，撰写文章；杨宏民：数据采集，统计分析，作图；吴涛：研究指导，论文审阅，经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Danpanichkul P， Díaz LA， Suparan K， et al. Global epidemiology of alcohol‑related liver disease， liver cancer， and alcohol use disorder， 2000‑2021［J］. Clin Mol Hepatol， 2025， 31（2）：525‑547.

[2] Liu SY， Tsai IT， Hsu YC. Alcohol‑related liver disease： Basic mechanisms and clinical perspectives［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22（10）： 5170.

[3] Martini T， Naef F， Tchorz JS. Spatiotemporal metabolic liver zonation and consequences on pathophysiology［J］. Annu Rev Pathol， 2023， 18： 439‑466.

[4] Drobny A， Boros FA， Balta D， et al. Reciprocal effects of alpha‑synuclein aggregation and lysosomal homeostasis in synucleinopathy models［J］. Transl Neurodegener， 2023， 12（1）：31.

[5] Smyth P， Sasiwachirangkul J， Williams R， et al. Cathepsin S （CTSS） activity in health and disease‑A treasure trove of untapped clinical potential［J］. Mol Aspects Med， 2022， 88： 101106.

[6] Shao Z， Gao H， Han Q， et al. Genetic insights into serum cathepsins as diagnostic and therapeutic targets in knee and hip osteoarthritis［J］. Sci Rep， 2024， 14（1）： 17553.

[7] Ruiz‑Blázquez P， Pistorio V， Fernández‑Fernández M， et al. The multifaceted role of cathepsins in liver disease［J］. J Hepatol， 2021， 75（5）： 1192‑1202.

[8] You Y， Li WZ， Zhang S， et al. SNX10 mediates alcohol‑induced liver injury and steatosis by regulating the activation of chaperone‑mediated autophagy［J］. J Hepatol， 2018， 69（1）： 129‑141.

[9] Liu X， Rosenthal SB， Meshgin N， et al. Primary alcohol‑activated human and mouse hepatic stellate cells share similarities in gene‑expression profiles［J］. Hepatol Commun， 2020， 4（4）： 606‑626.

[10] Lecaille F， Chazeirat T， Saidi A， et al. Cathepsin V： Molecular characteristics and significance in health and disease［J］. Mol Aspects Med， 2022， 88： 101086.

[11] Maccioni L， Loriot A， Dewulf J， et al. Duodenal CD8+ T resident memory cell apoptosis contributes to gut barrier dysfunction and microbial translocation in early alcohol‑associated liver disease in humans［J］. Aliment Pharmacol Ther， 2022， 56（6）： 1055‑1070.

[12] Farbehi N， Neavin DR， Cuomo ASE， et al. Integrating population genetics， stem cell biology and cellular genomics to study complex human diseases［J］. Nat Gene， 2024， 56（5）： 758‑766.

[13] Burgess S， Davey Smith G， Davies NM， et al. Guidelines for performing Mendelian randomization investigations： Update for summer 2023［J］. Wellcome Open Res， 2023， 4： 186.

[14] Levin MG， Burgess S. Mendelian randomization as a tool for cardiovascular research： A review［J］. JAMA Cardiol， 2024，9（1）： 79‑89.

[15] King AJ， Hanssen L， Eyre T， et al. Lessons from the INTERVAL study［J］. Lancet， 2018， 391（10140）： 2605‑2606.

[16] Li W， Xu JW， Chai JL， et al. Complex causal association between genetically predicted 731 immunocyte phenotype and osteonecrosis： A bidirectional two‑sample mendelian randomization analysis［J］. Int J Surg， 2024， 110（6）： 3285‑3293.

[17] Zanoaga MD， Friligkou E， He J， et al. Brainwide mendelian randomization study of anxiety disorders and symptoms［J］. Biol Psychiatry， 2024， 95（8）： 810‑817.

[18] Liyanarachi KV， Flatby H， Hallan S， et al. Uromodulin and risk of upper urinary tract infections： A Mendelian randomization study［J］. Am J Kidney Dis， 2025，85（5）：570‑576.

[19] Kintu C， Soremekun O， Kamiza AB， et al. The causal effects of lipid traits on kidney function in Africans： Bidirectional and multivariable Mendelian‑randomization study［J］. EBioMedicine， 2023， 90： 104537.

[20] Chen Z， Chen Z， Jin X. Mendelian randomization supports causality between overweight status and accelerated aging［J］. Aging Cell， 2023， 22（8）： e13899.

[21] Yin KJ， Huang JX， Wang P， et al. No genetic causal association between periodontitis and arthritis： A bidirectional two‑sample mendelian randomization analysis［J］. Front Immunol， 2022， 13： 808832.

[22] Xiao G， He Q， Liu L， et al. Causality of genetically determined metabolites on anxiety disorders： A two‑sample Mendelian randomization study［J］. J Transl Med， 2022， 20（1）： 475.

[23] Martín González C， Fernández Rodríguez CM， Abreu González P， et al. Sclerostin in excessive drinkers： Relationships with liver function and body composition［J］. Nutrients， 2022， 14（13）： 2574.

[24] Martín‑González C， Pérez‑Hernández O， García‐Rod‐ríguez A， et al. Serum myostatin among excessive drinkers［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（3）： 2981.

[25] Martín‑González C， Fernández‑Alonso P， Pérez‐Her‐nández O， et al. Sarcopenic obesity in people with alcoholic use disorder： Relation with inflammation， vascular risk factors and serum vitamin D levels［J］. Int J Mol Sci， 2023， 24（12）： 9976.

[26] Zhu L， Zeng Q， Wang J， et al. Cathepsin V drives lung cancer progression by shaping the immunosuppressive environment and adhesion molecules cleavage［J］. Aging （Albany NY）， 2023， 15（23）： 13961‑13979.

[27] Shin SW， Hwang YS. Anti‑periodontitis effect of ethanol extracts of Alpinia Katsumadai seeds［J］. Nutrients， 2021， 14（1）： 136.

[28] Leng YP， Ma YS， Li XG， et al. l‑Homocysteine‐induced cathepsin V mediates the vascular endothelial inflammation in hyperhomocysteinaemia［J］. Br J Pharmacol， 2018， 175（8）： 1157‑1172.

[29] Das D， Seemann J， Greenstein D， et al. Reevaluation of the role of LIP‑1 as an ERK/MPK‑1 dual specificity phosphatase in the C. elegans germline［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2022， 119（3）： e2113649119.

[30] Patil NY， Rus I， Joshi AD. Role of ERK1/2 signaling in Cinnabarinic acid‑driven Stanniocalcin 2‑mediated protection against alcohol‑induced apoptosis［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2023， 387（1）： 111‑120.

[31] Park J， Zhao Y， Zhang F， et al. IL‑6/STAT3 axis dictates the PNPLA3‑mediated susceptibility to non‐alcoholic fatty liver disease［J］. J Hepatol， 2023， 78（1）： 45‑56.

[32] Das S， Ge X， Han H， et al. The integrated "Multiomics" landscape at peak injury and resolution from alcohol‑associated liver disease［J］. Hepatol Commun， 2022， 6（1）： 133‑160.

[33] Ploeger C， Schreck J， Huth T， et al. STAT1 and STAT3 exhibit a crosstalk and are associated with increased inflammation in hepatocellular carcinoma［J］. Cancers （Basel）， 2022， 14（5）： 1154.

[34] Martí‑Rodrigo A， Alegre F， Moragrega ÁB， et al. Rilpivirine attenuates liver fibrosis through selective STAT1‑mediated apoptosis in hepatic stellate cells［J］. Gut， 2020， 69（5）： 920‑932.

[35] Dy H， Yu H， Zhou M， et al. The effect of STAT1， miR‑99b， and MAP2K1 in alcoholic liver disease （ALD） mouse model and hepatocyte［J］. Aging （Albany NY）， 2024， 16（5）： 4224‑4235.

[36] Fernández‑Regueras M， Carbonell C， Salete‑Granado D， et al. Predominantly pro‑inflammatory phenotype with mixed M1/M2 polarization of peripheral blood classical monocytes and monocyte‑derived macrophages among patients with excessive ethanol intake［J］. Antioxidants （Basel）， 2023， 12（9）： 1708.

[37] Keegan PM， Wilder CL， Platt MO. Tumor necrosis factor alpha stimulates cathepsin K and V activity via juxtacrine monocyte‑endothelial cell signaling and JNK activation［J］. Mol Cell Biochem， 2012， 367（1‑2）： 65‑72.

[38] Xie J， Sun Y， Li Y， et al. TMT‑based proteomics analysis of growth advantage of triploid Apostichopus japonicus ［J］. Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics， 2023， 45： 101043.

[39] Villa‑Mancera A， Maldonado‑Hidalgo J， Robles‑Robles M， et al. Evaluation of reproductive histology response of adult Fasciola hepatica in goats vaccinated with cathepsin L phage‑exposed mimotopes［J］. Int J Mol Sci， 2024， 25（13）： 7225.

[40] Kong LZ， Chandimali N， Han YH， et al. Pathogenesis， early diagnosis， and therapeutic management of alcoholic liver disease［J］. Int J Mol Sci， 2019， 20（11）： 2712.

[41] Yamaura H， Shimoyama A， Hosomi K， et al. Chemical synthesis of Acetobacter pasteurianus lipid A with a unique tetrasaccharide backbone and evaluation of its immunological functions［J］. Angew Chem Int Ed Engl， 2024， 6： e202402922.

[42] Ma Z， Zuo T， Frey N， et al. A systematic framework for understanding the microbiome in human health and disease： From basic principles to clinical translation［J］. Signal Transduct Target Ther， 2024， 9（1）： 237.

[43] Zanelatto ACO， Lacerda GS， Accardo CM， et al. Cathepsin B and plasma kallikrein are reliable biomarkers to discriminate clinically significant hepatic fibrosis in patients with chronic hepatitis‑C infection［J］. Microorganisms， 2022， 10（9）： 1769.

[44] Jin Y， Wang C， Meng Z， et al. Proanthocyanidins alleviate acute alcohol liver injury by inhibiting pyroptosis via inhibiting the ROS‑MLKL‑CTSB‑NLRP3 pathway［J］. Phytomedicine， 2024， 136： 156268.

[45] Xu LB， Qin YF， Su L， et al. Cathepsin‑facilitated invasion of BMI1‑high hepatocellular carcinoma cells drives bile duct tumor thrombi formation［J］. Nat Commun， 2023， 14（1）： 7033.

[46] Yang H， Yue GG， Leung PC， et al. Anti‑metastatic effects of 1，2，3，4，6‑Penta‑O‑galloyl‑β‑D‑glucose in colorectal cancer： Regulation of cathepsin B‑mediated extracellular matrix dynamics and epithelial‑to‑mesenchymal transition［J］. Pharmacol Res， 2022， 184： 106457.

[47] Huang X， Deng H， Zhang B， et al. The causal relationship between cathepsins and digestive system tumors： A Mendelian randomization study［J］. Front Oncol， 2024， 14： 1365138.

[48] Wang SJ， Chao D， Wei W， et al. Correction： CD147 promotes collective invasion through cathepsin B in hepatocellular carcinoma［J］. J Exp Clin Cancer Res， 2024， 43（1）： 320.

[49] Ruan J， Zheng H， Rong X， et al. Over‑expression of cathepsin B in hepatocellular carcinomas predicts poor prognosis of HCC patients［J］. Mol Cancer， 2016， 15： 17.

[50] Tao Y， Qiu T， Yao X， et al. Autophagic‐CTSB‐inflammasome axis modulates hepatic stellate cells activation in arsenic‑induced liver fibrosis［J］. Chemosphere， 2020，242： 124959.

[51] Guo Y， Wang S， Dong Y， et al. Attenuation of pro‑tumorigenic senescent secretory phenotype by StN， a novel derivative of stevioside， potentiates its inhibitory activity on hepatocellular carcinoma［J］. Food Chem Toxicol， 2024， 184： 114371.

[52] Xu W， Yi S， Liu J， et al. Nitrile‑aminothiol bioorthogonal near‑infrared fluorogenic probes for ultrasensitive in vivo imaging［J］. Nat Commun， 2025， 16（1）： 8.

[53] Noda S， Asano Y， Takahashi T， et al. Decreased cathepsin V expression due to Fli1 deficiency contributes to the development of dermal fibrosis and proliferative vasculopathy in systemic sclerosis［J］. Rheumatology （Oxford）， 2013， 52（5）： 790‑799.

[54] He Y， Xu M， Zhou C， et al. The prognostic significance of CTSV expression in patients with hepatocellular carcinoma［J］. Int J Gen Med， 2024， 17： 4867‑4881.

[55] Liu J， Zhang W， Wang Z， et al. Cathepsin V is correlated with the prognosis and tumor microenvironment in liver cancer［J］. Mol Carcinog， 2024， 63（3）： 400‑416.

[56] Tan Y， Hu G， Li M， et al. Two‑photon photosensitizer for specific targeting and induction of tumor pyroptosis to elicit systemic immunity‑boosting anti‑tumor therapy［J］. Biomaterials， 2025， 317： 123108.

[57] Tabariès S， Ouellet V， Hsu BE， et al. Granulocytic immune infiltrates are essential for the efficient formation of breast cancer liver metastases［J］. Breast Cancer Res， 2015， 17（1）： 45.

基金资助

国家自然科学基金(82160303)

海南省重点研发计划(ZDYF2021SHFZ050)