基于网络药理学和实验验证分析补阳壮通饮治疗缺血性脑卒中的分子机制

Molecular mechanism of Buyang Zhuangtong Yin on treating ischemic stroke based on network pharmacology and experimental verification

摘要

目的 运用网络药理学原理及分子对接技术，并结合动物实验验证，探讨补阳壮通饮（Buyang Zhuangtong Yin，BYZTY）治疗缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）的作用机制。 方法 通过查阅有关文献和TCMSP数据库筛选出扶芳藤、黄芪、大血藤等9味中药的潜在有效成分及其对应的作用靶点，再通过GeneCards、Drugbank、TTD、PharmGKB和OMIM数据库查找IS有关的疾病靶点；随后，利用在线工具绘制BYZTY作用靶点与IS疾病相关靶点之间的韦恩图，即可得到交集靶点，将这些靶点输入STRING数据库中，从而得到蛋白互作网络图；再将数据导入Cytoscape 3.10.2软件中，利用CytoNCA插件来筛选关键靶点，并且绘制出“药物‑有效成分‑作用靶点”网络关系图；从DAVID数据库中获得靶点的富集分析情况；此外，通过AutoDock tools软件将关键靶点与其对应的有效成分进行分子对接；最后，利用大鼠进行体内实验，构建大脑中动脉栓塞模型，给予BYZTY药物治疗2周后取材；采用神经功能缺损评分、TTC染色、脑组织病理染色、Western blot、ELISA等方法进行验证分析其作用机制。 结果 共获得145个交集靶点，依据Degree值，筛选出TNF、IL‑6、IL‑1β作为关键靶点；富集分析得到327个GO条目，131个KEGG条目；关键靶点与其对应的有效成分之间的结合活性较强，结合较为稳固。动物实验结果显示，与模型组相比，BYZTY高剂量组对降低神经功能缺损评分的作用较为明显；并且可以有效减小脑组织梗死体积；减轻缺血半暗带部位的病理损伤；降低血浆中炎症因子的含量，以及脑组织中TNF‑α、IL‑6、IL‑1β蛋白的表达。 结论 BYZTY可能通过作用于TNF‑α、IL‑6、IL‑1β靶点，从而减轻人体炎症反应，达到治疗IS的效果。

Abstract

Objective To discover the mechanism of action of Buyang Zhuangtong Yin （BYZTY） in the treatment of ischemic stroke （IS） by applying the principles of network pharmacology， molecular docking technology， and animal experiments. Methods The potential active ingredients and their corresponding targets of 9 herbs， including Fufangteng， Huangqi， Daxueteng and others were screened by reviewing the relevant literatures and the TCMSP database， and then GeneCards， Drugbank， TTD， PharmGKB， and OMIM databases were utilized to find the related targets of IS. Afterwards， an online tool was used to draw a Venn diagram between the targets of BYZTY and the targets related to IS diseases to obtain the intersection targets， and these targets were entered into the STRING database to obtain the protein‑protein interaction network diagram. Then the data were imported into the Cytoscape 3.10.2 software， the CytoNCA plug‑in was used to screen the key targets and draw the network relationship diagram of "drug‑active ingredient‑target". The target enrichment analysis was obtained from the DAVID database. In addition， by using AutoDock tools software， the key targets were molecularly docked with their corresponding active ingredients. Finally， in vivo experiments were conducted using rats to construct a middle cerebral artery occlusion model， which was taken after 2 weeks of drug treatment with BYZTY and its mechanism of action was verified and analyzed by using the Neurological deficit score， TTC staining， brain histopathological staining， Western blot， ELISA and other methods. Results A total of 145 intersecting targets were obtained. Based on the Degree value， TNF， IL‑6， and IL‑1β were screened as the key targets. A total of 327 GO entries and 131 KEGG entries were obtained from the enrichment analyses. The binding activities between the key targets and their corresponding active ingredients were strong， and the binding was solid. The results of animal experiments showed that， compared to the model group， the BYZTY high‑dose group had a more significant effect on reducing the score of neurological deficits. And it could effectively reduce the volume of infarction in brain tissue， the pathological damage in the ischemic penumbra， the content of inflammatory factors in plasma， and the expression of TNF‑α， IL‑6， and IL‑1β proteins in brain tissue. Conclusion BYZTY may be effective in treating IS by acting on the targets of TNF‑α， IL‑6， and IL‑1β， thereby reducing the inflammatory response of the body.

Graphical abstract

关键词

补阳壮通饮 / 缺血性脑卒中 / 网络药理学 / 分子对接 / 动物实验

Key words

Buyang Zhuangtong Yin / Ischemic stroke / Network pharmacology / Molecular docking / Animal experiments

脑卒中，中医上常被称为脑中风，主要分为2种：出血性脑卒中和缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS），有数据统计，其中IS约占80%^［1］。在世界范围内，IS是一种严重疾病，可以导致患者残疾甚至死亡^［2，3］。IS在临床中属于常见疾病，一旦发病，会对人体产生不同程度的神经功能损伤；目前在临床治疗中，主要通过溶栓治疗^［4］以及神经保护治疗^［5］来减轻病症，但是治疗方法受限，且治疗药物有限。中药复方可以从多成分、多靶点、多通路出发^［6］，相互作用从而达到协同调控治疗IS的作用。

补阳壮通饮（Buyang Zhuangtong Yin，BYZTY）是由广西民间壮医药方“壮通饮”^［7］发展而来，本方具有益气活血通络的功效，专治麻邦阴证（气虚血瘀证）。目前，对BYZTY治疗IS的作用机制研究较少。王亚南等^［8］发现BYZTY可能通过作用于Nrf2/HO‑1介导的抗氧化应激通路，减轻大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠的神经损伤。本研究在网络药理学和分子对接的基础上，探讨BYZTY对IS的潜在治疗机制，并且通过动物实验进一步验证其机制，为BYZTY的临床应用提供新方法和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠，体重230 g，年龄在6周左右，购买于广东维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（粤）2022‑0063。饲养于右江民族医学院动物房SPF级实验室，环境温度24 ℃，湿度55%，12 h光照/12 h黑暗，自由摄食、摄水。本实验严格遵守实验动物福利伦理准则（文件编号：2023111703）。

1.1.2 主要试剂与仪器

BYZTY：扶芳藤20 g、黄芪20 g、黄花倒水莲15 g、参三七10 g、地龙（堵黏）10 g、大血藤10 g、走马胎10 g、大叶千斤拔10 g、水菖蒲10 g（百色市中阳药店），在右江民族医学院药学院实验室自行煎煮浓缩至1 g/mL；尼莫地平片（亚宝药业，批号：H14022821）；TTC染液（雷根生物，货号：DK0005）；H&E染液（索莱宝，货号：G1121）；尼氏染液（碧云天，货号：C0117）；β‑actin（华安生物，货号：M1210‑2）；TNF‑α抗体（正能生物，货号：346654）；IL‑6抗体（正能生物，货号：500286）；IL‑1β抗体（Cell Signaling Technology，货号：12703S）；TNF‑α试剂盒（联科生物，货号：EK382）；IL‑6试剂盒（四正柏生物，货号：CRE0006）；IL‑1β试剂盒（联科生物，货号：EK306）；组织脱水机（Excelsior AS）；石蜡切片机（HM325）；多功能酶标仪（VICTOR NIVO 3F）；正置荧光显微镜（尼康，ECLIPSE CI‑L）；超灵敏多功能成像仪（Amershan Imager 600）。

1.2 方法

1.2.1 IS相关靶点筛选

将“ischemic stroke”“cerebral ischemic stroke”“cerebral arterial thrombosis”关键词输入GeneCards^［9］数据库（https：//www.genecards.org/）、Drugbank^［10］数据库（https：//go.drugbank.com/drugs）、TTD^［11］数据库（https：//db. idrblab.net/ttd/）、PharmGKB^［12］数据库（https：//www.pharmgkb.org/）和OMIM^［13］数据库（https：//www.omim.org/）收集IS的相关靶点。对于GeneCards数据库中的检索结果，剔除“Relevance score”小于10的相关靶点。最后，利用Excel表格进行收集汇总，删除重复靶点，得到IS疾病靶点数据库。

1.2.2 BYZTY有效成分及作用靶点筛选

在TCMSP^［14］数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中检索大血藤、参三七、黄芪3味中药的化学成分，通过口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%以及类药性（drug‑likeness， DL）≥0.18^［15］这2个参数值来筛选出这3味药材的有效成分。其余6味药材未能在TCMSP数据库中检索到相关信息，因此，通过查找有关文献收集化学成分；将获取的化学成分输入HERB数据库（http：//herb.ac.cn/）中，筛选出含有TCMSP id的化学成分，将结果的CAS id输入TCMSP数据库中，按照上述筛选条件获得其余6味中药的有效成分。再通过TCMSP数据库预测这些有效成分的作用靶点。最后，利用Uniprot^［16］数据库（https：//www.uniprot.org/）对上述收集的靶点名称进行规范化处理。

1.2.3 关键靶点筛选及“药物‑有效成分‑作用靶点”网络关系图构建

通过Draw Venn Diagram（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制BYZTY的作用靶点与IS疾病相关靶点之间的韦恩图，即可获得药物与疾病的交集靶点。然后，通过STRING^［17］数据库（https：//string-db.org/）构建交集靶点的蛋白互作（protein‑protein interaction，PPI）网络图。将数据导入Cytoscape 3.10.2软件^［18］中，利用CytoNCA插件，依据度中心性（Degree）对交集靶点进行拓扑分析^［19］，以度值排在前3的作为关键靶点。使用Cytoscape 3.10.2软件，将上述收集得到的9味中药各自对应的有效成分以及其对应的作用靶点等数据绘制成“药物‑有效成分‑作用靶点”网络关系图。

1.2.4 靶点GO富集分析及KEGG富集分析

依据Degree值，从上述获得的交集靶点当中筛选出数值排在前20的靶点，随后，将靶点导入DAVID^［20］数据库（https：//david. ncifcrf. gov/），进行GO富集分析和KEGG富集分析。依据P<0.05，筛选出需要的条目。

1.2.5 分子对接验证

从“药物‑有效成分‑作用靶点”网络关系图中寻找到3个关键靶点对应的小分子配体，然后从PubChem^［21］数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得小分子的2D结构，再利用Chem3D软件将其转换成3D结构。从RCSB PDB^［22］数据库（https：//www.rcsb.org/）中即可获得关键靶点的3D结构，随后将其导入PyMOL软件中，对蛋白进行去除溶剂、有机物等操作。然后，利用AutoDock tools软件^［23］将3个关键靶点与其对应的小分子配体进行对接。最后，利用PyMOL软件^［24］将这些结合能（bindingenergy，kcal/mol）最小的结合模式进行可视化处理。

1.2.6 MCAO大鼠模型制备

大鼠适应性饲养7 d，造模前1 d禁食，正常饮水。采用Zea‑Longa线栓法^［25］的操作步骤建立右侧MCAO大鼠模型，待大鼠清醒后，按照Zea‑Longa 5分法^［26］对其进行神经功能缺损评分。本实验中具体评分细则如下，0分：神经功能正常，无缺损；1分：神经功能轻度缺损，左侧前肢伸展不充分，呈屈曲状态；2分：神经功能中度缺损，左侧前肢出现活动障碍，并且在行走过程中身体往左侧转圈；3分：神经功能重度缺损，行走过程中身体向左侧倾斜，行走较为困难；4分：无意识，丧失自发行走能力。选取1~3分的大鼠进行后续的治疗，剔除0分和4分的大鼠。

1.2.7 实验动物分组及给药

造模前随机取10只大鼠，只分离它们颈部血管，不插入线栓，作为假手术组（sham）；将造模成功后的大鼠随机分成模型组（Model，M）、BYZTY低剂量组（BYZTY‑L，1.35 g/kg）、BYZTY中剂量组（BYZTY‑M，2.7 g/kg）、BYZTY高剂量组（BYZTY‑H，5.4 g/kg）和尼莫地平组（NMDP，20 mg/kg），每组各10只。每天同一时间对大鼠给予对应浓度的药物灌胃1次，连续给药治疗2周。依据大鼠用药量是人类剂量的6.3倍计算得出BYZTY的给药剂量。

1.2.8 神经功能缺损评分

于造模成功后第1、3、7、14天，依据Zea‑Longa 5分法对大鼠进行神经功能缺损评分。

1.2.9 TTC染色

各组大鼠在最后一次给药后2 h内，随机选取3只，麻醉后快速断头取脑，随后立即放入-20 ℃冰箱中20 min，取出大脑，将其放在冰上行冠状位切片，2 mm/片，总共切取5片，完成后把切片转移到2%TTC染液中，用锡纸包裹表面后，将其放入37 ℃恒温箱中孵育30 min，每隔5 min翻动一次脑片确保脑组织染色均匀。拍照后使用ImageJ软件分析结果，计算出脑梗死组织体积占比。

1.2.10 脑组织病理学观察

末次给药后2 h内，从各组大鼠中随机选取4只，麻醉后使用多聚甲醛进行心脏灌注，断头取脑，将脑组织放入4%多聚甲醛中固定24 h，在视交叉处行冠状切片进行脱水处理，随后石蜡包埋进行切片，约5 μm厚，进行H&E和尼氏染色，封片处理后镜下观察脑组织病理变化。

1.2.11 Western blot分析

每组大鼠随机选取3只，麻醉后快速断头取脑，称取缺血半暗带组织60 mg，研磨后于冰上充分裂解30 min，提取组织蛋白，BCA蛋白定量后，按一定比例加入5×loading buffer，置于100 ℃金属浴中5 min，使蛋白充分变性后进行电泳（80 V恒压20 min，120 V恒压60 min），随后使用PVDF膜进行转膜（400 mA恒流40 min），结束后将PVDF膜浸泡在快速封闭液中，放在慢速摇床上封闭30 min。按特定的比例配制一抗（TNF‑α、IL‑6、IL‑1β三者都是1∶1 000，β‑actin 1∶10 000），将其置于4 ℃摇床中孵育过夜；第2天孵育二抗（1∶3 000），于室温条件下，在快速摇床中孵育1 h，进行显影。将图片导入ImageJ软件，计算其灰度值。

1.2.12 炎症因子检测

根据购买的ELISA试剂盒说明书，按照正确的操作步骤，对各组大鼠血浆中的炎症因子（TNF‑α、IL‑6、IL‑1β）含量进行检测。

1.3 统计学处理

使用SPSS 25软件进行分析，随后将数据导入GraphPad Prism 8软件进行作图。计量资料以\overline{x}\pm s表示。使用单因素方差分析的方法来进行多组数据之间的比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BYZTY治疗IS的潜在靶点

通过TCMSP数据库筛选，去重后得到50个BYZTY潜在有效成分，得到404个有效作用靶点；从GeneCards、Drugbank、TTD、PharmGKB、OMIM 5个数据库中共获得1 185个疾病潜在靶点。将404个药物靶点与1 185个疾病靶点取交集，绘制韦恩图，得到145个交集靶点，见图1A。

2.2 关键靶点筛选及PPI网络关系图构建

通过Degree值，将排在前3的靶点筛选出来作为关键靶点，依次是TNF、IL‑6、IL‑1β，见图1B（红色节点即为上述关键靶点），图中靶点圆圈越大，表示其Degree值越大。 “药物‑有效成分‑作用靶点”网络关系图见图2，依据形状和颜色对其三者进行分类，其中蓝色的“V”字形节点代表作用靶点（共145个）、绿色圆形节点代表有效成分（共50个）、红色三角形节点代表药物（共9个）。

2.3 富集分析结果

在DAVID数据库中共得到GO条目327条，包括20个细胞组分（cellular component，CC），266个生物学过程（biological process，BP），41个分子功能 （molecular function，MF），依据每个条目中基因富集的数量进行排序，并且剔除P>0.05的条目，最后分别选取前10个进行作图，见图3A。这些基因主要分布于细胞质以及细胞外空间，参与RNA聚合酶Ⅱ对转录的正调控、DNA模板转录的正调控等BP，参与蛋白质结合、酶结合等MF；富集分析得到131个KEGG条目，筛选出前20条通路进行分析，这些基因主要富集在TNF、IL‑17等信号通路中，见图3B。

2.4 分子对接结果

TNF、IL‑6对应的活性成分是quercetin（槲皮素），IL‑1β对应的是ginsenoside rh2（人参皂苷Rh2），将上述靶点与对应的活性成分进行对接，一般认为结合能越小，关键靶点与活性成分之间的结合能力越强，当结合能<-5 kcal/mol时，表明两者的结合活性较强^［27］。筛选出活性成分中结合能最小的结合位点，见表1。TNF与quercetin之间的结合能为-8.7 kcal/mol，IL‑6与quercetin之间的结合能为-6.9 kcal/mol，IL‑1β与ginsenoside rh2之间的结合能为-7.4 kcal/mol，这些大分子与小分子之间的结合能都<-5 kcal/mol，说明两者之间结合稳固。将表1内容进行对接可视化处理，见图4。

2.5 BYZTY对IS大鼠神经功能缺损评分的影响

sham组大鼠无神经功能损伤，其余组大鼠都出现了不同程度的损伤；造模后第1天评分结果显示，与sham组相比，另外5组大鼠神经功能缺损评分差异具有统计学意义（P<0.05），并且另外5组大鼠之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）；从治疗第3天之后，BYZTY‑H、NMDP组与M组的差异都具有统计学意义（P<0.05），见表2。将结果绘制成折线图，见图5。

2.6 BYZTY对IS大鼠脑梗死体积的影响

经TTC染色后，红色部分是正常脑组织，白色是脑梗死区域，sham组大鼠脑组织没有出现缺血部位，而其他各组大鼠都出现不同程度的缺血部位，见图6A；利用ImageJ软件分析计算出各组大鼠的脑梗死体积占比，将数据进行可视化处理，见图6B，相比于sham组，M组出现了明显的梗死体积（P<0.05）；经过2周的治疗后，相比于M组，BYZTY‑L、M、H和NMDP组脑梗死体积都有所减小（P<0.05），并且BYZTY‑H和NMDP组趋势更加明显。

2.7 BYZTY对IS大鼠脑组织病理变化的影响

H&E染色结果，sham组大鼠脑组织H&E染色未见明显病变，脑组织结构完整，细胞排列有序，细胞核清晰可见；M组细胞排列不规则，大部分细胞核固缩，细胞间隙明显增大，形成较多空泡；与M组相比，BYZTY‑L、M、H组细胞排列逐渐规律化，细胞核固缩数量逐渐减少，NMDP组与BYZTY‑H组之间无明显差异。尼氏染色结果，sham组大部分细胞形态饱满，无明显病理改变，细胞排列整齐，胞核清晰，可见较多的尼氏体；M组细胞排列紊乱，细胞核固缩，导致颜色深染，组织间隙增大，尼氏体数量明显减少，损伤严重；与M组相比，BYZTY‑L、M、H组细胞排列逐渐规律化，细胞核固缩数量逐渐减少，尼氏体数量逐渐增多，脑组织损伤依次减轻，NMDP组与BYZTY‑H组之间无明显差异。见图7。

2.8 BYZTY对IS大鼠脑组织蛋白表达的影响

Western blot结果显示，在IS大鼠脑组织中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α蛋白的表达量明显上升，与sham组相比，这3个蛋白在M组中表达差异具有统计学意义（P<0.05）；与M组相比，BYZTY‑L、M组蛋白，差异无统计学意义（P>0.05）； 与M组相比，BYZTY‑H、NMDP组差异具有统计学意义（P<0.05）。见图8。

2.9 BYZTY对IS大鼠血浆炎症因子的影响

ELISA结果显示，与sham组相比，其余各组大鼠血浆中炎症因子的表达都有不同程度的增高，M组IL‑1β、IL‑6、TNF‑α表达差异具有统计学意义（P<0.05）；与M组相比，BYZTY‑L、M、H和NMDP组炎症因子表达有所下降，差异具有统计学意义（P<0.001），其中BYZTY‑H和NMDP组下降最明显，见图9。

3 讨论

在壮医中，IS又被称为“麻邦”，是由于体内阴阳失调，脏腑失和，情志失调，饮食失节，热毒、湿毒内生，阻碍气机，导致三道两路不通，使三气停滞不调，气血逆乱，血冲“巧坞”，“巧坞”功能失调所致^［28］。BYZTY是治疗中风阴证的经典方剂补阳还五汤和壮医经验方壮通饮的合方。本方专治麻邦阴证（气虚血瘀证），多因中风病后，正气损耗，气虚血滞，导致龙路脉络瘀阻，肌肉筋脉失去濡养，故见半身不遂、口眼喎斜；气虚血瘀，舌本失养，故语言謇涩；气虚失于固摄，故口角流涎、尿失禁等；本方治当以补气为主，活血通路为辅^［29］。

本研究首先通过网络药理学研究，筛选得到145个BYZTY治疗IS的潜在靶点；然后构建了PPI网络图，依据Degree值筛选出TNF、IL‑6、IL‑1β作为关键靶点，富集分析结果显示，这些基因主要分布在细胞质、核质以及细胞外空间，参与调控TNF、IL‑17等信号通路；最后，将这3个关键靶点与其对应的有效成分进行分子对接，结果显示，这些分子之间的结合能都<-5 kcal/mol，表明其结合活性较强，进一步说明BYZTY治疗IS的可行性。

炎症反应在IS的病理生理过程中发挥着重要作用^{［30，31］}，通过减轻炎症损伤，可以有效的改善IS的预后。正常生理状态下，TNF‑α和IL‑1β的含量在外周血中非常低，当机体出现缺血、缺氧时，两者的含量会迅速增加，在一定时间内可以通过多种途径对神经细胞产生损伤^［32］；IL‑6是血清中的一种炎症因子，参与机体的炎症反应过程，其含量的变化与IS患者病情进展以及神经功能损伤密切相关^［33］。

本研究分析网络药理学研究的结果后，初步认为BYZTY可能是通过调控这些炎症因子，从而抑制炎症反应达到治疗IS的作用。随后，动物实验进一步验证其作用机制，发现在治疗第3天开始，BYZTY‑H和NMDP组与M组大鼠神经功能缺损评分比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；相比于M组，BYZTY‑L、M、H和NMDP组脑梗死体积都有所减小（P<0.05），并且减轻了脑组织因缺血再灌注导致的病理损伤，血浆中TNF‑α、IL‑6、IL‑1β的含量也明显下降（P<0.05）；与M组相比，NMDP和BYZTY‑H组大鼠脑组织中TNF‑α、IL‑6、IL‑1β蛋白表达差异具有统计学意义（P<0.05）。不同剂量的BYZTY对IS的治疗效果不同，其中BYZTY‑H治疗IS的效果最佳。

综上所述，本研究通过动物实验验证在网络药理学和分子对接技术中预测的作用机制，最终得出结论，BYZTY可以通过多成分、多靶点之间相互作用，调控体内炎症因子的表达，从而抑制炎症反应，以达到治疗IS的目的。

本研究也存在一定的局限性。第一，虽然动物实验结果验证了BYZTY可以抑制炎症反应对IS产生疗效，但是人体与动物模型之间还存在部分差异，还需要收集获取更多的临床数据来支撑结论。第二，本实验未从信号通路着手验证其机制，因此还需要更多的实验加以验证。

作者贡献度说明：

林富生：实验实施、数据处理和论文撰写；黄龙坚：指导实验以及修改论文；谢福周、黄若男、梁育汝、王凯华、黄建民：查阅文献、收集数据。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82360870)

广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026404)

广西自然科学基金项目(2021GXNSFAA196012)