电针干预对慢性睡眠剥夺大鼠PVT脑区食欲素受体表达的影响

Effect of electroacupuncture on orexin receptor expression in PVT brain region of chronic sleep deprivation rats

摘要

目的 观察电针对慢性睡眠剥夺（chronic sleep deprivation，CSD）大鼠丘脑室旁核（the paraventricular thalamus， PVT）食欲素受体1 （orexin receptor 1， OX1R）和食欲素受体2 （orexin receptor 2，OX2R）的调节作用，分析电针改善慢性睡眠剥夺大鼠的作用机制研究。 方法 采用随机法将48只雄性SD大鼠分为空白组（Control）、模型组（CSD）、电针组（CSD+EA）、假针刺组（CSD+SA）共4组，每组12只大鼠。选用改良的多平台水环境法（modified multi‑platform method，MMPM）构建CSD大鼠模型。电针组选用“百会”“神门”“内关”“太冲”进行14 d的电针干预。采用脑电肌电检测技术观察大鼠的睡眠差异，实时荧光定量、蛋白免疫印记检测大鼠PVT脑区OX1R、OX2R mRNA及蛋白的表达水平。 结果 CSD 模型组大鼠觉醒期（WAKE期）时间显著增加，非快速眼动睡眠期（NREM期）、快速眼动睡眠期（REM期）累计时间减少（P<0.001，P<0.01），PVT内OX1R的mRNA转录水平和蛋白表达量均呈显著升高趋势（P<0.01，P<0.001）；电针治疗后CSD大鼠的睡眠‑觉醒平衡得以恢复，WAKE期累计时间显著减少，且NREM期、REM期和总睡眠时间均显著延长（P<0.001，P<0.01），降低PVT中OX1R在mRNA和蛋白水平的表达（P<0.01，P<0.001）。假针刺组与模型组比较，PVT中OX1R、OX2R的表达无显著差异（P>0.05）。 结论 电针可有效调节CSD大鼠睡眠觉醒节律及焦虑状态，其机制可能与抑制CSD大鼠PVT脑区食欲素受体表达有关。

Abstract

Objective To observe the regulatory effects of electroacupuncture on orexin receptor 1 （OX1R） and orexin receptor 2 （OX2R） in the paraventricular thalamus （PVT） of rats with chronic sleep deprivation （CSD）， and to analyze the mechanism by which electroacupuncture improves CSD rats. Methods A total of 48 male SD rats were randomly divided into four groups using the random number method： the blank group （Control）， the model group （CSD）， the electroacupuncture group （CSD+EA）， and the sham acupuncture group （CSD+SA） with 12 rats in each group. The modified multi‑platform method （MMPM） was employed to establish the CSD rat model. In the electroacupuncture group， electroacupuncture interventions were carried out at “Baihui” （GV20）， “Shenmen” （HT7）， “Neiguan” （PC6）， and “Taichong” （LR3） for 14 days. The electroencephalogram （EEG） and electromyogram （EMG） detection techniques were utilized to observe the sleep differences among the rats. Real‑time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （qPCR） and Western blot assays were used to detect the expression levels of OX1R and OX2R mRNA and proteins in the PVT brain region of the rats. Results In the CSD model group， the time during the wakefulness period （WAKE period） of the rats was significantly increased， while the cumulative times during the non‑rapid eye movement sleep period （NREM period） and the rapid eye movement sleep period （REM period） were decreased （P<0.001，P<0.01）. The mRNA transcription level and protein expression level of OX1R in the PVT both exhibited a significant upward trend （P<0.01，P<0.001）. After electroacupuncture treatment， the sleep‑wakefulness balance of the CSD rats was restored. The cumulative time during the WAKE period was significantly reduced， and the NREM period， REM period， and total sleep time were all significantly prolonged （P<0.001，P<0.01）. The expression of OX1R at the mRNA and protein levels in the PVT was decreased （P<0.01，P<0.001）. There was no significant difference in the expression of OX1R and OX2R in the PVT between the sham acupuncture group and the model group （P>0.05）. Conclusion Electroacupuncture can effectively regulate the sleep‑wake rhythm and anxiety state of CSD rats， and its mechanism may be related to the inhibition of the expression of orexin receptors in the PVT brain region of CSD rats.

Graphical abstract

关键词

电针 / 慢性睡眠剥夺 / 脑电 / 丘脑室旁核 / 食欲素受体

Key words

Electroacupuncture / Chronic sleep deprivation / Electroencephalography / Paraventricular nucleus of the thalamus / Orexin receptors

随着工作和生活压力的日益增大，失眠人群随之激增，据流行病学数据显示，全球约有30%的人口受到失眠的困扰，其中10%~15%的人因失眠影响了正常生活和工作^［1］。失眠是最常见的睡眠障碍之一，长期失眠常伴随焦虑、抑郁和记忆力下降等症状，并增加其他疾病的患病风险^［2］。针刺作为一种传统中医治疗方法，因安全性高、无毒副作用、成瘾性低、操作简便的优势广泛应用于失眠患者的临床治疗。研究调查显示针刺在延长睡眠时间，改善睡眠质量，提高患者睡眠效率及调整日间社会行为方面显示出了良好的效果^［3］。

丘脑室旁核（the paraventricular thalamus， PVT）是关键的丘脑觉醒调控核团^［4］，PVT神经元的活性与睡眠‑觉醒密切相关，激活PVT神经元可以诱导觉醒，而抑制其活性可以增加非快速动眼睡眠^［5］，研究表明，睡眠剥夺对PVT脑区的功能有显著影响^［6］。也可以升高外侧下丘脑食欲素的神经元活性^［7］，有效降低卒中后失眠患者血清食欲素水平^［8］，目前有关食欲素的研究主要集中在临床试验中，但在实验动物方面，关于针刺对觉醒脑区的食欲素水平的调节作用鲜有研究。基于此，本研究利用睡眠剥夺大鼠模型，以PVT为主要研究觉醒脑区，观察电针干预对睡眠剥夺大鼠PVT脑区的食欲素受体OX1R、OX2R表达水平的调节，深入探讨针刺对觉醒脑区调节的具体途径和机制，以期为针刺治疗睡眠‑觉醒障碍的临床实践提供重要理论支撑，为患者提供更多有效的临床选择。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

48只SPF级健康雄性SD大鼠（6~7周龄），体重（190±10） g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司［生产许可证号：SCXK（京）2024‑0001］。将大鼠随机分为4组：空白组12只、模型组12只、电针组12只和假针刺组12只，置于每12 h更替的明暗环境中，室温保持在（24±2） ℃，适应性饲养1周。所有实验程序已获得海南医科大学伦理委员会的批准（伦理审批号：HYLL‑2022‑131）。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：华佗牌针灸针、SDZ‑Ⅱ型电子针疗仪，脑立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）Neurokey脑电肌电记录设备（南京畅享医疗科技有限公司） Lunion Stage（南京畅享医疗科技有限公司），全自动化学发光图像分析系统（上海天能公司）、LightCycler 480 Ⅱ定量PCR仪（Roche，德国），多功能酶标仪（BIO‑TEK，美国），电泳仪（Bio‑Rad，美国）。试剂： BCA蛋白浓度测定试剂盒（BL521A，Biosharp），OX1R、OX2R抗体（DF5218、DF7162，Affinity），GAPDH抗体（10494‑1‑AP，Proteintech），山羊抗兔IgG （H+L）（GB23303，武汉赛维尔），PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒（RR036A）和TB Green^® Premix Ex Taq™ Ⅱ试剂盒（RR820A，TAKaRa，日本）。

1.3 实验方法

1.3.1 慢性睡眠剥夺（CSD）大鼠模型制备

本研究采用改良的多平台水环境法^［9］来构建CSD大鼠模型。在睡眠剥夺箱（尺寸为90 cm×60 cm×70 cm）内，固定有10个圆形平台（R=6 cm，h=9 cm）；每个剥夺箱内放置6只大鼠。进行实验时，水位深度应维持在平台下方1 cm处。当大鼠进入快速动眼睡眠（REM）时，因为大鼠全身肌张力降低，它们会低头去碰水或意外滑入水中，这种突发刺激迫使它们惊醒，导致睡眠剥夺。空白组对照组大鼠则在相同的平台上方放置铁网，使其能够在剥夺箱内正常进入睡眠状态。对大鼠连续剥夺21 d，每日剥夺18 h睡眠（下午16∶00~次日10∶00）。以大鼠白天活动量增多、晚间喜卧慵懒、昼夜节律出现混乱、大鼠易激惹、情绪暴躁为模型制备成功的标准^［10］。

1.3.2 治疗方法

造模成功后，每日上午固定时间进行电针治疗。将电针组大鼠腧穴进行常规消毒，选取 “百会”“太冲”“内关”“神门”（穴位定位以华兴邦、李辞蓉等为基础制定的大鼠穴位图谱^［11］）进行电针治疗。每日“百会”，单双日左右交替“神门”“太冲”“内关”，电针输出波形为连续波、频率2 Hz、强度为1 mA，每次20 min，每日1次，持续14 d。假针刺组同电针组选穴相同，但只选用去头的钝针轻轻刺激穴位，并不连接电源。其余两组不进行电针治疗。

1.3.3 大鼠头部电极埋置手术

用戊巴比妥钠（4 mL/kg）麻醉大鼠（已禁食12 h），将其固定于脑立体定位仪（68025，深圳瑞沃德）上，予以消毒处理后，剔除颅骨部位毛发，使颅骨充分显露，将骨膜分离，再使用干燥脱脂棉对颅骨表面加以清洁，使用钻头分别在颅骨前囟和后囟及中线两侧旁开2 mm 处钻孔，植入脑电图（EEG）电极，同时在颈部肌肉植入肌电图（EMG）电极，以收集大鼠的EEG和EMG信号。随后，用玻璃离子水门汀固定电极，术后，为预防感染，需在创口周边涂抹抗生素软膏，并置于饲养笼中进行单独饲养，每日观察大鼠恢复情况，确保大鼠体征稳定，恢复良好，术后恢复5~7 d。

1.4 指标检测

1.4.1 一般情况

评估各组大鼠在造模前后以及电针干预后的精神、皮毛表现、摄食、饮水状况等一般状态。

1.4.2 脑电、肌电检测大鼠睡眠觉醒时相

采用Neurokey脑电肌电记录设备，采集大鼠12 h内的EEG和EMG信号（上午8∶30~下午8∶30），通过Lunion Stage脑电信号分析软件，对脑电信号进行分析、处理，根据脑电肌电信号的功率幅度等特征，记录大鼠睡眠时相、REM睡眠、非快速眼动（NREM）睡眠、清醒（WAKE）期状态下EEG、EMG波形图和谱线密度百分比，得出12 h睡眠周期各时相的分布时间。

1.4.3 高架十字迷宫行为学检测

使用高架十字迷宫装置（长115 cm，宽15 cm，高70 cm，开放臂50 cm×15 cm、闭合臂50 cm×15 cm、中心区域15 cm×15 cm），在实验开始前24 h，将大鼠放置于检测行为学的房间，使其适应环境，以确保实验结果的稳定性。实验启动时，将大鼠头朝向开放臂放置，利用摄像机记录大鼠运动行为轨迹，时长5 min。随后，借助Smart v3.0软件，依据大鼠录像中的行为轨迹进行观测分析。观测指标包括大鼠进入开放臂的次数占总次数的百分比（OE%）以及在开放臂内运动的时间占总时间的百分比（OT%）。

1.4.4 实时荧光定量PCR检测PVT脑组织OX1R、OX2R、mGluR7的mRNA表达

大鼠脱颈处死后，快速取出脑部并置于冰上维持低温状态，精确分离出目标组织‑丘脑室旁核（PVT），分离完成后，存放于液氮中进行冷冻保存，为后续检测备用。运用TRIzol法从PVT脑组织里提取总RNA，之后借助逆转录方法得到cDNA，用作后续反应模板。进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为10 μL；引物序列（表1），采用2^-△△Ct法分别计算OX1R、OX2R、mGluR7的mRNA相对表达量。从而完成对PVT脑组织中OX1R、OX2R、mGluR7 mRNA表达水平的检测与分析。

1.4.5 Western blot检测PVT 脑组织OX1R、OX2R蛋白表达

按“1.4.4”方法，将PVT组织剥离，保存于液氮中备用。把300 μL的裂解液（强RIPA裂解液，PMSF）与组织一同放入1.5 mL的研磨管中，在充分研磨之后放置于冰上，让其裂解30 min，在此期间每隔5 min进行一次涡旋操作，以此确保组织能够充分裂解，之后再运用4 ℃低温离心机进行离心处理，提取蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，添加等比例loading buffer（5×），混匀后在100 ℃水浴器中加热5 min。将样本在凝胶中上样后进行电泳和转膜，采用甲醇激活PVDF膜，并使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后在4 ℃下孵育抗体过夜（GAPDH 1∶10 000，OX1R 1∶1 000，OX2R 1∶1 500）；于第二日进行洗膜，进行二抗孵育1 h（山羊抗兔IgG 1∶10 000），洗膜后，将ECL化学发光底物试剂盒中A液和B液依照1∶1比例予以混合，通过ECL成像系统进行曝光拍照，定量分析各蛋白条带的灰度值。

1.5 统计学处理

实验数据采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.5软件进行处理，Western blot条带分析使用ImageJ软件。正态分布的数据以（\overline{x}\pm s）表示。对于两组以上的数据，进行单因素方差分析；组间差异根据方差齐性，分别采用LSD检验（方差齐）或Dunnett事后检验（方差不齐）。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态观察结果

空白组大鼠精神良好、毛发亮泽且行动灵活；模型组大鼠呈精神亢奋、毛发粗糙失泽，饮食降而饮水增且大鼠间互相攀咬的情况也较为频繁；电针组相较模型组，毛发光滑、性情温和、精神良好，假针刺组与模型组无明显差异。

2.2 脑电肌电实验结果

2.2.1 造模前后及电针干预后各组大鼠睡眠‑觉醒状态

对各组大鼠，进行EEG‑EMG信号采集，并展示了各组大鼠12 h（8∶30~20∶30）不同睡眠‑觉醒状态下的代表性脑电图功率谱热图和肌电图迹线。从图中可以观察到模型组大鼠较之正常组觉醒时间增加，睡眠时长及持续时间有所减少，且睡眠‑觉醒周期逐渐碎片化。电针后大鼠的睡眠时间有所改善，在一定程度上恢复大鼠睡眠‑觉醒节律。见图1。

2.2.2 造模前后及电针干预后各组大鼠12 h内NREM、REM和WAKE时间

睡眠剥夺后，本研究对3组（空白组、模型组、电针组）大鼠12 h内各睡眠时相的总量进行统计。相较于空白组，模型组大鼠WAKE时间显著变高，NREMS、REMS累计时间出现下降（P<0.01）；相较于模型组，电针组WAKE总时长显著缩短，NREMS、REMS和总睡眠时间均大幅延长（P<0.001，P<0.01）。见表2。

2.3 高架十字迷宫行为学影响

大鼠在高架十字迷宫实验所呈现出的运动轨迹图表明，在造模之前，各个组别中的大鼠在OT%、OE%方面并未展现出明显的差异。造模后与空白组相比，其余3组大鼠的OT%、OE%都显著减少（P<0.001）。经过14天的电针治疗后，与空白组相比，模型组大鼠OT%、OE%显著减少（P<0.05），与模型组相比，电针组的OT%、OE%显著上升（P<0.05），假针刺组无统计学意义（P>0.05）。见表3、4，图2。

2.4 电针对CSD大鼠PVT组织OX1R、OX2R、mgluR7表达的影响

2.4.1 实时荧光定量PCR检测

与空白组相比，模型组组大鼠OX1R和OX2R的mRNA相对表达显著上升（P<0.01）。与模型组相比，电针组OX1R和OX2R的 mRNA表达显著降低（P<0.05）。在比较假针刺组与模型组之间OX1R和OX2R的mRNA表达水平时，并未观察到统计学意义上的显著差异（P>0.05）。各组中mGluR7的mRNA表达均无统计学意义（P>0.05），见表5。

2.4.2 Western blot检测

与空白组相比较，模型组的OX1R蛋白表达水平显著增加（P<0.001）。与模型组相比较，电针组的OX1R蛋白表达水平显著降低（P<0.01）；而假针刺组与模型组相比较，OX1R 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。在所有组别中，OX2R蛋白表达未见显著变化，各组之间差异无统计学意义（P>0.05），见图3、表6。

3 讨论

失眠属于中医“不寐”的范畴，针刺可以通过调节阴阳而达到安眠之效，《灵枢•根结》提出“用针之要，在于知调阴与阳。调阴与阳……使神内藏”，针刺亦可以用于调节情志，如《素问·血气形志》中提出“形乐志苦，病生于脉，治之以灸刺”^［12］。自古诸多论著提出了针刺疗法，并侧重于督脉、心经、肝经等取穴，百会穴位于督脉，具有镇静安神，调节睡眠的作用。电针百会治疗失眠，其机制可能与改善睡眠剥夺大鼠睡眠模型脑电中α波和β波的频率有关^［13］。神门为心经原穴，有养心安神、宁心除烦的作用。研究表明，电针神门可以有效改善咖啡因诱导的睡眠障碍大鼠的睡眠情况^［14］。内关为心包经之络穴，具有养心安神助眠之效。太冲穴为足厥阴肝经输、原穴，具有疏肝解郁，调畅气机之功效。电针百会、内关、神门、太冲等穴位可以通过改善失眠大鼠脑皮质血氧水平来改善失眠症状^［15］。故本研究选用百会、神门、内关、太冲穴位，以达到阴平阳秘、疏肝解郁、养心安神之功，起到治疗失眠的目的。

长期的睡眠剥夺会对睡眠节律产生显著的不良影响，且随着睡眠剥夺的持续，REM睡眠的时间和质量也会发生变化，NREM睡眠的各个阶段都受到影响，尤其是深度睡眠^［16］，进而引起焦虑^［17］，通过对脑电肌电的观察发现，21天慢性睡眠剥夺后，模型组大鼠12 h WAKE显著增加，NREM睡眠和REM睡眠时间均减少；结合大鼠造模后一般状态及行为学的观察结果表明造模成功。电针干预明显改善了慢性睡眠剥夺后大鼠睡眠‑觉醒的状态，延长大鼠睡眠时间，改善了大鼠的焦虑状态。动物研究结果表明，针灸能通过调节大脑中某些神经递质的含量来调节睡眠障碍^［18］，如调节生物钟基因clock及Bmal1^［19］，抑制多巴胺^［20］、5‑羟色胺^［21］、睡眠相关炎症因子（ANXA1、IL‑1β）^［22］、去甲肾上腺素^［23］、和谷氨酸等神经元，增强GABA^［24］神经元神经递质的释放以维持睡眠状态，进而改善睡眠。研究表明PVT接受下丘脑食欲素的广泛投射^［25］。食欲素作为CNS内调控觉醒和快速眼动睡眠的神经肽^{［26，27］}，其受体拮抗剂在临床上已被广泛用于失眠的治疗^［28］。研究发现，在PVT中，食欲素与OX1R和OX2R结合^［29］不仅影响觉醒状态^［30］，还对睡眠结构产生影响^［31］，且可以介导焦虑相关行为^［32］。高表达的食欲素引起IFS诱导的REM时间减少^［33］，使睡眠变得浅而不稳定。实验结果表明，电针能够改善CSD大鼠睡眠状况，其作用机制可能是通过下调PVT区域OX1R的表达来达成的。

PVT神经元中大部分是谷氨酸能神经元^［34］，研究发现，LH（Hcrt）‑PVT‑NAC和LH（Hcrt）‑PVT‑mPFC这两条与觉醒调控相关的效应通路^［35］都是通过食欲素激活PVT内的谷氨酸能神经元而发挥作用的^［36］。谷氨酸是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质^［37］，其离子型受体mGluR7可以对大鼠睡眠‑觉醒状态进行有效调节^［38］。结果发现，针刺对大鼠PVT脑区mGluR7没有明显作用。虽然针刺对mGluR7的结果不明显，但仍需继续探索针刺对PVT中其他相关谷氨酸受体的影响，有助于进一步研究探讨针刺对PVT内谷氨酸神经元突触的影响，了解其在神经调控中的作用机制。

综上所述，电针可能通过抑制PVT脑区食欲素受体的表达从而降低PVT神经元的活性，进而改善睡眠剥夺睡眠‑觉醒节律及焦虑样状态。这一发现为电针在睡眠‑觉醒障碍治疗中的应用提供了新的理论依据，未来的研究应进一步探讨其具体机制及临床应用潜力。这一机制提示电针在调节睡眠‑觉醒节律等方面具有重要应用价值。

作者贡献度说明：

吴琼：实验设计，论文撰写。黄禄宇、康晓娜、李佳欣：完成实验。沈巍：指导实验。孙曌：修改论文，并提供项目基金支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81860880)

海南省自然科学基金高层次人才项目(823RC492)