基于PI3K/AKT信号通路探讨白芍总苷胶囊对非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

Effects of total glucosides of White Paeony capsules on proliferation, migration, invasion and apoptosis of non‑small cell lung cancer based on PI3K/AKT signaling pathway

摘要

目的 基于PI3K/AKT信号通路探讨白芍总苷胶囊（TGP）对非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并探索其作用机制。 方法 采用CCK‑8法检测不同浓度TGP对肺癌A549和H1975细胞活力的影响。基于CCK‑8结果，将后续实验细胞分为对照组（control，不加药物）、TGP低剂量组（TGP‑L，1 g/L）、TGP高剂量组（TGP‑H，4 g/L）、LY294002组（PI3K通路抑制剂，10 nmol/L）、TGP高剂量+LY294002组（4 g/L+10 nmol/L）。克隆形成实验检测各组细胞增殖；划痕实验检测各组细胞迁移；Transwell实验检测各组细胞侵袭；流式细胞术检测各组细胞凋亡；Western blot检测A549和H1975细胞上皮间质转化（EMT）相关蛋白（E‑cadherin和N‑cadherin）、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl‑2和Cleaved caspase‑3）、PI3K/AKT通路相关蛋白（p‑PI3K/PI3K和p‑AKT/AKT）的表达水平。 结果 与对照组相比，TGP低剂量组、LY294002组、TGP高剂量组、TGP+LY294002组肺癌A549和H1975细胞增殖能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力下降，细胞凋亡率升高，N‑cadherin、Bcl‑2、p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白水平下降，E‑cadherin、Bax和Cleaved caspase‑3蛋白水平升高，且TGP高剂量组对各项检测指标调控作用优于TGP低剂量组（均P<0.05）；与TGP高剂量组或者LY294002组相比，TGP高剂量+LY294002组肺癌A549和H1975细胞增殖能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力下降，细胞凋亡率升高，N‑cadherin、Bcl‑2、p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白水平下降，E‑cadherin、Bax和Cleaved caspase‑3蛋白水平升高（均P<0.05）。 结论 白芍总苷胶囊可抑制肺癌A549和H1975细胞的增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of total glucosides of White Paeony capsules （TGP） on proliferation， migration， invasion and apoptosis of non‑small cell lung cancer based on the PI3K/AKT signaling pathway， and explore its mechanism. Methods CCK‑8 was used to detect the effects of different concentrations of TGP on A549 and H1975 cell viability. On the basis of CCK‑8 results， A549 and H1975 cells were classified into five groups： the control group （no drugs）， the TGP low dose group （TGP‑L， 1 g/L）， the TGP high dose group （TGP‑H， 4 g/L）， the LY294002 group （PI3K pathway inhibitor， 10 nmol/L）， the TGP high dose + LY294002 group （4 g/L + 10 nmol/L）. Cloning test was used to detect cell proliferation. Scratch test was used to detect cell migration. Transwell test was used to detect cell invasion. Flow cytometry was used to detect apoptosis. The expressions of EMT‑related proteins （E‑cadherin and N‑cadherin）， apoptosis related proteins （Bax， Bcl‑2 and Cleaved caspase‑3） and PI3K/AKT pathway related proteins （p‑PI3K/PI3K and p‑AKT/AKT） in A549 and H1975 cells were detected by Western blot. Results Compared with the control group， the proliferation ability， migration ability and invasion ability of lung cancer A549 and H1975 cells in TGP low dose group， LY294002 group， TGP high dose group and TGP high dose +LY294002 group were decreased， while the cell apoptosis rate was increased. The protein expression of N‑cadherin， Bcl‑2， p‑PI3K/PI3K and p‑AKT/AKT was decreased， while the protein expression of E‑cadherin， Bax and Cleaved caspase‑3 was increased. And the above indicators were better regulated in the TGP high dose group than in the TGP low dose group（all P<0.05）； compared with the high dose TGP group or LY294002 group， the proliferation ability， migration ability and invasion ability of lung cancer A549 and H1975 cells in TGP high dose + LY294002 group were decreased， while the cell apoptosis rate was increased. The protein expression of N‑cadherin， Bcl‑2， p‑PI3K/PI3K and p‑AKT/AKT was decreased， while the protein expression of E‑cadherin， Bax and Cleaved caspase‑3 was increased （all P<0.05）. Conclusion TGP can inhibit the proliferation， migration and invasion of A549 and H1975 cells and promote their apoptosis， which may be related to the inhibition of the PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

白芍总苷胶囊 / 非小细胞肺癌 / PI3K/AKT / 增殖 / 凋亡 / 上皮间质转化

Key words

Total glucosides of White Paeony capsules / Non‑small cell lung cancer / PI3K/AKT / Proliferation / Apoptosis / Epithelial mesenchymal transition

肺癌作为常见的恶性肿瘤类型，其发病率与致死率长期居于癌症前列^［1］。流行病学数据显示，在肺癌的病理分型中，非小细胞肺癌（non‑small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌亚型的85%^［2］。虽然目前手术、放化疗、靶向和免疫治疗等方法能控制肺癌进展，但其5年生存率仍然较低，且存在耐药性、药物不良反应、术后并发症等问题^［3］。而中医药治疗肺癌具有悠久的历史，大量的临床研究已经证实，中医药在增强化疗药物敏感性、逆转耐药性、减轻毒性、减少转移率和延长生存期等方面倍具优势^［4］。因此，挖掘中药抗肿瘤作用显得尤其重要，其作用机制值得深入研究。

白芍总苷胶囊（total glucosides of White Paeony capsules，TGP）是以传统药材白芍根茎提取物为核心成分的中药制剂，已被证实具有抗炎、抗氧化以及免疫调节等多种药理功效^［5，6］。有研究显示，TGP具有抗肿瘤作用，能抑制乳腺癌、前列腺癌、舌癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭^［7‑9］。然而，关于TGP对肺癌特别是非小细胞肺癌的影响及作用机制的研究却鲜有报道。因此，本研究主要以肺腺癌细胞株A549和H1975为研究对象，检测TGP对NSCLC增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响，并探究其作用机制，为临床治疗NSCLC提供新的理论支持和实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养

肺癌A549和H1975细胞，均购于中国科学院上海生命科学院细胞库，在含10%胎牛血清、1%双抗的1640培养基中，于37 ℃、5%CO₂的培养箱中培养。

1.2 实验药物

TGP（宁波立华制药有限公司，批号：211109），在4 g白芍总苷中加入1 mL二甲基亚砜（DMSO），配置浓度为4 g/mL母液，放置于-20 ℃冰箱保存，正式实验时稀释为相应浓度。

1.3 主要试剂

LY294002（上海皓元生物医药科技有限公司，批号：HY‑10108‑10 ml）；1640培养基、Annexin V‑FITC/PI凋亡试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G4531、G1511）；CCK‑8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0037）；磷脂酰肌醇3‑激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3‑激酶（p‑PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p‑AKT）、B淋巴细胞瘤‑2（Bcl‑2）、Bcl‑2相关X蛋白（Bax）、活化的天冬氨酸蛋白水解酶‑3（Cleaved Casepase‑3）、E‑钙黏蛋白（E‑cadherin）、N‑钙黏蛋白（N‑cadherin）（英国Abcam公司，批号：Ab278545、Ab302985、Ab179463、Ab38449、Ab32503、Ab194583、Ab32042、Ab40772、Ab76011）；甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）（美国proteintech公司，批号：10494‑1‑AP）。

1.4 主要仪器

荧光倒置显微镜（日本尼康公司，TE300），酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，ELx800），流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司，A00‑1‑1102），凝胶成像仪（美国伯乐公司，Chemi Doc XRS+）。

1.5 CCK8实验检测细胞活力

将A549和H1975细胞按照3×10³/孔的密度铺于96孔板，给予不同浓度TGP（0、0.4、0.8、1、2、3、4、5、6 g/L）干预24 h，每孔加入100 µL含10%CCK‑8的培养基，培养箱内继续培养1 h，使用酶标仪检测吸光OD_{450 nm}数值。计算细胞存活率及细胞半数抑制浓度（IC₅₀）。细胞存活率=（试验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.6 细胞分组与给药

根据CCK‑8实验结果，将后续实验细胞分为5组：对照组（Control）、TGP低剂量组（TGP‑L）、TGP高剂量组（TGP‑H）、LY294002组（PI3K通路抑制剂）、TGP高剂量+LY294002组（TGP‑H+LY294002）。对照组给予常规培养，TGP低、高剂量组分别予1 g/L和4 g/L的TGP处理，LY294002组给予10 nmol/L的LY294002处理^［10］，TGP高剂量+LY294002组给予4g/L的TGP和10 nmol/L的LY294002处理。

1.7 克隆形成实验检测细胞增殖

调整A549和H1975细胞密度为1×10³/孔，接种至6孔板，待细胞形成小群落时，按照1.6的方法进行分组与处置，置于细胞培养箱继续培养2周，进行甲醛固定，结晶紫染色，拍照并计数。

1.8 划痕实验检测细胞迁移

用Marker笔在6孔板背部画直线，每孔横穿3条直线，将细胞按照1×10⁵/孔的密度铺到6孔板中，待细胞融合率达到80%时，用1 mL枪头做笔直划痕，磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤后，加入含有2%胎牛血清的1640培养基，按照1.6的方法进行分组与处置，分别于0 h和48 h拍照记录，用ImageJ软件处理图像。

1.9 Transwell检测细胞侵袭

Transwell小室置于24孔板中，上室内加入按照1∶8稀释后的基质胶60 µL，培养箱内孵育1 h，吸除残余液体，上室加入无血清培养的细胞200 µL（1×10⁶个细胞/mL），下室加入含有20%血清的1640培养基600 µL，按照1.6的方法进行分组与处置24 h后，PBS洗涤，甲醛固定，结晶紫染色，倒置显微镜下拍照计数。

1.10 流式细胞术检测细胞凋亡

按照1.6的方法进行分组与处置24 h后，消化离心收集细胞，预冷PBS洗涤，100 μL 1×Binding buffer重悬细胞，加入10 μL Annexin V‑FITC溶液与5 µL PI试剂，室温下避光反应15 min，上流式细胞仪检测凋亡率。

1.11 Western blot检测上皮‑间充质转化（EMT）相关蛋白、凋亡相关蛋白和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平

按照1.6的方法进行分组与处置24 h后，进行蛋白裂解并收集蛋白样品，BCA法测定总蛋白浓度，之后进行上样，电泳，转膜，封闭，抗体孵育，曝光显影，蛋白条带使用ImageJ软件处理分析。

1.12 统计学处理

所有数据均通过GraphPad Prism 9.0软件统计分析。计量资料以（\overline{x}\pm s）表示，多组比较用单因素方差分析法，两组对比采取独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TGP对NSCLC细胞活力的影响

CCK‑8实验结果显示，当TGP浓度在0~4 g/L范围，A549和H1975细胞存活率均呈剂量相关性降低，计算IC₅₀值分别为4.79 g/L和5.39 g/L，因此后续实验设置TGP低剂量组为1 g/L，TGP高剂量组为4 g/L。见图1。

2.2 TGP对NSCLC细胞增殖的影响

克隆形成实验结果显示，与对照组相比，TGP低剂量组、LY294002组、TGP高剂量组、TGP+LY294002组，A549和H1975细胞克隆形成数量明显减少（均P<0.05）；与TGP低剂量组相比，TGP高剂量组的A549和H1975细胞克隆形成数量明显减少（P<0.05）；与TGP高剂量组或者LY294002组相比，TGP高剂量+LY294002组的A549和H1975细胞克隆形成数量明显减少（均P<0.05）。见表1。

2.3 TGP对NSCLC细胞迁移的影响

划痕实验结果显示，与对照组相比，TGP低剂量组、LY294002组、TGP高剂量组、TGP+LY294002组，A549和H1975细胞迁移率明显降低（均P<0.05）；与TGP低剂量相比，TGP高剂量组的A549和H1975细胞迁移率明显降低（P<0.05）；与TGP高剂量组或者LY294002组相比，TGP高剂量+LY294002组的A549和H1975细胞迁移率明显降低（均P<0.05）。见表2。

2.4 TGP对NSCLC细胞侵袭的影响

Transwell侵袭实验结果显示，与对照组相比，TGP低剂量组、LY294002组、TGP高剂量组、TGP+LY294002组A549和H1975细胞的侵袭细胞数明显减少（均P<0.05）；与TGP低剂量组相比，TGP高剂量组的A549和H1975细胞的侵袭细胞数明显减少（P<0.05）；与TGP高剂量组或者LY294002组相比，TGP高剂量+LY294002组的A549和H1975细胞的侵袭细胞数明显减少（均P<0.05）。见图2。

2.5 TGP对NSCLC细胞凋亡的影响

流式细胞术实验结果显示，与对照组相比，TGP低剂量组、LY294002组、TGP高剂量组、TGP+LY294002组，A549和H1975细胞的凋亡率升高（均P<0.05）；与TGP低剂量组相比，TGP高剂量组的A549和H1975细胞的凋亡率明显升高（P<0.05）；与TGP高剂量组或者LY294002组相比，TGP高剂量+LY294002组的A549和H1975的细胞凋亡率明显升高（均P<0.05）。见图3。

2.6 TGP对NSCLC细胞的EMT相关蛋白、凋亡相关蛋白和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的影响

Western blot实验结果显示，与对照组相比，TGP低剂量组、LY294002组、TGP高剂量组、TGP+LY294002组，A549和H1975细胞的E‑cadherin、Bax、Cleaved caspase‑3蛋白的表达升高，N‑cadherin、Bcl‑2、p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白表达下降（P<0.05），差异具有统计学意义，见图4~6；与TGP低剂量组相比，TGP高剂量组的E‑cadherin、Bax、Cleaved caspase‑3蛋白的表达明显升高，N‑cadherin、Bcl‑2、p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白表达明显下降（P<0.05），差异具有统计学意义；与TGP高剂量组或者LY294002组相比，TGP高剂量+LY294002组的E‑cadherin、Bax、Cleaved caspase‑3蛋白表达明显升高，N‑cadherin、Bcl‑2、p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白表达明显下降（均P<0.05）。

3 讨论

肺癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤，是癌症相关死亡的主要原因^［1］。尽管免疫疗法和靶向疗法的发展改善了肺癌患者预后，但其总体治愈率和生存率仍然很低，全球癌症负担依然很重^［11］。因此，寻求治疗肺癌的新药物并探究其抗癌机制至关重要。近年来，中药的天然化学活性成分在恶性肿瘤的防治中作用显著^［12］。TGP作为我国传统中药白芍的主要天然活性成分，进一步探索其在肺癌领域中的潜在作用，或许能为肺癌的治疗提供新的视角和策略。

增殖是癌细胞的基本特点，因此抑制肿瘤细胞的增殖是治疗肿瘤的一种重要方式。而检测肿瘤细胞的增殖情况是评价抗肿瘤药物是否有效的重要指标。本课题首先通过CCK‑8实验检测不同浓度TGP干预NSCLC细胞株A549和H1975后对细胞活力的影响。结果显示，随着给药浓度的增加，肿瘤细胞活力逐渐下降；随后实验加入PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002共同干预，进行克隆形成实验检测NSCLC细胞的增殖情况。结果显示，TGP和LY294002均能抑制NSCLC细胞的增殖，且TGP高剂量组的抑制效果优于TGP低剂量组；二者联合使用能增强抑制NSCLC细胞的增殖。

恶性肿瘤生长和扩散的关键特征之一是肿瘤的转移和侵袭。上皮细胞与间充质细胞之间的转化（EMT）已被证明在肿瘤转移和侵袭中起关键作用^［13］。上皮属性蛋白E‑cadherin和间质属性蛋白N‑cadherin是EMT过程中重要的标志性蛋白，在肿瘤的EMT过程中，E‑cadherin作为一种肿瘤抑制因子，其表达下调，会伴随N‑cadherin上调，这种钙黏蛋白的转换会促进肿瘤细胞的转移和侵袭^［14］。本研究通过划痕实验和Transwell侵袭实验显示，TGP能减弱NSCLC细胞的迁移和侵袭能力；进一步Western blot实验结果提示，TGP可上调E‑cadherin蛋白的表达，下调N‑cadherin蛋白的表达，表明TGP可以抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭，延缓EMT的发生。且本研究还发现，TGP与LY294002联合干预能显著抑制NSCLC细胞迁移和侵袭的能力，更有效的延缓EMT的进程。

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡。线粒体介导的内源性凋亡途径，是细胞凋亡的一种主要途径^［15］。Bcl‑2家族（包括抗凋亡因子Bcl‑2与促凋亡因子Bax）和Caspase家族中的凋亡执行因子Caspase‑3是细胞凋亡的关键调节因子^［16］。在内源性凋亡途径中，Bcl‑2和Bax能激活下游的凋亡执行因子Caspase‑3成为Cleaved caspase‑3，最终诱导细胞凋亡^［17］。本研究中，发现TGP干预NSCLC细胞后，细胞的凋亡率增加。进一步Western blot实验结果提示，TGP处理NSCLC细胞后Bcl‑2蛋白表达下降，Bax和Cleaved caspase‑3蛋白表达升高，且与LY294002联合干预对上述线粒体途径凋亡蛋白的影响更加明显。说明TGP是通过上调Bax、Cleaved caspase‑3表达，下调Bcl‑2表达，激活线粒体途径，诱导NSCLC细胞发生内源性途径凋亡。

PI3K/AKT信号通路是各类癌症的主要信号通路，可参与调控多个生物学过程，与肿瘤发生和疾病进展密切相关^［18］。在促癌信号下，PI3K发生磷酸化，激活下游靶标AKT，活化的AKT再激活或抑制下游效应因子参与调节细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡^［19］。有研究显示，PI3K/AKT信号通路激活可促进NSCLC进展与转移^［20］。现有诸多报道证明，中药可以通过阻断PI3K/AKT信号通路激活，抑制NSCLC细胞的恶性生物学行为，进一步发挥抗肿瘤作用^{［21‑23］}。因此，阻断该通路的激活可能成为一种潜在的治疗NSCLC的方法。此前已有研究发现，TGP可通过抑制PI3K/AKT信号通路，抑制喉癌Hep‑2细胞的增殖、侵袭和迁移能力^［24］。但TGP是否可以通过调控PI3K/AKT信号通路发挥抗NSCLC作用尚不清楚。本课题前面实验研究已证实TGP可以抑制NSCLC的恶性表型，结合PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞生物学功能中的重要作用，假设在NSCLC中，TGP可能通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥抗肿瘤作用。结果显示，TGP能下调NSCLC细胞的p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白表达水平，与LY294002发挥同样的抑制效果；且TGP与LY294002联合干预，NSCLC细胞的p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白表达水平显著下调。提示TGP可能通过抑制PI3K/AKT信号通路影响NSCLC细胞的生物学功能。因此，TGP可能是一种天然的PI3K/AKT信号通路抑制剂，有潜力成为非小细胞肺癌患者临床治疗的新型抗肿瘤药物。

综上，TGP可以抑制肺癌A549和H1975细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞发生线粒体途径凋亡，其机制可能与阻断PI3K/AKT信号通路有关，且与单用TGP和LY294002相比，TGP联合LY294002干预可明显增强对NSCLC细胞生物学功能的影响，能更有效地抑制肿瘤细胞的发展。但本研究仅在体外实验探讨TGP的抗肿瘤效果及作用机制，未来将完善异种移植动物模型研究，进一步在体内验证其有效性和安全性。

作者贡献度说明：

孙露露：实验研究、数据处理、论文写作和投稿；吴晓、季娟娟：收集数据与实验研究；郁文越、宝音：文献检索；朱佳：实验指导和论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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