脊蛇祛湿胶囊对类风湿关节炎合并骨质疏松症患者骨保护作用机制的网络药理学及回顾性研究

The bone‑protective mechanisms of Jishe Qushi Capsules in patients with rheumatoid arthritis complicated by osteoporosis: A network pharmacology and retrospective study

摘要

目的 应用网络药理学及分子对接技术探讨脊蛇祛湿胶囊在类风湿关节炎合并骨质疏松症患者中的骨保护作用机制，并进行回顾性分析验证。 方法 通过TCMSP、BATMAN‑TCM、SwissTarget Prediction数据库及文献搜集药物的有效活性成分及对应靶点；通过GeneCard、OMIM、TTD数据库中获取疾病靶点；通过Venny 2.1.0获取交集靶点后，利用Cytoscape3.7.2软件、String数据库、DAVID数据构建靶蛋白相互作用（PPI）网络、基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）生物通路富集分析；利用AutoDock Vina 1.1.2软件对主要活性成份及靶点进行分子对接验证。回顾性选取贵州中医药大学第二附属医院2018年1月~2024年4月类风湿关节炎合并骨质疏松症患者为研究对象，对照组（n=81）与实验组（n=81），对两组一般资料及前后两次骨代谢标志物结果进行分析。 结果 脊蛇祛湿胶囊中有142个活性成分，作用于TP53、STAT3、AKT1、SRC和JUN等关键靶点，通过调控PI3K‑Akt、MAPK等信号通路来发挥骨保护作用。分子对接显示，主要活性成分与核心靶点具有较好的结合活性。回顾性分析结果表明，相较于对照组，实验组的Δ25‑（OH）D₃值显著升高（P<0.05），且“脊蛇祛湿胶囊、阿法骨化醇软胶囊、碳酸钙D₃片、维生素D₂注射液”的用药方案效果最佳（P<0.05）。 结论 脊蛇祛湿胶囊在RA合并OP的患者中可能存在潜在的骨保护作用，并与抗骨质疏松药物联用时可能产生协同效应。

Abstract

Objective To investigate the bone‑protective mechanisms of Jishe Qushi Capsule in patients with rheumatoid arthritis （RA） combined with osteoporosis using network pharmacology and molecular docking techniques， and to verify these findings through a retrospective analysis. Methods The active ingredients and corresponding targets of the drug were obtained through the TCMSP， BATMAN‑TCM， SwissTargetPrediction databases， and relevant literature. Disease‑related targets were identified from the GeneCard， OMIM， and TTD databases. Intersection targets were determined using Venny 2.1.0， and the protein‑protein interaction （PPI） network was constructed using Cytoscape 3.7.2 and the STRING database. Gene Ontology （GO） functional and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analyses were performed using the DAVID database. Molecular docking of the main active components and targets was conducted using AutoDock Vina 1.1.2. A retrospective analysis was carried out on patients with RA combined with osteoporosis who were treated at the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine from January 2018 to April 2024. The control group （n=81） and the experimental group （n=81） were compared in terms of general information and bone metabolism markers before and after treatment. Results Jishe Qushi Capsule contained 142 active ingredients， which acted on key targets such as TP53， STAT3， AKT1， SRC， and JUN， exerting bone‑protective effects by regulating the PI3K‑Akt and MAPK signaling pathways. Molecular docking results showed that the main active components had strong binding affinities with core targets. The retrospective analysis demonstrated that the Δ25‑（OH）D₃ levels were significantly higher in the experimental group compared to the control group （P<0.05）. Furthermore， the combination of "Jishe Qushi Capsule， Alfacalcidol Soft Capsule， Calcium Carbonate and Vitamin D₃ Tablet， and Vitamin D₂ Injection" was found to be the most effective regimen （P<0.05）. Conclusion Jishe Qushi Capsule may have a potential bone‑protective effect in RA patients with osteoporosis and may produce synergistic effects when combined with anti‑osteoporotic medications.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 分子对接 / 脊蛇祛湿胶囊 / 类风湿关节炎 / 骨质疏松症

Key words

Network pharmacology / Molecular docking / Jishe Qushi Capsules / Rheumatoid arthritis / Osteoporosis

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨密度降低和骨微结构退化为特征的系统性骨骼疾病，其病理机制涉及骨重建过程的失衡。当骨吸收速率超过骨形成速率时，骨密度逐渐降低，骨小梁数量减少，结构退化，最终导致骨强度下降^［1］。该疾病主要发生在老年人群，尤其是绝经后妇女。一些由多种炎症介质驱动的风湿免疫疾病与OP之间存在紧密的联系，如类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）等，不仅会导致关节局部的骨质破坏，还通过系统性炎症影响全身骨代谢，从而并发OP^［2］。而骨代谢所产生的一些标志物如甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）和25‑羟基维生素D₃（25‑hydroxyvitamin D，25‑（OH）D₃）等，在OP的诊断、治疗监测及预后评估中具有重要作用^［3，4］。

脊蛇祛湿胶囊是贵州中医药大学第二附属医院的院内制剂，是在苗医理论指导下的经典验方，由狗脊、黑骨藤、青风藤、乌梢蛇、三七、姜黄、甘草等组成，具有祛风除湿、通络止痛、补益肝肾的作用。多项研究表明，脊蛇祛湿胶囊不仅能有效缓解RA患者的关节症状，降低相关炎症指标，还具有良好的药物安全性^［5‑8］。此外，临床观察还发现，该药在治疗RA过程中可能还发挥着骨质保护作用，但目前缺乏这方面的临床疗效反馈，故笔者利用网络药理学及分子对接技术探讨脊蛇祛湿胶囊在RA合并OP患者中的骨保护机制，并对贵州中医药大学第二附属医院近6年来收治此类患者的临床数据进行回顾性分析。

1 材料与方法

1.1 网络药理学数据来源及研究方法

1.1.1 脊蛇祛湿胶囊的化学成分收集与靶点预测

利用中药系统药理学平台（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/），筛选出白芍、甘草、姜黄、三七、千年健及青风藤的活性成分，筛选条件为口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18。通过BATMAN‑TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）获得狗脊、乌梢蛇可信度高的成分及靶点（Score cutoff>0.84（LR=80.88）、P<0.05）。经中国知网（https：//www.cnki.net/）检索黑骨藤的有效成分，并通过SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测。所有靶点信息经Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）校准，剔除非人源基因后，合并去重，最终得到标准化的靶点基因名。

1.1.2 骨质疏松症相关靶点的获取

通过TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https：//www.omim.org/）和GeneCards（https：//w ww.genecards.org/）数据库，使用“osteoporosis”作为检索关键词，获取与骨质疏松相关的靶点。在去除重复基因后，利用Uniprot数据库对结果进行修正，最终筛选出相关的靶点基因信息。

1.1.3 “药物‑成分‑靶点”可视化分析

通过将药物成分靶点与骨质疏松症相关靶点进行交集分析，使用Venn图展示交集部分，识别出成分与疾病靶点的重叠。接着，使用Cytoscape3.7.2软件构建“药物‑成分‑靶点”网络，以可视化成分和靶点之间的关系。

1.1.4 靶蛋白相互作用（PPI）网络构建

将“1.1.3”部分获得的交集靶点上传至String数据库（https：//string-db.org/）构建PPI网络，选择物种为“Homo sapiens”，设定最小相互作用评分为0.9，其他参数保持默认值。将结果导入Cytoscape3.7.2中进行可视化，用节点大小和颜色反应反映Degree的大小，节点大小、颜色深浅与Degree呈正相关，并筛选核心靶点。

1.1.5 GO功能与KEGG通路富集分析及“活性成分‑靶点‑通路”网络构建

将交集靶点上传至DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）进行GO功能和KEGG通路富集分析，获取生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和通路富集分析数据，并通过微生信平台对富集分析结果进行可视化。然后将富集获得的通路运用Cytoscape3.7.2软件绘制“活性成分‑靶点‑通路”网络进行分析。

1.1.6 分子对接分析

使用AutoDock Vina 1.1.2对活性成分与关键靶点进行分子对接分析，验证其相互作用。化合物的结构文件通过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得，并使用Open Babel 2.3.2将SDF文件转换为PDB格式。受体蛋白通过PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）获取，并使用PYMOL 2.3.4进行去水和去配体处理。接着，使用AutoDockTools对受体蛋白进行加氢和电荷平衡处理，最终将受体蛋白和配体小分子转化为pdbqt格式进行对接。对接结果通过PLIP平台（http：//plip.biotec.tu-dresden.de/）进行分析与可视化。

1.2 临床回顾性试验方法

1.2.1 研究对象的选择

研究病例均来源于贵州中医药大学第二附属医院风湿免疫科2018年1月1日~2024年4月30日住院患者，并通过电子病历系统进行检索。

纳入条件：（1）符合1987年ACR修订的RA分类诊断标准^［9］或2010年ACR/EULAR的RA诊断标准^［10］；（2）符合2018年《类风湿关节炎病证结合诊疗指南》寒湿痹阻证型的中医证候诊断标准^［11］；（3）符合WHO骨质疏松症诊断标准^［12］；（4）选取两次住院时间大于3个月，且小于12个月；（5）两次住院期间都行“骨代谢标志物”检验，且第一次25‑（OH）D₃检测<30 ng/mL；（6）使用过以下药物之一：“脊蛇祛湿胶囊”“阿法骨化醇软胶囊”“碳酸钙D₃片”“维生素D₂注射液”。

排除条件：（1）不符合以上任意一条；（2）病历资料不全；（3）长期或规律其他抗OP药物，如双膦酸盐、RANKL单克隆抗体等类。

1.2.2 分组

对筛选后的患者按照随机数字表法，将使用脊蛇祛湿胶囊的患者纳入实验组，未使用脊蛇祛湿胶囊的患者纳入对照组。两组患者均允许联用“阿法骨化醇软胶囊、碳酸钙D₃片、维生素D₂注射液”。

药物：脊蛇祛湿胶囊（贵州中医药大学第二附属医院，批号：黔药制字Z20160028，规格：0.45 g）10 mg，每日3次，口服；阿法骨化醇软胶囊（青岛正大制药有限公司，批号：H19991114，0.25 μg）0.5 μg，每日2次，口服；碳酸钙D₃片（惠氏制药有限公司，批号：H10950029，规格：0.6 g）1.2 g，每晚1次，口服；维生素D₂注射液（江西赣南海欣药业股份有限公司，批号：H20054433，规格：1 mL∶5 mg）15 mg，每1~2月1次，肌肉注射。

1.2.3 观察指标

本研究选取两次住院期间的骨代谢标志物，包括PTH（参考值：15~65 pg/mL）和25‑（OH）D₃（参考值：缺乏：<20 ng/mL；不足：20~30；健康：>30）。血清PTH和25‑（OH）D₃水平分别在入院时检测，指标测定由贵州中医药大学第二附属医院检验科完成，并对同一患者的两次检测值计算变化值（Δ），用以评估治疗期间的骨代谢变化。

1.3 统计学处理

将纳入患者通过SPSS26进行描述性分析。计量资料数据满足正态性，采用（\overline{x}\pm s）表示，独立组间比较采用t检验；计量资料不满足正态性，采用中位数（四分位数）表示，独立组间比较采用Mann‑Whitney U检验；计数资料采用n（%）表示，组间比较采用卡方检验；影响因素分析采用多元回归分析；按检验水准P<0.05为差异具有统计学意义。

2 网络药理学分析结果

2.1 脊蛇祛湿胶囊活性成分及靶点预测

通过TCMSP、BATMAN‑TCM数据库检索收集到活性成分共142个，其中白芍8个、甘草88个、姜黄3个、三七8个、千年健3个、青风藤6个、狗脊8个、乌梢蛇6个，通过中国知网检索黑骨藤的有效成分12个^［13］（表1）。

2.2 骨质疏松症相关靶点

通过GeneCards、OMIM、TTD数据库分别获得5 935、45、29个靶点，去重后获得5 974个与骨质疏松症相关的靶点，将得到的基因经Uniprot数据库校正。将药物的作用靶点与骨质疏松症的靶点取交集后，获得385个骨质疏松症与药物的交集靶点，见图1。

2.3 药物‑活性成分‑靶点预测结果

利用药物‑活性成分‑靶点数据，构建网络图，见图2，该网络包括516个节点和2 110条边。根据Degree值排名前10的核心成分，见表2。

2.4 核心靶点及PPI网络

将385个交集靶点导入String数据库中进行蛋白‑蛋白相互作用预测，将结果导入Cytoscape3.7.2软件绘制蛋白相互作用网络，选择Degree值>8的靶点，包括103个节点和1 466条边，见图3。其中TP53、STAT3、AKT1、SRC、JUN等10个为核心靶点，Degree值均≥33。

2.5 生物功能富集分析及“活性成分‑靶点‑通路”网络构建

2.5.1 GO功能及KEGG通路富集分析

取交集靶点，利用DAVID数据库进行GO基因功能富集分析，共筛选出894个GO条目，以P<0.01作为筛选标准，得到BP方面有672个条目，主要为信号转导、磷酸化、凋亡过程的负调控、基因表达的正调控等；CC相关的有79条，主要涉及细胞质溶胶、质膜、细胞质、核、膜；MF相关的有143条，主要涉及蛋白质结合、相同的蛋白结合、ATP结合、酶结合等。GO功能注释分别取排名前10的条目进行展示，见图4A，并绘制气泡图，见图4B。利用DAVID数据库进行通路富集分析，共富集到189条与脊蛇祛湿胶囊可能在骨质疏松症中发挥骨保护作用的通路，根据P<0.01筛选出前20项结果，并绘制气泡图，见图4C、D。其中PI3K‑Akt信号通路、MAPK信号通路、内分泌抗性、TNF信号通路、Th17细胞分化等为主要通路。

2.5.2 “活性成分‑靶点‑通路”网络构建

将中药成分、靶点、通路之间的关系绘制成“活性成分‑靶点‑通路”网络图（图5），该网络包括318个节点和1 910条边。

2.6 分子对接结果

选取Degree值最高的5个化合物（槲皮素、山柰酚、β‑谷甾醇、甘草素、汉黄芩素）分别与排名前5个重要靶点（TP53、STAT3、AKT1、SRC、JUN）进行分子对接验证网络药理学所分析的结果，结合能结果见图6。并将5个靶点分别与各药物成分的结合能排名第1位进行可视化展示（图7）。结合能值越低表明分子与靶点的结合更为紧密，形成的复合物更为稳定。因此该分子对接结果表明，关键活性成分与靶点之间均具有较强结合性，特别是与AKT1、SRC与化合物的结合能均≤-7.5 kcal/mol，预测结果可信。

2.7 两组一般资料及检验指标比较

在本研究中，对比对照组（n=81）和实验组（n=81）的人口特征。经检验，结果显示（表3）：两组患者人口特征（性别、年龄）及基线时首次所检测的PTH和25‑（OH）D₃值无统计学差异（P>0.05）；但25‑（OH）D₃末次值和Δ值在组间比较中具有统计学意义（P<0.05）；而PTH末次值及Δ值无统计学意义（P>0.05）。这说明用药方案中使用脊蛇祛湿胶囊的患者，25‑（OH）D₃的末次值和Δ值均明显高于未使用的患者。

2.8 多元回归分析结果

为了进一步验证PTH和25‑（OH）D₃的影响因素，作者采用多元回归相关检验，考虑到用药方案的多样性，先将方案采用二分类法进行分析（有脊蛇祛湿胶为1，无则为0）。见表4、5。

经分析结果表示，ΔPTH值与用药方案、性别、年龄间均不存在相关性（P>0.05）；Δ25‑（OH）D₃值与性别、年龄间均之间无相关性（P>0.05），而与用药方案存在相关性，回归分析结果中的组别系数为3.167 5（P<0.05）。这说明使用脊蛇祛湿胶囊的联合方案对25‑（OH）D₃变化影响更显著。因此，为了进一步明确用药方案对25‑（OH）D₃的影响，使用了Kruskal‑Wallis检验，但由于一些方案的样本量不足，无法进行该检验，因此分别从两组中选择使用人数前三的用药方案进行多元回归分析，具体方案见表6。

多元回归分析结果提示“脊蛇祛湿胶囊、阿法骨化醇软胶囊、碳酸钙D₃片、维生素D₂注射液”方案（P<0.05）和“脊蛇祛湿胶囊、阿法骨化醇软胶囊、碳酸钙D₃片”方案（P<0.05）对25‑（OH）D₃变化有显著正向影响。其他方案的回归系数虽为正，但未能在P<0.05的水平下达到统计显著性。此外，值得注意的是“脊蛇祛湿胶囊、碳酸钙D₃片、维生素D₂注射液”方案P值也接近显著水平。综上所述，脊蛇祛湿胶囊在RA合并OP的患者中可能具有潜在的骨保护作用，并与抗骨质疏松药物联用时可能产生协同效应。该回顾性研究是对脊蛇祛湿胶囊对骨代谢标志的初步探索，尽管一些结果达到显著水平，但为了更全面地理解这些药物以及方案对骨代谢标志物和骨形成标志物的影响，还需要进行更多的样本采集与相关通路的研究，这将有助于验证初步发现并提供更可靠的证据支持。

3 讨论

OP在中医学上可归属于“骨痿”“骨虚”“骨痹”等范畴，中医理论认为“肾主骨，生髓”，肾精充足是骨骼生长、代谢的基础。《素问·评热病论》中指出“邪之所凑，其气必虚”，RA病程漫长，久病耗血伤肾，致使骨骼失养，则出现腰膝腿软、骨骼疼痛等症，故临床上RA合并OP的患者并不少见。《难经·十四难》中亦有“五损损于骨，骨痿不能起于床”的论述，因此针对这种长期罹病之情形，中医多以扶正祛邪为原则，金乌健骨方便是代表之一。其疗效及作用机制在RA^［14］、骨关节炎^{［15，16］}等疾病中得到广泛研究。此外，黄颖等^［17］通过动物实验还发现，金乌健骨胶囊可以剂量依赖性上调GIOP模型大鼠OC、BSP、BALP及成骨相关基因Runx2、Osterix的表达，促进Shh信号相关基因表达，从而发挥靶向骨保护作用。脊蛇祛湿胶囊是在苗药金乌健骨汤的基础上加减而来，具有补益肝肾、祛风除湿、活络止痛的功效。然而脊蛇祛湿胶囊与抗骨质疏松药物的联用是否具有协同作用，目前尚无研究。

因此本研究通过网络药理学发现脊蛇祛湿胶囊中的槲皮素、山柰酚、β‑谷甾醇、甘草素和汉黄芩素是发挥骨保护作用的关键成分。有研究表明，槲皮素不仅有强大的抗氧化、抗炎作用，还能介导MAPK通路促进成骨细胞增殖^［18］、抑制破骨细胞分化^［19］，从而发挥抗骨质疏松作用。山柰酚则通过激活JNK和p38‑MAPK通路以及下调p53蛋白表达，有效减轻糖皮质激素对成骨细胞分化、细胞周期蛋白D1和Bcl‑2的抑制作用^［20］。此外，汉黄芩素能够调节NF‑κB/MAPK信号通路，改善类风湿关节炎大鼠症状，并可能通过激活AMPK/SIRT1通路促进骨折愈合^［21］。

PPI网络分析发现TP53、STAT3、AKT1等10个基因是潜在抗骨质疏松的核心靶点。分子对接结果显示前5个关键活性成分和核心靶点均具有不错的结合能力。TP53是一种编码p53蛋白的肿瘤抑制因子，与软组织肉瘤发生、发展及代谢性骨病的病因密切相关^{［22，23］}，也是激活是骨髓衰竭发病机制的核心。目前研究表明，STAT3能作为机械传导调节因子参与维持骨稳态^［24］，并且有望成为治疗运动缺乏引起的OP的潜在靶点^［25］。

通过KEGG分析显示PI3K/Akt、MAPK等信号通路可能是脊蛇祛湿胶囊在OP中发挥骨保护作用的重要通路，且GO富集分析表明信号通路主要涉及信号转导、磷酸化、凋亡过程的负调控等。PI3K/Akt信号通路在OP中是一条至关重要的信号转导途径，该通路通过生成PIP3激活下游效应分子Akt^［26］，进而抑制细胞凋亡相关蛋白BAD和Caspase‑9^{［27‑29］}，增强成骨细胞的存活。Li等^［30］发现LNC_000052这个新的长链非编码RNA及其共表达的mRNA PIK3R1，能影响PI3K/Akt信号通路的活性，进而影响骨髓间充质干细胞增殖、迁移、凋亡和成骨分化的能力。此外，MAPK信号通路可通过RANKL‑RANK激活TRAF6^［31］，进一步激活ERK、JNK和p38等下游分子，增强转录因子c‑Fos和NFATc1的表达与活性^［32］，从而促进破骨细胞分化和骨吸收，最终导致骨质疏松的发生。

为了验证网络药理学分析内容的可靠性，笔者进行了临床回顾性研究，将两次住院患者的血清骨代谢标志物浓度进行分析。经统计学分析发现，脊蛇祛湿胶囊的联合方案在RA合并OP的患者中能显著影响25‑（OH）D₃水平，其中“脊蛇祛湿胶囊、阿法骨化醇软胶囊、碳酸钙D₃片、维生素D₂注射液”的联用方案效果最显著，支持网络药理学的预测结果。PTH和25‑（OH）D₃是临床常用于评估OP病情的重要骨代谢标志物。一项实验发现，PTH可通过PI3K/Akt/STAT途径调节成骨细胞分泌RANKL^［33］，而RANKL的高度表达则会导致破骨细胞的过度活跃及骨吸收^［34］。维生素D首先在肝脏中转化为25‑（OH）D₃，再经肾脏近端小管中的1α‑羟化酶代谢成1，25（OH）₂D，后者可维持钙、磷和骨骼稳态^［35］，但该代谢过程也受PTH的调节^［36］。此外，维生素D还可通过其受体25‑（OH）D₃增加骨保护素与RANKL的比例，并激活Wnt/β‑catenin信号通路，来维持骨形成与吸收之间的平衡^［37］。

尽管研究设计和数据分析已尽量减少混杂因素的影响，但仍存在一些局限性，例如样本量较小和回顾性设计可能导致的选择偏倚，以及只采取了患者一部分骨代谢标志物作为分析指标。此外，该研究尚未排除患者可能同时使用抗风湿药物以及其他因素导致OP的干扰。因此，未来研究应纳入更多的样本和指标，并采用前瞻性设计进一步验证这些发现。

综上所述，脊蛇祛湿胶囊在RA合并OP的患者中可能存在潜在的骨保护作用，并与抗骨质疏松药物联用时可能产生协同效应，具体机制还需更进一步研究。

作者贡献度说明：

季诗煜：设计实验方案、收集实验数据、分析数据、文章撰写；黄春霞、袁雪梅、罗丰：分析数据、查阅文献；王秋燚、马武开、姚血明：指导、修改论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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