六味地黄丸调控星形胶质细胞A1/A2极化促进髓鞘再生的作用及机制研究

The efficacy and mechanism of Liuwei Dihuang Pill in regulating the A1/A2 polarization of astrocytes and promoting myelin regeneration

摘要

目的 探讨六位地黄丸促进多发性硬化髓鞘再生的作用和机制。 方法 60只C57BL/6J小鼠，随机分为正常组、模型组、芬戈莫德组和六味地黄丸低、中、高剂量组，每组10只。模型组和给药组小鼠通过喂养含0.2%双环己酮草酰二腙的饲料5周来诱导脱髓鞘，从第6周开始恢复正常饮食，同时给药组小鼠进行灌胃给药，直至第8周末取材。经快蓝染色观察有髓面积变化；免疫组化测定髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein， MBP）的表达，观察髓鞘再生情况；免疫荧光法测定星形胶质细胞A1/A2极化标志物，观察该方对A1/A2极化的调节作用；ELISA法检测细胞因子IL‑1α、TNF‑α的表达；Western blot检测小鼠脑组织中MBP、C3、S100A10、p65和p‑p65蛋白的表达。 结果 六味地黄丸灌胃后，小鼠脑组织的髓鞘LFB染色增加，MBP表达增多（P<0.01），NF‑κB信号通路关键蛋白p65、p‑p65及相关细胞因子TNF‑α和IL‑1α的表达减少（P<0.05），AST向A1方向极化减少，C3表达减少；AST向A2方向极化增多，S100A10表达增多。 结论 六味地黄丸可能通过调控NF⁃κB信号通路及相关细胞因子，明显减轻神经炎症，介导A1/A2极化，促进多发性硬化髓鞘再生。

Abstract

Objective To explore the efficacy and mechanism of Liuwei Dihuang Pills in promoting remyelination in multiple sclerosis. Methods A total of sixty C57BL/6J mice were randomly divided into the normal control group， the model group， the Fingolimod group and the Liuwei Dihuang Pill low‑dose， medium‑dose and high‑dose groups， with 10 mice in each group. The mice in the model group and the drug group were fed with a diet containing 0.2% dicyclohexanone oxalyl dihydrazone for 5 weeks to induce demyelination. From the 6th week onwards， the normal diet was resumed. Meanwhile， the mice in the treatment group were given intragastric administration of the drug until the end of the 8th week when samples were collected. The luxol fast blue staining observation myelinated area of change； Immunohistochemical determination of the expression of myelin basic protein （MBP）， observe the myelin regeneration； Immunofluorescence determination of astrocyte A1/A2 polarization markers， observe the party works for the regulation of A1/A2 polarization； ELISA method to detect the corresponding cytokine IL‑1α and TNF‑α. Western blot was used to detect the expression of MBP， C3， S100A10， p65 and p‑p65 proteins in mice brain tissues. Results After gavage administration of Liuwei Dihuang Pill， the myelin sheath LFB staining and MBP expression of mouse brain tissue increased （P<0.01）. The expressions of key proteins p65 and p‑p65 and related cytokines TNF‑α and IL‑1α in the NF‑κB signaling pathway were decreased （P<0.05）. AST polarization towards A1 is reduced， and C3 expression is reduced. The polarization of AST in the direction of A2 increased， and the expression of S100A10 increased. Conclusion Liuwei Dihuang Pill may significantly alleviate neuroinflammation， mediate A1/A2 polarization， and promote remyelination in multiple sclerosis by regulating the NF⁃κB signaling pathway and related cytokines.

Graphical abstract

关键词

六味地黄丸 / 多发性硬化 / 髓鞘再生 / 星形胶质细胞 / NF‑κB信号通路

Key words

Liuwei Dihuang Pill / Multiple sclerosis / Remylination / Astrocytes / NF‑κB signaling pathway

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统（central nervous system，CNS）的炎性脱髓鞘性疾病^［1］。研究发现，MS病变部位的髓鞘再生不足导致严重的神经功能障碍^［2］，而髓鞘再生失败是由多种因素共同造成的，星形胶质细胞（astrocyte，AST）的过度极化就是其中一种^［3］。CNS炎症因子可以诱导AST极化成A1型和A2型2个表型^［4］，A1型AST会抑制突触的形成，同时分泌神经毒素诱导神经元和少突胶质细胞迅速死亡，在各种人类神经退行性疾病中含量丰富，包括MS^［5］。与之相反，A2型AST可以上调许多神经营养因子的基因表达，促进神经元的存活、生长和分化^［6］。如何促进MS病变部位的髓鞘再生对MS的治疗具有重要的意义，目前现代医学仍没有完全安全有效的治疗手段，而中医药在这方面具有潜在的优势，研究发现多种补肾药物及其有效成分有促进髓鞘再生的作用^［7］。

现代中医将MS归为“骨痿”^［8］，临床数据显示MS患者中肝肾阴虚者占比最高^［9］。《素问·痿论》云“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”。六味地黄丸是滋阴补肾的代表性方剂，肾主骨生髓，补肾可使脑髓得充，进而促进髓鞘再生。目前有研究表明该方对MS有一定的治疗效果，但其具体作用机制有待进一步研究。故本研究旨在阐述六味地黄丸介导星形胶质细胞A1/A2活化对损伤髓鞘的多靶点再生修复机制，为解决髓鞘再生这一难治环节提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级C57BL/6J雌性小鼠60只，6~8周龄，体重16~18 g，饲养于武汉华联科生物技术有限公司SPF级国家标准实验室［SYXK（鄂）2023‑0104］，采用标准的SPF级饲养条件温度（22±3）℃、湿度40%~50%以及标准的啮齿动物固体食物和水源。动物实验方案通过武汉华联科生物技术有限公司动物伦理委员会审核批准（伦理审批号：HLK‑202040122‑002）。

1.2 试剂

实验用抗体：C3抗体（Abcam，AB97462‑1001）、S100A10（Immunoway，YT4198）、MBP（武汉三鹰，10458‑1‑AP）、p‑p65（武汉三鹰，80379‑2‑RR）、p65（江苏亲科，AF5006#6*2）、GAPDH（江苏亲科，AF7021#6*2）等。相应荧光标记的IgG抗体：Alexa Fluor 488驴抗兔或小鼠IgG（1∶200）、Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（1∶200）购自英国Abcam公司提供，IL1‑α/TNF‑α ELISA试剂盒购自亚诺法生科技股份有限公司（Abnova）。

1.3 药品

六味地黄丸口服液由熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮六味药物组成，购自黄山市天目药业有限公司，批准文号：国药准字Z10900014。盐酸芬戈莫德（货号：FTY‑720）购自美国新泽西州Med Cham Express（MCE）公司，双环己酮草酰二腙（cuprizone，CPZ）（货号：C9012）购买自美国密苏里州Sigma公司。

1.4 造模与给药

将60只C57BL/6J雌性小鼠（6~8周龄）适应性饲养3 d后随机分成6组：正常对照（normal control，NC）组、模型（model，MO）组及六味地黄丸低、中、高剂量（LWDH‑L/M/H）组和芬戈莫德（FTY）组，每组10只。NC组小鼠给予正常饲料，其余5组小鼠给予含0.2%CPZ的特殊饲料5周制备脱髓鞘小鼠模型，从第6周开始恢复正常饮食3周，模拟脱髓鞘小鼠髓鞘再生的过程^［10］；同时给药组小鼠进行灌胃给药，六味地黄组小鼠的用药剂量分别为1.3、2.6、5.2 mL/kg，芬戈莫德组给药量为1 mg/kg，NC和MO组均灌胃等体积生理盐水，至第8周末结束实验，取材。

1.5 样本采集

取材前12 h禁食不禁水，用3%戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，暴露其心脏，快速灌注约20 mL的常温生理盐水，直到体外循环流出的液体成粉色，肝脏、舌头、四肢颜色变白后，将生理盐水换成预冷的4%的多聚甲醛溶液，取出灌流后的完整的脑组织，进一步固定、脱水、透明和石蜡包埋切片处理，切片时定位至胼胝体部位进行冠状切片，每张切片的厚度为5 μm。

1.6 检测指标

1.6.1 快蓝染色（the luxol fast blue staining，LFB）法

将石蜡切片烘烤脱蜡至水，然后用髓鞘染色试剂染色后，将切片进行背景分化，复染伊红35 min，最后脱水封片，利用Pannoramic SCAN数字切片扫描仪及其分析软件获得图像，用ImageJ图像分析软件测定积分光密度（integralopticaldensity，IOD）值。

1.6.2 免疫组化

切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗脱至水，置入pH7.4的PBS缓冲液中，在脱色摇床上清洗4次，每次5 min，用3%的双氧水阻断内源性过氧化物酶，滴加3%的牛血清蛋白（BSA），室温孵育30 min封闭非特异位点，加入一抗（MBP）与切片中的目标抗原充分结合，4 ℃孵育过夜，pH7.4的PBS清洗，加入对应的二抗，室温孵育50 min，再次清洗后滴加新配置的DAB显色液，反复观察细胞结构呈现棕黄色阳性反应，将切片放入苏木素溶液中复染3 min，使细胞核呈蓝紫色，最后进行脱水封片，利用Pannoramic SCAN数字切片扫描仪及其分析软件获得图像，用ImageJ测定IOD值。

1.6.3 免疫荧光双标法

切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇洗脱至水，磷酸盐缓冲液冲洗。放入柠檬酸缓冲液，共同加热至沸腾，后维持加热20 min，室温冷却至35 ℃以下，磷酸盐缓冲液冲洗。10%羊血清37 ℃封闭2 h。封闭后滴加标记一抗（C3/GFAP、S100A10/GFAP等）稀释液，4 ℃孵育48 h，37 ℃复温1 h，冲洗后加入相应荧光二抗，37 ℃孵育2 h，DAPI封片，激光共聚焦显微镜下观察，用ImageJ测定IOD值。

1.6.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞因子IL‑1α、TNF‑α的表达

根据说明书要求分别设定空白孔、标准孔和样品孔。于各孔中分别加入稀释好的标准品和待测样品50 μL，所有孔内加入含生物素标记的抗体50 μL，避光于37 ℃水浴箱温育1 h，随后弃去液体，加入洗涤液洗涤，后每孔加入亲和链酶素HRP 80 μL于37 ℃水浴箱温育30 min，洗涤液30 s洗涤3次^［11］。每孔加入底物A、B各50 μL避光于37 ℃水浴箱温育10 min.加入终止液50 μL，在酶标仪上波长设置450 nm测量每孔吸光度，计算IL‑1α、TNF‑α水平。

1.6.5 Western blot检测

提取小鼠脑组织蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒检测样本蛋白浓度。加入等量5×蛋白上样缓冲液于沸水水浴30 min使蛋白变性。总蛋白经10%SDS‑PAGE电泳，转移到PVDF膜，室温封闭1 h，分别加入C3（1∶1 000）、S100A10（1∶1 000）、MBP（1∶2 000）、p‑p65（1∶2 000）、p65（1∶1 000），4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次，10 min/次，用HRP标记的山羊抗兔（1∶10 000）室温孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次后，ELC发光液进行化学发光显影，应用Bio‑Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统获取蛋白条带，ImageJ处理图片读取条带灰度值，半定量分析蛋白表达。

1.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 9软件数据进行处理，计量资料用\overline{x}\pm s表示。组间比较若为正态性分布且方差齐时采用ANOVA分析和Tukey法的HSD多重比较测试进行统计分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 六味地黄丸可以促进脱髓鞘小鼠体重恢复

实验结果显示，NC组小鼠的体重随着时间推移而缓慢持续升高，而MO组的小鼠在给予含0.2% CPZ的饲料后，体重明显下降。第6周换成正常饲料后，NC组小鼠的体重持续增加，MO组小鼠体重也有所回升，但较NC组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。LWDH‑L、M、H组及FTY组小鼠较MO组相比，体重增长速度均明显加快，差异具有统计学意义（P<0.05）；其中，LWDH‑M、H组的效果较好，与FTY组无明显差异，见图1。

2.2 六味地黄丸可以减少小鼠胼胝体部位髓鞘脱失、促进髓鞘修复

小鼠摄入CPZ可诱发脑白质许多区域的广泛脱髓鞘^［12］。为了评估脱髓鞘病变中髓鞘的脱失、修复程度，对白质区域中外侧胼胝体（lateral corpus callosum，Lat‑CC）和内侧胼胝体（medial corpus callosum，Med‑CC）的组织学变化进行研究，应用LFB髓鞘染色可以显示出小鼠大脑中神经组织的髓鞘结构^［13］。本次染色结果中，NC组小鼠大脑胼胝体部位髓鞘着色均匀，结构有序完整；而MO组小鼠Med‑CC、Lat‑CC部位阳性髓鞘均染色明显减少，染色稀疏，斑块缺失。FTY组及LWDH‑L、M、H组小鼠Med‑CC、Lat‑CC部位均存在一定程度的阳性染色较稀疏、髓鞘脱失的现象，但均相对于MO组较轻，其中LWDH‑H组治疗效果最佳，见图2、表1。

MBP是一种在CNS的髓鞘中丰富的蛋白质，参与髓鞘的形成和长期维护^［14］。在MS发病时，患者的免疫系统可能会错误地攻击了MBP蛋白，导致髓鞘的破坏。

本次免疫组化结果发现，MO组中两个胼胝体部位MBP表达较NC组均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），但经过FTY和LWDH‑L、LWDH‑M、LWDH‑H治疗后，小鼠脑组织中MBP表达明显升高，在Med‑CC部位中MO组与LWDH‑M组、LWDH‑H组和FTY组有明显差异（P<0.05），在Lat‑CC部位中MO组、LWDH‑H组和FTY组有明显差异（P<0.05），见图2、表2。Western blot结果显示，MO组小鼠脑组织中MBP表达量较NC组明显下降，而在FTY和LWDH‑L、LWDH‑M、LWDH‑H组中均升高，差异具有统计学意义（P<0.05），见图3、表3。

2.3 六味地黄丸调控A1/A2极化，减少AST向A1方向、促进向A2方向极化

GFAP是AST的特异性标记物。AST在MS免疫炎症的早期阶段参与了抵抗、抑制炎症反应的第一道防线^{［15，16］}。当CNS损伤时，AST响应不同的胞外信号刺激，会活化成A1/A2两种不同的形态。A1特异性表达C3抗原，诱发神经元和少突胶质细胞的死亡，抑制了MS髓鞘的再生^［17］。相反地，A2特异性表达S100A10蛋白，上调可能与神经保护相关的因子^［18］。研究证明，反应性AST具有一定程度的可塑性，能够在幼稚、反应性胶质瘢痕形成状态之间进行形态学和功能的转变^［19］。

本次免疫组织荧光结果发现，MO组小鼠与NC小鼠相比，胼胝体部位C3、GFAP的表达明显增加，说明大量反应性AST细胞堆积在脱髓鞘损伤部位，且向A1形态活化。芬戈莫德和不同剂量的六味地黄丸给药后均能在一定程度上下调C3⁺/GFAP⁺的表达，减少AST向A1方向极化；相反地，与MO组相比，芬戈莫德和不同剂量的六味地黄丸给药后均能在一定程度上增加S100A10⁺/GFAP⁺的表达，促进AST向A2方向极化。其中LWDH‑H组治疗效果最佳（P<0.05），见图3、表4。Western blot检测结果同样证明了这一点，见图3，表3。

2.4 六味地黄丸抑制细胞因子TNF‑α和IL‑1α的表达和NF‑κB通路的激活

肿瘤坏死因子TNF‑α和IL‑1α在炎症反应中起到核心作用^{［20，21］}。在MS中，激活的神经炎性小胶质细胞会分泌IL‑1α、TNF‑α，诱导大量的AST活化为A1，在MS的病理生理过程中起着关键作用^{［22，23］}。同时，TNF‑α和IL‑1也能通过激活NF‑κB信号通路来调节细胞的炎症反应，形成正反馈^［24］。在炎症反应中，经典NF‑κB通路的激活是一个快速且短暂的过程，它能够迅速诱导促炎因子的产生^［25］，进一步加重神经炎症。

本次ELISA结果发现，MO组小鼠与NC组相比，TNF‑α和IL‑1α表达均明显增加（P<0.05），经FTY和LWDH‑L/M/H治疗后TNF‑α和IL‑1α表达均明显降低，见表5。Western blot结果显示，FTY组、LWDH‑L/M/H组p65、p‑p65表达量均较MO组降低，六味地黄丸可以抑制NF‑κB通路中的p65、p‑p65的表达，从而减少TNF‑α和IL‑1α的分泌，抑制AST活化为A1，其中LWDH‑H组的效果最为明显，见图4、表6。同时，p‑p65/p65的比值并无统计学意义（P>0.05），说明药物作用可能仅调控转录水平，而非磷酸化修饰，见表6。

3 讨论

脱髓鞘疾病是一种神经系统疾病，其特征在于轴突变性相关的炎症和髓磷脂的破坏，髓磷脂破坏的原因有多种，包括免疫炎症反应，化学物质和感染^［26］。MS与脱髓鞘导致的局灶性白质斑块相关，在脱髓鞘过程中存在部分髓鞘修复，但髓鞘修复并不完全^［27］。因此，髓鞘再生是治疗MS的神经保护和再生的关键要素。

六味地黄丸是补肾经典名方，研究显示具有抗氧化、抗炎等多种效应^{［28，29］}。在神经保护方面，被证明可以减轻多种神经损伤^［30］，这对于治疗神经系统疾病具有重要意义。

本研究通过CPZ诱导小鼠成熟少突胶质细胞的凋亡和星形胶质细胞增生、下调髓磷脂基因，最终导致脱髓鞘病变结果^［31］。通过LFB染色观察小鼠病变部位的髓鞘染色情况，苏木素染色观察小鼠胼胝体部位MBP的表达，评估了六味地黄丸对脱髓鞘小鼠的神经保护作用，结果显示六味地黄丸能明显减轻髓鞘脱失，促进病变部位MBP的表达及髓鞘再生。

为了进一步探究六位地黄丸促进小鼠髓鞘再生的机制，运用免疫荧光技术观察小鼠脑组织中C3⁺/GFAP⁺和S100A10⁺/GFAP⁺的表达情况，结果显示，六味地黄丸一定程度上可以减少AST向A1极化从而减轻神经炎症，并促进AST向A2极化促进髓鞘修复。

在MS中，NF‑κB通路发生变化，可能对MS发病机制中起关键作用，芬戈莫德就被证明可以减少NF‑κB通路的表达和TNF‑α信号传导，从而治疗MS^［32］。同时，研究发现，在原代AST实验中，可以通过抑制NF‑κB信号通路的激活来发挥抗炎作用，从而抑制A1的活化^［33］。而p65在NF‑κB信号通路中起着核心作用，调节炎症因子的表达和细胞的炎症反应^［34］。TNF‑α或IL‑1α诱导的p65核转录的减少可能导致细胞中NF‑κB转录激活的降低^［35］。本研究中，六味地黄丸同样具有减少NF‑κB通路中p65、p‑p65的表达的作用，抑制A1表型活化。六味地黄丸还可以减少小鼠脑组织中的TNF‑α、IL‑1α水平，抑制A1的活化。

综上所述，笔者认为六味地黄丸可以作为一种有效的神经保护剂，用于治疗MS，可能通过调控NF‑κB信号通路，介导AST的A1/A2极化，促进髓鞘再生，但深入的机制仍待进一步探索。

作者贡献度说明：

来林、赵佳豪：完成实验和撰写论文；张利：数据统计分析和图像处理；孙雅琴、柳琳：实验方案设计和论文指导；曹秋实、李德顺：研究的可行性分析和文章审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] Pegoretti V， Swanson KA， Bethea JR， et al. Inflammation and oxidative stress in multiple sclerosis： Consequences for therapy development［J］. Oxid Med Cell Longev， 2020，2020： 7191080.

[2] Baecher‑Allan C， Kaskow BJ， Weiner HL. Multiple sclerosis： Mechanisms and immunotherapy［J］. Neuron， 2018，97（4）： 742‑768.

[3] Ohtake Y， Li S. Molecular mechanisms of scar‑sourced axon growth inhibitors［J］. Brain Res， 2015，1619： 22‑35.

[4] Lee HG， Wheeler MA， Quintana FJ. Function and therapeutic value of astrocytes in neurological diseases［J］. Nat Rev Drug Discov， 2022，21（5）： 339‑358.

[5] Liddelow SA， Guttenplan KA， Clarke LE， et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia［J］. Nature， 2017，541（7638）： 481‑487.

[6] Kowianski P， Lietzau G， Czuba E， et al. BDNF： A key factor with multipotent impact on brain signaling and synaptic plasticity［J］. Cell Mol Neurobiol， 2018，38（3）： 579‑593.

[7] Zha Z， Liu YJ， Liu SS， et al. Bu Shen Yi Sui Capsule promotes myelin repair by modulating the transformation of A1/A2 reactive astrocytes in vivo and in vitro ［J］. Oxid Med Cell Longev， 2022，2022： 3800004.

[8] 赵雪松， 樊永平， 杨涛， 等. 补肾益髓方对复发缓解型多发性硬化患者睡眠及生命质量的影响［J］. 世界中医药， 2020，15（12）： 1762‑1765.

[9] Zhao XS， Fan YP， Yang T . et al. Effects of Bushen Yisui Formula on sleep and quality of life in patients with relapsing‑remitting multiple sclerosis ［J］ World Chin Med， 2020，15（12）： 1762‑1765.

[10] 樊永平， 王少卿. 多发性硬化/视神经脊髓炎中医临床诊疗规范［J］. 首都医科大学学报， 2018，39（6）： 833‑835.

[11] Fan YP， Wang SQ. Standard for clinical diagnosis and treatment of traditional Chinese medicine for multiple sclerosis/neuromyelitis optica［J］. J Cap Med Univ， 2018， 39（6）： 833‑835.

[12] Li YR， Sun MY， Hang W， et al. Wuzi Yanzong Pill relieves CPZ‑induced demyelination by improving the microenvironment in the brain［J］. Heliyon， 2022，8（12）： e12277.

[13] 王智民， 杨潇， 陈怡然， 等. 基于NLRP3/Caspase‑1/GSDMD通路探讨补中益气汤干预NOD.H‑2^h4小鼠AIT细胞焦亡的机制［J］. 中国实验方剂学杂志， 2024，30（12）： 8‑15.

[14] Wang ZM， Yang X， Chen YR， et al. Mechanism of Buzhong Yiqitang Intervening in pyroptosis of AIT in NOD.H‑2^h4 mice based on NLRP3/Caspase‑1/GSDMD pathway ［J］. Chin J Exp Tradit Med Formulae， 2024，30（12）： 8‑15.

[15] 雷楚， 黄嘉璐， 陈昊炜， 等. 双环己酮草酰二腙诱导脱髓鞘模型小鼠情绪及神经递质的变化［J］. 第三军医大学学报， 2016，38（11）： 1263‑1269.

[16] Lei C， Huang JL， Chen HW， et al. Correlation between emotional changes and neurotransmitters in cuprizone‑induced demyelination mice［J］. J Third Mil Med Univ， 2016， 38（11）： 1263‑1269.

[17] Nack A， Brendel M， Nedelcu J， et al. Expression of translocator protein and ［18F］‑GE180 ligand uptake in multiple sclerosis animal models［J］. Cells， 2019，8（2）：94.

[18] Martinsen V， Kursula P. Multiple sclerosis and myelin basic protein： Insights into protein disorder and disease［J］. Amino Acids， 2022，54（1）： 99‑109.

[19] Brosnan CF， Raine CS. The astrocyte in multiple sclerosis revisited［J］. Glia， 2013，61（4）： 453‑465.

[20] Ponath G， Ramanan S， Mubarak M， et al. Myelin phagocytosis by astrocytes after myelin damage promotes lesion pathology［J］. Brain， 2017，140（2）： 399‑413.

[21] Barmpagiannos K， Theotokis P， Petratos S， et al. The diversity of astrocyte activation during multiple sclerosis： Potential cellular targets for novel disease modifying therapeutics［J］. Healthcare （Basel）， 2023，11（11）：1585.

[22] Linnerbauer M， Rothhammer V. Protective functions of reactive astrocytes following central nervous system insult［J］. Front Immunol， 2020，11： 573256.

[23] Mcginley MP， Goldschmidt CH， Rae‑Grant AD. Diagnosis and treatment of multiple sclerosis： A review［J］. JAMA， 2021，325（8）： 765‑779.

[24] Rauf A， Badoni H， Abu‑Izneid T， et al. Neuroinflammatory markers： Key indicators in the pathology of neurodegenerative diseases［J］. Molecules， 2022，27（10） ：3194.

[25] van LOO G， Bertrand M. Death by TNF： A road to inflammation［J］. Nat Rev Immunol， 2023，23（5）： 289‑303.

[26] Avsar T， Celikyapi EG， Terzioglu G， et al. Investigation of neuro‑inflammatory parameters in a cuprizone induced mouse model of multiple sclerosis［J］. Turk J Biol， 2021，45（5）： 644‑655.

[27] Hyvarinen T， Hagman S， Ristola M， et al. Co‑stimulation with IL‑1beta and TNF‑alpha induces an inflammatory reactive astrocyte phenotype with neurosupportive characteristics in a human pluripotent stem cell model system［J］. Sci Rep， 2019，9（1）： 16944.

[28] Lawrence T. The nuclear factor NF‑kappaB pathway in inflammation［J］. Cold Spring Harb Perspect Biol， 2009，1（6）： a001651.

[29] Yu H， Lin L， Zhang Z， et al. Targeting NF‑kappaB pathway for the therapy of diseases： Mechanism and clinical study［J］. Signal Transduct Target Ther， 2020，5（1）： 209.

[30] Torre‑Fuentes L， Moreno‑Jimenez L， Pytel V， et al. Experimental models of demyelination and remyelination［J］. Neurologia （Engl Ed）， 2020，35（1）： 32‑39.

[31] Goldschmidt T， Antel J， Konig FB， et al. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity［J］. Neurology， 2009，72（22）： 1914‑1921.

[32] 王旭， 陈诗琦， 张翔， 等. 六味地黄丸临床应用进展［J］. 中国现代医生， 2023，61（20）： 126‑130.

[33] Wang X， Chen SQ， Zhang X， et al. Research progress of traditional Chinese medicine in promoting remyelination of multiple sclerosis ［J］. China Mod Doct， 2023，61（20）： 126‑130.

[34] Zeng J， Cheng B， Huang Y， et al. Active fraction combination from Liuwei Dihuang Decoction （LW‑AFC） alleviated the LPS‑induced long‑term potentiation impairment and glial cells activation in hippocampus of mice by modulating immune responses［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2019，2019： 3040972.

[35] 张雪， 佟玉良， 夏天利， 等. 六味地黄丸入血、入脑成分分析［J］. 中成药， 2023，45（11）： 3534‑3539.

[36] Zhang X， Tong YL， Xia TL， et al. Analysis of components migrating to blood and brain in Liuwei Dihuang Pills ［J］. Chin Tradit Pat Med， 2023，45（11）： 3534‑3539.

[37] Varhaug KN， Krakenes T， Alme MN， et al. Mitochondrial complex Ⅳ is lost in neurons in the cuprizone mouse model［J］. Mitochondrion， 2020，50： 58‑62.

[38] Leibowitz SM， Yan J. NF‑kappaB pathways in the pathogenesis of multiple sclerosis and the therapeutic implications［J］. Front Mol Neurosci， 2016，9： 84.

[39] Linnerbauer M， Wheeler MA， Quintana FJ. Astrocyte crosstalk in CNS inflammation［J］. Neuron， 2020，108（4）： 608‑622.

[40] Mockenhaupt K， Gonsiewski A， Kordula T. RelB and Neuroinflammation［J］. Cells， 2021，10（7）：1609.

[41] Prescott JA， Balmanno K， Mitchell JP， et al. IKKalpha plays a major role in canonical NF‑kappaB signalling in colorectal cells［J］. Biochem J， 2022，479（3）： 305‑325.

基金资助

国家自然科学基金(82305079)

湖北中医药大学2022年度“青苗计划”项目(2022ZZXQ010)

湖北中医药大学2022年度博士科研启动经费资助项目(2022ZZXB004)