五味子乙素通过抑制Nrf2/GPX4通路介导的铁死亡减轻脓毒症小鼠心肌损伤

Mechanistic study of Schisandrin B alleviating myocardial injury in septic mice by inhibiting ferroptosis via activation of the Nrf2/GPX4 axis

摘要

目的 探索五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）对脓毒症诱导的心肌功能障碍（sepsis‑induced myocardial dysfunction，SIMD）的保护作用及其具体的作用机制。 方法 将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组（CON组）、脓毒症组（10 mg/kg，LPS组）、LPS+Sch B低剂量（20 mg/kg）组（Sch B‑L组）、LPS+Sch B高剂量（40 mg/kg）组（Sch B‑H组）、LPS+Sch B（40 mg/kg）+Nrf2抑制剂ML385（30 mg/kg）组（ML385组），每组各6只，采用LPS腹腔注射构建脓毒症小鼠模型。所有小鼠在造模24 h后进行心脏超声检查，随后对心脏取材并收集相关样本。采用H&E染色评估小鼠心肌组织的病理学组织改变，ELISA检测血清CK‑MB、cTnI、IL‑1β、TNF‑α的含量，相关试剂盒测定心肌组织MDA、GSH、SOD、Fe²⁺水平，免疫组化、Western blot及RT‑qPCR检测心肌组织中GPX4、Nrf2、SLC7A11、FTH1、ACSL4的表达情况。 结果 与CON组相比，LPS组LVEF、LVFS明显降低，CK‑MB、cTnI、IL‑1β、TNF‑α水平明显增加，H&E染色中可观察到心肌细胞排列紊乱、组织内间隙增宽、水肿以及较多炎性细胞浸润。而给予Sch B预处理的小鼠未见明显的心肌损伤，且心肌组织中MDA、Fe²⁺水平降低、GSH、SOD水平升高，GPX4、SLC7A11、Nrf2、FTH1蛋白表达以及GPX4、SLC7A11 mRNA含量较LPS组增加，ACSL4水平较LPS组下降。与LPS+Sch B高剂量组相比，Nrf2抑制剂组逆转了Sch B的保护作用，加重心肌细胞损伤及铁死亡程度。 结论 五味子乙素通过减轻铁死亡来缓解LPS诱导的脓毒症小鼠心肌功能障碍，其机制可能与Nrf2/GPX4通路的激活相关。

Abstract

Objective To explore the protective effect of Schisandrin B （Sch B） on sepsis‑induced myocardial dysfunction （SIMD） and its specific mechanism of action. Methods A total of thirty male C57BL/6J mice were randomly divided into the control group （CON group）， the Sepsis group （10 mg/kg LPS group）， the LPS+Sch B with low‑dose administration （20 mg/kg） group （Sch B‑L group）， the LPS+Sch B with high‑dose administration （40 mg/kg） group （Sch B‑H group）and the LPS+Sch B （40 mg/kg）+Nrf2 inhibitor ML385 （30 mg/kg） group （ML385 group）， with 6 mice in each group， and were treated by intraperitoneal injection of LPS to construct the sepsis mouse model. All mice underwent cardiac ultrasonography 24 h after modelling， followed by heart sampling and collection of relevant samples. H&E staining was used to evaluate the pathological tissue changes in myocardial tissues of mice， ELISA was used to detect the levels of serum CK‑MB， cTnI， IL‑1β， and TNF‑α； and relevant kits were used to determine the levels of MDA， GSH， SOD， and Fe²⁺ in myocardial tissues； and immunohistochemistry， Western blotting， and RT‑qPCR were used to detect the expression of GPX4， Nrf2， SLC7A11， FTH1， ACSL4 in tissues. Results Compared to the CON group， LVEF and LVFS in the LPS group were significantly lower， the levels of CK‑MB， cTnI， IL‑1β， and TNF‑α were significantly increased； and disturbed arrangement of cardiomyocytes， widening of intra‑tissue gaps， oedema， and a higher inflammatory cell infiltration could be observed in H&E staining. In contrast， mice pretreated with Sch B did not show obvious myocardial injury， and the levels of MDA and Fe²⁺ in myocardial tissues were reduced， the levels of GSH and SOD were increased， the protein expression of GPX4， SLC7A11， Nrf2 and FTH1， and the mRNA content of GPX4 and SLC7A11 were increased， and the level of ACSL4 was decreased compared to that of the LPS group. The Nrf2 inhibitor group reversed the protective effect of Schisandra chinensis ethanol and aggravated the degree of cardiomyocyte injury and ferroptosis compared to the Chinese medicine group. Conclusion Schisandrin B alleviated LPS‑induced myocardial dysfunction in mice by attenuating ferroptosis， and its mechanism may be related to the activation of Nrf2/GPX4 pathway.

Graphical abstract

关键词

五味子乙素 / 脓毒症心肌损伤 / 铁死亡 / 核因子E2相关因子2（Nrf2） / 谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）

Key words

Schisandrin B / Sepsis‑induced myocardial injury / Ferroptosis / Nuclear factor E2 related factor 2 （Nrf2） / Glutathione peroxidase 4 （GPX4）

脓毒症是一种由感染引起的全身性炎症反应疾病，作为影响全球数百万人的感染性疾病，受到大众广泛关注^［1，2］。脓毒症诱发的心肌功能障碍（sepsis‑induced myocardial dysfunction，SIMD）是脓毒症患者的最常见并发症之一，约有一半的脓毒症患者表现出心肌功能障碍的体征^［3］。SIMD的病理机制复杂且多因素，可能与血流动力学、心肌能量代谢紊乱、氧自由基、心肌抑制剂和心肌细胞死亡等因素相关。然而，脓毒症诱发心脏损伤的机制仍不明确，且现有的临床治疗手段效果有限，因此，探究SIMD的发病机制和寻找新的治疗靶点显得尤为重要。

铁死亡作为一种新型的程序性细胞死亡，其表现形式与细胞凋亡、焦亡和自噬等细胞程序性死亡形式有所不同，主要由铁稳态失衡和脂质过氧化引发^［4］，与心肌梗死、心力衰竭、糖尿病心肌病以及心肌缺血再灌注等多种心血管方面相关疾病有关^［5］。大量研究发现，Nrf2几乎能够调节所有与铁死亡相关的基因，其中GPX4作为铁死亡发生机制的经典分子常和Nrf2共同研究^［6］，Nrf2/GPX4能够在神经疾病、脓毒症脏器损伤等疾病中调节铁死亡^［7‑9］，但其在脓毒症心肌损伤中的作用尚不明确。

五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是从中药五味子中提取出的二苯并环辛二烯衍生物，它具有抗炎症与减轻氧化应激、保护血管内皮、调节血脂等有益的药理作用。Ji等^［10］研究发现，五味子乙素能够通过下调miR‑17‑5p减轻LPS诱导的脓毒症炎症反应。Zhu等^［11］研究证实，五味子乙素通过靶向MyD88防止LPS诱导的炎症性肺损伤。尽管五味子乙素在脓毒症和肺损伤中表现出一定的疗效，但其对脓毒症引发的心肌损伤的作用尚不明确。且通过文献查阅发现，五味子乙素能够调节糖尿病心肌病^［12］、非酒精性脂肪性肝病^［13］、肝癌^［14］、肠缺血再灌注^［15］中的铁死亡，但其在脓毒症心肌病中的作用仍未明确。基于此本研究拟通过构建脓毒症小鼠心肌功能障碍模型，探究脂多糖（LPS）诱导下的心肌细胞铁死亡，观察Sch B干预对脓毒症小鼠心肌功能的影响，并从Nrf2/GPX4介导的铁死亡角度探讨其可能的作用机制，旨在为Sch B治疗SIMD提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

动物护理和实验程序按照《中华人民共和国卫生部动物管理办法》（2001年第55号文）规定的指导方针进行。自济南朋悦实验动物繁育有限公司采购雄性C57BL/6J小鼠并于山东第一医科大学附属省立医院动物中心饲养，将小鼠置于恒温（24±2）℃和恒湿50%~60%条件下，明暗循环环境中，可自由获得标准啮齿动物食物和水。本实验通过山东省立医院动物伦理委员会审查（伦理批准号：NO.2023‑91）。

1.1.2 药物及主要试剂

五味子乙素（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21327），LPS、MDA试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，批号分别为：L8880、BC0025），ML385（MedChemExpress，批号：HY‑100523），GSH检测试剂盒（武汉赛维尔生物科技有公司，批号：G4304），组织铁检测试剂盒、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：A039‑2‑1、A003‑1）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及造模

待1周适应性喂养结束，将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分组，具体分为：对照组（CON组）、脓毒症组（10 mg/kg，LPS组）、LPS+Sch B低剂量（20 mg/kg）组（Sch B‑L组）、LPS+Sch B高剂量（40 mg/kg）组（Sch B‑H组）、LPS+Sch B（40 mg/kg）+Nrf2抑制剂ML385（30 mg/kg）组（ML385组）。

依据预实验结果及前人研究^{［10，11，16］}，最终确定五味子乙素的浓度为20 mg/kg和40 mg/kg，并在构建模型前12 h给予五味子乙素腹腔注射。ML385组在五味子乙素注射后8 h给予ML385腹腔注射。依照参考文献［17‑19］介绍的方法在体内制备脓毒性心肌损伤小鼠模型，LPS组、Sch B‑L组、Sch B‑H组、ML385组以LPS（10 mg/kg）腹腔注射构建小鼠脓毒症模型，造模时左手抓持小鼠暴露腹部，右手持注射器吸取定量LPS，在腹中线旁开1 cm左右处，针尖斜45°进针匀速完成注射，CON组注射等量生理盐水。随后，依据《脓毒性心肌病中西医结合诊治专家共识》^［20］检测小鼠心肌损伤标志物水平以及心脏彩超征象，鉴定其造模是否成功。

1.2.2 心功能测定

腹腔注射LPS 24 h后，麻醉小鼠，麻醉成功后使用脱毛膏在小鼠靠近心脏皮肤处脱毛，使用VEVO770成像系统（Visual Sonics， Toronto， Canada）采集超声心动图，通过左室短轴缩短率（LVFS）和射血分数（LVEF）评价各组心功能的不同。

1.2.3 ELISA检测血清CK‑MB、cTnI、IL‑1β、TNF‑α水平

收集小鼠新鲜血液，室温离心后依据ELISA检测试剂盒实验步骤对心肌损伤指标CK‑MB、cTnI和炎症因子IL‑1β和TNF‑α进行检测。

1.2.4 氧化指标MDA、GSH、SOD及Fe²⁺水平检测

心脏组织中的MDA、GSH、SOD及Fe²⁺水平测定使用市售试剂盒进行定量分析，测定过程严格按照试剂制造商提供的方案进行。

1.2.5 H&E染色

将收集的心肌组织首先使用4%多聚甲醛固定，后依据H&E染色试剂盒说明书依次脱水、包埋、切片、染色，H&E染色后使用中性树胶封片，随后在显微镜下观察各组心肌组织病理学形态并拍照留存。

1.2.6 免疫组化染色

组织切片复水后，置于抗原修复中，微波炉大火3 min，中火15 min，迅速放入冰水中，待恢复至室温取出。随后依次进行一抗、二抗孵育、DAB显色、核复染、组化后脱水及封片等操作，在显微镜下进行观察。

1.2.7 Western blot实验

心肌组织置于蛋白酶抑制剂（PMSF36978， Thermo Scientific）、蛋白裂解缓冲液（RIPA， RO010， Solarbio）和磷酸酶抑制剂混合液中充分裂解后，13 000 r/min离心，随后取出上清液，以BCA法测定各组的蛋白浓度，将定量20 μg的蛋白提取物通过10% PAGE凝胶进行SDS‑PAGE分离，随后转膜并使用5%脱脂牛奶封闭1.5~2.5 h，选用相对应的一抗GAPDH（1∶5 000，10494‑1‑AP，Proteintech）、GPX4（1∶1 000，ET1706‐45，HUABIO）、SLC7A11（1∶1 000，ab307601，abcam）、Nrf2（1∶6 000，16396‑1‑AP， Proteintech）、FTH1（1∶1 000，11682‑1‑AP， Proteintech）、ACSL4（1∶1 000， 22401‑1‑AP， Proteintech）在4 ℃冰箱过夜孵育，随后孵育相应二抗并使用增强化学发光（ECL，36208ES60，Yeasen，中国）对膜进行成像，并使用ImageJ和GraphPad Prism 8分析灰度值。

1.2.8 RT‑qPCR

心肌组织中的总RNA通过RNA快速提取试剂盒收集，采用NanoDrop One仪器检测RNA的浓度和纯度，浓度和纯度均满足标准后使用相应的逆转录试剂盒将所收集的RNA进一步反转录为cDNA，后以GAPDH为内参测定各组中GPX4、ACSL4、SLC7A11的表达水平。引物信息见表1。

2 结果

2.1 五味子乙素预处理对小鼠心肌功能的影响

通过动物超声仪测量各组小鼠心功能变化并进行组间比较发现，与CON组相比，LPS组LVEF与LVFS明显降低（P<0.01）；与LPS组相比，Sch B‑L组和Sch B‑H组心功能相关指标呈浓度依赖性升高（P<0.01）。提示五味子乙素预处理能够有效缓解LPS诱导的心脏功能受损。见图1、表2。

2.2 五味子乙素预处理对脓毒症小鼠心肌组织病理学变化的作用

H&E染色显示，LPS组心肌组织排列紊乱，间质水肿明显，并可见较多的炎性细胞浸润。在给予五味子乙素预处理后，水肿及炎症情况得到缓解，细胞肿胀减轻，心肌纤维排列较为清晰，在Sch B‑H组中缓解情况更明显，以上实验结果证实了五味子乙素对心肌炎症及心肌功能损伤的改善作用。见图2。

2.3 五味子乙素对小鼠血清中IL‑1β、TNF‑α、CK‑MB、cTnI含量的影响

通过ELISA检测各组小鼠中促炎细胞因子（IL‑1β和TNF‑α）以及心肌损伤指标（CK‑MB、cTnI）表达水平，实验结果表明，与CON组相比，LPS组IL‑1β、TNF‑α、CK‑MB、cTnI水平明显升高（P<0.01），在给予Sch B预处理的SIMD小鼠中，各指标都有所下降，其中，高剂量组的炎症及心肌损伤相关指标下降程度较低剂量组更为明显。见表3。

2.4 五味子乙素预处理对小鼠心肌组织中Fe²⁺水平及氧化应激相关指标的影响

与CON组相比，LPS组GSH、SOD含量明显降低，MDA、Fe²⁺含量明显增加（P<0.01）；与LPS组比较，Sch B‑L组GSH表达水平明显升高（P<0.01）， Fe²⁺含量明显减少（P<0.05），MDA和SOD的含量变化则无明显差异；Sch B‑H 组GSH、SOD含量明显升高（P<0.05），MDA、Fe²⁺含量明显降低（P<0.01）。见表4。

2.5 五味子乙素对小鼠心肌组织中的Nrf2/GPX4通路相关蛋白表达的影响

与CON组相比，LPS组GPX4、Nrf2、FTH1、SLC7A11表达水平明显减少（P<0.01），ACSL4水平明显增加（P<0.01）；与LPS组相比，Sch B处理后GPX4、FTH1等表达上调、ACSL4下调，高剂量组改善更明显；部分指标在低剂量组未达统计学差异。通过免疫组化再次验证发现，与Western blot结果相同，五味子乙素增加了小鼠心肌组织GPX4的表达。通过RT‑qPCR发现，GPX4、SLC7A11、ACSL4的表达情况与Western blot结果基本一致。以上结果指出，五味子乙素抑制铁死亡的发生可能是通过激活Nrf2/GPX4信号通路来实现的。见图3、4，表5、6。

2.6 Nrf2抑制剂ML385逆转了五味子乙素对脓毒症小鼠的心脏保护作用

为了进一步验证五味子乙素是否通过Nrf2信号通路发挥抗铁死亡作用，本研究应用Nrf2抑制剂ML385阻断Nrf2信号通路。通过研究发现，ML385处理后，心肌组织中Nrf2表达量明显减少（P<0.01），同时GPX4、SLC7A11、FTH1的蛋白表达也明显降低（P<0.01），ACSL4表达量明显增加（P<0.01），表现出与LPS组类似的铁死亡激活作用，且逆转了五味子乙素的铁死亡抑制作用。RT‑qPCR结果提示，与Sch B‑H组相比，ML385组GPX4及SLC7A11表达明显减少，ACSL4表达明显增加，差异具有统计学意义。提示阻断Nrf2环节后，五味子乙素的铁死亡抵抗作用无法得到发挥，从而抑制了其心肌保护作用。见图5，表7、8。

3 讨论

在临床上，脓毒症常由感染引起，若不加以控制，可诱发复杂的心肌炎症反应，最终发展为心肌功能障碍。尽管通过已有研究，学者对其心肌损伤的机制有所了解，但尚未明确有靶向药物抑制心肌损伤^［21］。脓毒症心肌损伤在中医学上无具体的病名，中医学认为，其基本病机是正虚毒损，本虚标实，毒、瘀、痰交结阻滞经络，气机宣畅失调而致逆乱，最终致脏腑失调^［20］。毒瘀相结，经络闭阻，气血凝滞于心脉，致使心脉痹阻，气机失司，而发为心肌功能障碍。因此，心脏作为脓毒症最常见的靶器官，由此引发的心肌损伤日益受到人们重视。本文通过LPS腹腔注射建立脓毒症小鼠模型，结果显示，与CON组相比，LPS组心功能指标LVEF、LVFS降低，心肌组织结构排列紊乱，炎症增加，通过ELISA结果也再次确认，LPS组小鼠出现了炎症反应及明显的病理性损伤，表明SIMD模型构建成功。

五味子属东北道地药材，是一味酸苦甘辛咸五味皆备的药材，具有收敛固涩、补气益肾强志、养心安神的功效。其味苦，入心经，为生脉饮主药，可益气、护心脏。五味子乙素是五味子的主要成分，现代研究发现，其具有缓解糖尿病心肌损伤^{［16，22］}、改善心肌缺血再灌注^［23］、预防乙醇诱导的心脏损伤^［24］、减轻心肌重塑^［25］、抑制阿霉素诱导的心脏毒性^［26］、抗氧化及炎症^［27］等心血管保护作用。本研究中发现，五味子乙素能够明显改善脓毒症小鼠心肌功能，特别是高剂量组，能够明显改善LVEF、LVFS；同时H&E染色显示其心肌组织排列有序，间质水肿不明显，且ELISA检测发现，给予五味子乙素预处理的LPS小鼠血清中，CK‑MB和cTnI含量均明显降低，同时炎症因子IL‑1β和TNF‑α也表现出同样的下调状态，初步证实了五味子乙素的抗炎症和心肌保护作用。

铁死亡被证实与脓毒症心肌损伤的过程息息相关。Liu等^［28］研究发现，黑色素纳米颗粒通过ROS介导铁积累导致的铁死亡发生来缓解脓毒症心肌损伤。Zhou等^［29］研究证实，葛根素通过调控AMPK信号通路改善脂质过氧化及铁代谢异常来缓解铁死亡发生，从而保护心肌细胞免受损伤。Chen等^［18］研究发现，TMEM43能够起到预防脓毒症诱导的心脏损伤的作用，其机制与抑制小鼠心肌铁死亡相关。此外，笔者发现五味子乙素与铁死亡也有着千丝万缕的联系。杨素清等^［12］研究发现，在糖尿病心肌病小鼠中，五味子乙素能够通过Nrf2/HO‑1/GPX4通路抑制糖尿病诱导的心肌铁死亡发生，从而缓解心肌炎症及纤维化。朱智峰等^［13］通过生物信息学和动物实验证实，五味子乙素能够抑制肝细胞铁死亡以改善炎症反应和脂质蓄积，从而缓解非酒精性脂肪性肝病的发生、发展。罗梦玉等^［14］研究发现，五味子乙素能够通过抑制铁死亡的发生抵抗肝癌细胞增殖。因此，本研究从五味子乙素对脓毒症心肌损伤的调控机制着手，探索五味子乙素能否通过调节铁死亡来达到缓解脓毒症心肌损伤的目的。本研究发现，LPS处理后小鼠心肌组织中铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、FTH1表达下降，ACSL4表达升高，且氧化应激相关指标检测显示，给予LPS刺激的小鼠体内MDA、Fe²⁺水平升高，GSH、SOD水平明显降低。由此证明，脓毒症诱发了心肌组织内的铁死亡。同时笔者发现，给予五味子乙素预处理的脓毒症小鼠铁死亡相关蛋白表达以及MDA、GSH水平都得到缓解，提示五味子乙素可能通过抑制铁死亡来发挥抗心肌损伤作用。

为了进一步探索五味子乙素抑制铁死亡的具体机制，对铁死亡的调控通路展开了相关研究。Nrf2作为关键调节因子，调节着细胞的抗氧化反应，控制着抵消氧化和亲电应激的基因表达^［30］。近期关于铁死亡的机制研究不断加深，Nrf2对于铁死亡的关键性也日益凸显。研究发现^［31］，Nrf2通过控制HERC2和VAMP8来控制铁稳态和铁死亡。Cui等^［32］研究证实，增加Nrf2表达可以减弱RSL3诱导的铁死亡，改善小胶质细胞和巨噬细胞炎症反应和铁死亡反应。Chen等^［33］研究发现，线粒体氧化应激通过NRF2‑ARE通路诱导的铁死亡的发生。此外，Nrf2作为一种抗氧化转录因子，通过诱导多个下游抗氧化靶基因（包括GPX4、TXNRD1等）来维持氧化还原稳态^［30］。GPX4通过减少磷脂氢过氧化氢，从而抑制脂质过氧化达到阻止铁死亡发生的目的^［6］。Wang等^［34］通过实验发现，PRMT4通过抑制Nrf2/GPX4信号传导，来解除Nrf2/GPX4对铁死亡的抑制作用，从而恶化DIC。Wang等^［7］证实，erastin刺激的HT22细胞中，连翘苷A能够通过Nrf2/GPX4轴抑制铁死亡的发生，从而抵抗神经炎症。结合上述研究不难发现，Nrf2/GPX4信号轴在拮抗铁死亡中充当了关键角色。本文针对五味子乙素对Nrf2/GPX4的调控作用，以及其抵抗铁死亡的效果展开了一系列实验，研究发现，五味子乙素预处理上调了LPS诱导下降低的心肌组织Nrf2及GPX4蛋白及mRNA表达，提示五味子乙素可能通过Nrf2/GPX4来调控铁死亡的发生、发展。为了进一步确定其调节作用，应用Nrf2抑制剂ML385阻断Nrf2表达发现，腹腔注射ML385干预后，小鼠心肌组织Nrf2及GPX4表达下降，且ML385逆转了Sch B预处理后铁死亡相关基因SLC7A11、ACSL4、FTH1、GPX4的表达，提示阻断Nrf2信号通路后，Sch B对铁死亡的抑制作用被抵消，从而确定Sch B通过Nrf2/GPX4信号通路改善铁死亡。

综上所述，五味子乙素能够抑制心肌组织损伤及炎症水平，改善氧化应激相关指标及铁死亡的相关基因的表达，最终减轻脓毒症所诱导的心肌损伤，而这机制可能与Nrf2/GPX4信号通路相关。

作者贡献度说明：

王磬妍：负责实验设计、操作，统计，撰写论文及修改；孙凤霄、张敬：负责数据分析与整理；董波：对文章提出修改意见及最终审核。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82070382)

山东省泰山学者基金(ts20190979)