基于网络药理学和实验验证探讨高尤‑7味丸改善急性肾损伤的作用机制

Mechanism of Gaoyou‑7 Pill in ameliorating acute kidney injury based on network pharmacology and experimental verification

摘要

目的 探讨高尤‑7味丸对急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的保护作用及机制。 方法 通过网络药理学获取高尤‑7味丸的活性成分和作用靶点，进行PPI网络分析。利用R语言对高尤‑7味丸和AKI的共同靶点进行GO和KEGG富集分析，构建核心成分‑潜在靶点‑疾病‑信号通路网络，对核心成分和核心靶点进行分子对接。建立脂多糖诱导的小鼠AKI模型，初步评价疾病模型和药效。H&E染色观察肾脏病理学变化，酶法试剂盒检测肾功能。qRT‑PCR实验检测TNF‑α、IL‑6、IL‑1β的mRNA表达水平，Western blot法检测PI3K、Akt、p‑Akt的蛋白表达水平。 结果 获得高尤‑7味丸活性成分75种，筛选得到54个潜在靶点、7个核心成分（槲皮素、T‑依兰油醇、棕榈酸、蛇麻烯、亚油酸、顺式肉桂醛、乙酸苯乙酯）、6个核心靶点（AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、EGFR）。GO和KEGG富集分析结果主要涉及转录因子、细胞分化、PI3K/Akt信号通路、IL‑17信号通路、TNF信号通路、HIF‑1信号通路。体内实验证明高尤‑7味丸可以保护肾功能，降低TNF‑α、IL‑6、IL‑1β水平，上调PI3K和p‑Akt/Akt的表达。 结论 高尤‑7味丸通过多成分‑多靶点‑多途径治疗AKI，其可以调控PI3K/Akt通路，降低炎症因子水平，保护肾功能进而改善AKI，这为蒙药的临床合理应用和进一步开发研究提供理论依据。

Abstract

Objective To explore the renal protective effects and mechanisms of Gaoyou‑7 Pill against acute kidney injury （AKI）. Methods Network pharmacology was employed to identify active ingredients and potential targets of Gaoyou‑7 Pill， followed by PPI network analysis. Common targets of Gaoyou‑7 Pill and AKI were subjected to GO and KEGG enrichment analyses using R software. A core component‑potential target‑disease‑signaling pathway network was constructed， and molecular docking was performed between core components and key targets. A LPS‑induced AKI mouse model was established to preliminarily evaluate disease pathology and therapeutic efficacy. Renal histopathological changes were observed via H&E staining， and renal function was assessed using enzymatic assay kits. qRT‑PCR was utilized to measure mRNA levels of TNF‑α， IL‑6， and IL‑1β， while Western blot was performed to detect protein expression of PI3K， Akt， and p‑Akt. Results A total of 75 active ingredients of Gaoyou‑7 Pill were identified， with 54 potential targets and 7 core components （quercetin， T‑muurolol， hexadecanoic acid， alpha caryophyllene， linoleic acid， cis cinnamaldehyde， phenethyl acetate） and 6 core targets （AKT1， TNF， IL6， TP53， IL1B， EGFR） screened. GO and KEGG analysis revealed significant enrichment in transcription factor activity， cell differentiation， and signaling pathways including PI3K/Akt， IL‑17， TNF， and HIF‑1. In vivo experiments demonstrated that Gaoyou‑7 Pill protected renal function， reduced the levels of TNF‑α， IL‑6， and IL‑1β， and upregulated the expression of PI3K and p‑Akt/Akt. Conclusion Gaoyou‑7 Pill ameliorates AKI through multi‑component， multi‑target， and multi‑pathway mechanisms， primarily by modulating the PI3K/Akt pathway and suppressing inflammatory cytokine production， thereby preserving renal function. These findings provide a theoretical foundation for the rational clinical application and further development of Mongolian medicine.

Graphical abstract

关键词

高尤‑7味丸 / 急性肾损伤 / 网络药理学 / 分子对接 / 实验验证

Key words

Gaoyou‑7 Pill / Acute kidney injury / Network pharmacology / Molecular docking / Experimental verification

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是肾毒性、脓毒症和缺血等多因素引起的短时间内肾脏功能下降的危重疾病^［1］。肾脏损伤是一个长期、复杂的过程，初始的肾脏损害可以导致持续的肾脏受损直至终末期肾病^［2］。AKI具体表现为肾实质损伤、肾小管坏死和肾小球滤过率降低，进而导致尿量剧减、体内电解质失衡和代谢物的潴留以及血尿素氮、血肌酐、血尿酸水平的明显上升^［3］。AKI通常为心力衰竭和肝脏衰竭等其他临床综合征的部分临床表现，其占总住院人数10%~15%，在重症监护病房中所占比例高达50%^［4］。AKI发生、发展迅速和治疗困难的特点使其已经成为全球公共卫生相关领域的共同挑战。当前西医主要以替代疗法和支持疗法为主，普遍价格昂贵且治疗效果欠佳^［5］。而中医药的研究和应用已经有数千年的历史，中医从整体观念出发，具有多靶点‑多途径‑多效应、高效性和安全性的优势，近年来，AKI的中药疗法已经成为相关领域的研究热点^［6］。因此，研究中医药改善AKI的作用机制具有重大的意义。

高尤‑7味丸是经典蒙医方剂，由槟榔、石榴、肉桂、荜茇、益智仁、高良姜、白硇砂7味中药构成。蒙医传统理论认为，五脏之中肾脏居于巴达干之位，肾病患者多为巴达干性，因凉而发病。高尤‑7味丸主撤肾寒，为热温性药，具有肾功能保护作用，这与蒙医基础理论“以温热治寒凉”是一脉相承的。金亮^［7］研究发现高尤‑7味丸与兴格各其满都拉和色玛‑3味汤联合用药对大鼠肾损伤有一定的保护作用。王秀兰等^［8］研究表明含高尤‑7味丸的复方蒙药制剂具有肾功能保护作用。基于此，本研究通过网络药理学技术和体内实验验证的方法探究高尤‑7味丸改善AKI的活性成分、作用靶点和关键通路，旨在为蒙药的临床应用及深入研发探索奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 高尤‑7味丸活性成分和作用靶点的获取

以“槟榔、荜茇、高良姜、肉桂、石榴、益智仁、白硇砂”为关键词检索中药系统药理学数据库^［9］（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）筛选高尤‑7味丸活性成分和靶点。筛选标准为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）需达到或超过30%，类药性（drug‑like properties，DL）不低于0.18^［10］。其中肉桂不含DL≥0.18的成分，采用查找文献与SwissTargetPrediction^［11］（http：//swisstargetprediction.ch/）相结合的方式进行活性成分的收集和靶点的预测。白硇砂主要成分为氯化铵，故后续分析对其进行排除处理。然后使用蛋白质资源数据库UniProt^［12］（https：//www.uniprot.org/）将活性组分对应的靶向蛋白名称统一转化为“Homo sapiens”的标准基因命名体系，以此作为指定的靶点标识。

1.1.2 活性成分‑作用靶点网络图的构建

利用“1.1.1”中收集到的活性成分和靶点构建NETWORK和TYPE文件，使用Cytoscape 3.9.1软件导入文件生成高尤‑7味丸成分‑靶点网络图。

1.1.3 AKI疾病靶点的筛选

通过GeneCards数据库^［13］（https：//www.genecards.org/）、在线孟德尔人类遗传数据库^［14］（https：//omim.org/，Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、治疗靶点数据库^［15］（https：//db.idrblab.net/ttd/，Therapeutic Target Database，TTD）、DrugBank数据库^［16］（https：//www.drugbank.com/）、PharmGkb^［17］数据库（https：//www.pharmgkb.org/）以“acute kidney injury”和“acute kidney failure”为关键词查找并获得AKI相关靶点。使用在线绘制韦恩图工具^［18］（https：//www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/）绘制5个数据库的疾病靶点韦恩图，去除重复靶点后得到AKI相关靶点。

1.1.4 潜在、核心成分及靶点的筛选、PPI网络和核心靶点‑潜在靶点网络图的构建

使用Cytoscape 3.9.1软件的Network Analyzer拓扑网络分析功能分析“1.1.2”中的高尤‑7味丸成分‑靶点网络，筛选出满足以下条件的节点：其“度中心性”、“中介中心性”以及“接近中心性”3项指标均超越中位数值，同时“平均最短路径长度”低于中位数值，连续筛选4次得到核心成分。利用在线绘制韦恩图工具绘制高尤‑7味丸活性成分的相应靶点和疾病靶点韦恩图，得到高尤‑7味丸成分和AKI的共同靶点。将这些共同的目标靶点输入至STRING数据库^［19］（https：//cn.string-db.org/），指定物种为人类（Homo sapiens），利用预设的标准参数执行蛋白质‑蛋白质互作（protein‑protein interaction，PPI）网络分析。随后，保留所构建的PPI网络图像，并以TSV文件格式导出，以便进一步在Cytoscape 3.9.1软件中进行分析操作。根据上文提到的拓扑网络分析筛选标准，对PPI网络连续筛选3次得到潜在靶点，连续筛选6次得到核心靶点。利用Cytoscape 3.9.1软件导入潜在靶点和核心靶点构建核心靶点‑潜在靶点网络图。

1.1.5 GO与KEGG功能富集分析

利用基于R语言4.3.1的Rstudio，应用Biocondutor^［20］和ClusterProfiler^［21］包对高尤‑7味丸和AKI的共同靶点进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能注释，包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF），并进行京都基因与基因组百科全书^［22］（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。通过微生信平台^［23］（https：//www.bioinformatics.com.cn/）进行数据可视化。

1.1.6 核心成分‑潜在靶点‑疾病‑信号通路网络图的构建

整理收集分析的高尤‑7味丸核心成分、潜在靶点、疾病、信号通路，制作NETWORK和TYPE文件并导入Cytoscape 3.9.1软件，构建高尤‑7味丸核心成分‑潜在靶点‑疾病‑信号通路网络图。

1.1.7 分子对接

选择核心成分和核心靶点分子对接验证。使用PubChem数据库^［24］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载核心成分的sdf文件，Open Babel 2.4.1^［25］转化为mol2格式作为配体。使用PDB数据库^［26］（https：//www.rcsb.org/）下载核心靶点的pdb文件作为受体，受体筛选原则是Organisms为Homo sapiens、Resolution（Å）低、尽量为单链。使用AutoDockTools 1.5.7软件进行分子对接操作。首先设置配体、受体并进行去水加氢处理，设置口袋坐标，使用Genetic Algorithm Docked方法进行分子对接，对接次数为50次。在保证结合能绝对值高的前提下，选取氢键数量最多的构象用来生成pdbqt对接结果文件，Open Babel 2.4.1转化为pdb格式导入PyMOL 2.5.7软件进行可视化操作。

1.2 实验验证

1.2.1 实验动物

SPF级4周龄雄性KM小鼠，体重（22±2） g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2024‑0001］。小鼠饲养于内蒙古科技大学包头医学院动物实验中心，实验环境为12 h光照和12 h黑暗循环，温度（24±2） ℃，湿度（55±5）%，自由进食饮水。本实验经包头医学院动物伦理审查委员会批准［批准编号：包医动伦审（2023）36号］。

1.2.2 药物制备

高尤‑7味丸（批号：907031，包头市蒙中医院制剂室）。取高尤‑7味丸适量，粉碎后过100目筛即得高尤‑7粉，用0.5%CMC‑Na配成混悬液备用。

1.2.3 试剂与仪器

主要试剂：羧甲基纤维素钠（批号：315I022，北京索莱宝科技有限公司）；脂多糖［批号：0000256112，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；RNA提取液（批号：CR2311090，武汉塞维尔生物科技有限公司）；基因组DNA去除与逆转录试剂盒（批号：MPC2312021，武汉塞维尔生物科技有限公司）；SYBR Green qPCR预混液（批号：MPC2304025，武汉塞维尔生物科技有限公司）；RIPA裂解液（批号：CR2309010，武汉塞维尔生物科技有限公司）；BCA（批号：062222220909，碧云天生物技术有限公司）；PI3K（批号：67071‑1‑Ig）、Akt（批号：10176‑2‑AP）、p‑Akt（批号：66444‑1‑Ig）、β‑actin（批号：66009‑1‑Ig）、山羊抗鼠（批号：SA00001‑1）和山羊抗兔（批号：SA00001‑2）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒（批号：CR2405067，武汉塞维尔生物科技有限公司）。

主要仪器：全波长酶标仪（MULTISKAN GO，赛默飞世尔科技有限公司）；台式高速冷冻离心机（JIDI‑16R，广州吉迪仪器有限公司）；电子天平（BSA224S‑CW，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；Step One™实时荧光定量PCR系统（4376357，赛默飞世尔科技公司）；通用电泳仪（1645070，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）；化学发光凝胶成像系统（1600，上海天能生命科学有限公司）。

1.2.4 动物分组、造模和给药

32只小鼠入室后自由进食饮水，适应性喂养1周后随机分为空白对照组、模型组、高尤‑7味丸低剂量组（450 mg/kg，低剂量组）和高尤‑7味丸高剂量组（900 mg/kg，高剂量组），每组8只。高尤‑7味丸低剂量组和高尤‑7味丸高剂量组给药剂量均按照药品说明书和人与动物体表面积转换法计算。低、高给药组按照给药剂量灌胃高尤‑7味丸混悬液，空白对照组和模型组灌胃等量0.5%CMC‑Na，1次/d，连续灌胃7 d，给药期间自由饮食饮水。第7天灌胃2 h后，除空白对照组外，各处理组均腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）复制AKI模型^［27］。空白对照组腹腔注射等量生理盐水。造模期间禁食，自由饮水，24 h后安乐死动物并取材。对小鼠进行眶后静脉丛取血，收集血清用于测定血尿素氮、血肌酐和血尿酸表达水平。为进行病理学检查，将左侧肾脏组织样本固定于含有4%多聚甲醛的溶液中，后续将进行苏木精‑伊红（hematoxylin‑eosin，H&E）染色处理。切取右肾组织快速投入液氮，随后转移-80 ℃冰箱长期保存用于后续实验。

1.2.5 肾组织形态观察及体重和肾脏指数的测定

造模24 h后记录小鼠体重。清洗并拍照完整肾组织并记录组别，随后测定双侧肾的重量，肾脏指数=双侧肾重（g）/取材当天小鼠体重（kg）。

1.2.6 血尿素氮、血肌酐和血尿酸检测

取部分收集的血清，严格按照试剂盒说明书测定各组小鼠血尿素氮、血肌酐和血尿酸水平。

1.2.7 H&E染色检测肾组织病理变化

在完成4%多聚甲醛溶液中的固定后，肾组织经过梯度酒精脱水处理，随后包埋于石蜡以制备成切片。通过H&E染色法，于光学显微镜下对这些切片进行随机选取区域的拍照，以此来客观评估肾脏组织受损的程度。

1.2.8 实时定量荧光PCR（qRT‑PCR）检测肾组织TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的mRNA表达水平

使用RNA提取液提取肾脏组织总RNA，按照试剂盒说明书进行模板中基因组残留的去除和逆转录反应。通过实时荧光定量PCR系统进行基因扩增，反应条件的第一阶段为95 ℃预变性30 s；第二阶段为95 ℃变性15 s，60 ℃退火及延伸30 s，重复40个循环。GAPDH作为内参基因，利用2^-ΔΔCt法确定各目标基因mRNA的相对表达水平。所用引物由武汉塞维尔生物科技有限公司合成，详细的引物序列信息见表1。

1.2.9 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测肾组织PI3K、p‑Akt、Akt的蛋白表达水平

取小鼠肾组织，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提组蛋白。使用BCA试剂盒通过酶标仪检测蛋白浓度以便后续定量。然后提取出的蛋白通过十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，随后转移至聚偏氟乙烯膜，在5%脱脂奶粉中封闭2 h，然后加入各蛋白一抗（1∶1 000），在4 ℃环境中孵育8 h，经含有吐温‑20的Tris盐缓冲液（TBST）洗涤后加入对应的二抗（1∶5 000），室温孵育1.5 h。最后通过ECL发光液进行显影操作，使用ImageJ 154版本对蛋白印迹进行量化分析。

1.3 统计学处理

数据统计分析使用Graphpad Prism 9.5软件完成，正态计量资料采用\overline{x}\pm s的形式表示。对于符合正态分布且方差齐性的多组数据比较，采用单因素方差分析（one‑way ANOVA），并在这一基础上，利用最小显著差异检验（least significant difference test， LSD‑t）进行组间的两两比较。对于不符合正态分布或方差不齐的数据，则选用Kruskal‑Wallis H检验进行分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 高尤‑7味丸活性成分及作用靶点的筛选及高尤‑7味丸成分‑靶点网络图的构建

按照筛选方法共收集到活性成分包括荜茇15种、槟榔8种、高良姜13种、肉桂32种、石榴7种、益智仁4种，其中石榴和高良姜含共有成分3种，益智仁和高良姜含共有成分1种。因此，共收集到高尤‑7味丸活性成分75种，如表2所示。共收集到相应靶点包括荜茇97个、槟榔23个、高良姜188个、肉桂440个、石榴181个、益智仁78个，去除重复后共收集相应靶点682个。将收集到的高尤‑7味丸成分和靶点导入软件生成网络图，网络中节点越大代表关联度越高，见图1。

2.1.2 AKI靶点的收集

GeneCards数据库获得11 304个靶点、OMIM数据库获得638个靶点、TTD数据库获得4个靶点、DrugBank数据库获得46个靶点、PharmGkb数据库获得91个靶点。将以上全部靶点导入工具制作疾病靶点韦恩图，去除重复后共获得AKI靶点11 792个，见图2。

2.1.3 核心成分及靶点的筛选和PPI网络的构建

对2.1.1构建的高尤‑7味丸成分‑靶点网络进行分析，获得7个高尤‑7味丸核心活性成分，见表2。利用工具导入高尤‑7味丸作用靶点和AKI靶点绘制韦恩图，共获得613个共同靶点，见图3。将共同靶点导入STRING数据库，筛选后获得潜在靶点54个、核心靶点6个，并构建PPI网络，见图4。

2.1.4 GO、KEGG富集分析和核心成分‑潜在靶点‑疾病‑信号通路网络图的构建

GO富集分析共获得3 943条生物信息，BP为3 454条、CC为194条、MF为295条，每种类型取-log₁₀P值前10条进行作图。其中BP主要涉及DNA结合转录因子活性、类固醇激素的调节、髓系细胞分化等方面；CC主要涉及转录调控因子、膜筏、囊泡等方面；MF主要涉及DNA结合转录因子结合、磷酸酶结合、细胞因子结合等方面，见图5。KEGG富集分析共获得212条信号通路，取-log₁₀P值前20条进行作图。结果主要涉及磷脂酰肌醇3‑激酶/丝氨酸和苏氨酸激酶（PI3K/Akt）信号通路、白介素‑17（IL‑17）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、缺氧诱导因子‑1（HIF‑1）信号通路等，见图6。最后根据上述内容建立核心成分‑潜在靶点‑疾病‑信号通路网络，可以发现高尤‑7味丸是通过多靶点、多通路共同发挥治疗AKI的作用，见图7。

2.1.5 分子对接结果

将核心成分槲皮素（Quercetin）、T‑依兰油醇（T‑Muurolol）、棕榈酸（Hexadecanoic Acid）、蛇麻烯（Alpha Caryophyllene）、亚油酸（Linoleic acid）、顺式肉桂醛（Cis Cinnamaldehyde）、乙酸苯乙酯（Phenethyl acetate）与核心靶点AKT1（PDB ID：1unq）、TNF（PDB ID：5uui）、IL6（PDB ID：1alu）、TP53（PDB ID：3d06）、IL1B（PDB ID：5r8q）、EGFR（PDB ID：8a27）进行分子对接。当结合能低于0 kJ/mol时，可认定该成分能够与目标靶点发生结合，结合能低于-7 kJ/mol，则表明这种结合不仅存在，而且是强结合状态，结合能绝对值的升高直接对应着成分与靶点间结合强度的提升^［28］。对接结合能见图8，结果显示所有结合能均小于-7 kJ/mol，说明核心成分与核心靶点之间均具有强相互作用，选取结合能最强的前6组（IL1B与T‑依兰油醇、TP53与顺式肉桂醛、TP53与蛇麻烯、IL1B与蛇麻烯、TNF与T‑依兰油醇、TP53与T‑依兰油醇）进行分子对接的可视化，见图9。其中与靶点结合较强的核心成分为T‑依兰油醇和蛇麻烯，与成分结合较强的核心靶点为TP53和IL1B，说明这些可能是高尤‑7味丸治疗AKI的分子基础。

2.2 实验验证结果

2.2.1 小鼠肾组织形态观察

对照组肾脏大小正常，形似蚕豆，呈红褐色。模型组肾脏整体肿胀，边缘不清，充血颜色暗淡。与模型组比较，低、高剂量组肾脏变化均有改善，见图10。

2.2.2 小鼠一般情况及体重与肾脏指数变化

模型组小鼠进食行为和尿量减少、较为呆滞、呼吸心率加快，各给药组情况优于模型组。与对照组相比，模型组体重发生明显下降（P<0.01）；与模型组比较，给药组体重均明显上升（P<0.01），见图11。与对照组比较，模型组肾脏指数明显升高（P<0.01），各给药组肾脏指数均发生改善，且呈现剂量依赖性下降（P<0.05），见图12。

2.2.3 高尤‑7味丸对AKI小鼠血尿素氮、血肌酐和血尿酸的影响

模型组小鼠血尿素氮、血肌酐和血尿酸水平均明显高于对照组（P<0.01）。与模型组比较，各给药组血尿素氮水平明显降低（P<0.01，），高剂量组血肌酐和血尿酸水平明显下降（P<0.01），且高剂量组血尿酸水平明显低于低剂量组（P<0.05），见图13。

2.2.4 小鼠肾脏组织H&E染色病理结果

H&E染色结果显示，对照组小鼠肾组织形态正常，无明显病变。模型组肾小管上皮细胞脱落、可见管型、肾小球肿胀、大量炎症细胞浸润。与模型组比较，低、高剂量给药组病理损伤程度均有减轻，见图14。

2.2.5 高尤‑7味丸对AKI小鼠TNF‑α、IL‑6和IL‑1β水平的影响

TNF‑α、IL‑6和IL‑1β是高尤‑7味丸改善AKI的核心靶点，且都为重要的促炎因子，因此选取以上3种因子进行检测。结果显示，与对照组相比，模型组的3种炎症因子水平明显上升（P<0.01，P<0.05）。与模型组比较，低、高剂量组因子水平均下降，高剂量组改善效果更明显（P<0.01），见图15。

2.2.6 高尤‑7味丸对AKI小鼠PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响

结果显示，与对照组比较，模型组的PI3K和p‑Akt/Akt相对蛋白表达水平明显降低（P<0.05），在高尤‑7味丸治疗后各剂量组PI3K和p‑Akt/Akt相对蛋白表达水平发生明显升高（P<0.01），且呈现剂量依赖性，见图16。

3 讨论

AKI的预防和治疗一直都是医药学界的热点问题，全球AKI死亡人数每年超过200万人^［29］。AKI病因复杂、高发病率和高死亡率的特点极大增加了患者、家属和医护人员的负担。目前暂无确切药物可以预防AKI，AKI的治疗大多采用营养支持、血液净化和肾脏替代疗法^［30］。然而，这些治疗方法费用昂贵且效果欠佳。传统蒙医理论认为赫依、希拉、巴达干三根相依相抗^［31］。肾脏是先天之本，属巴达干之位，五行主水，因而具有调节人体水液代谢之功能，巴达干偏盛导致三根失调，湿浊之邪加重，肾脏受损^［32］。高尤‑7味丸是传统蒙药，由槟榔、荜茇、高良姜、肉桂、石榴、益智仁、白硇砂七味药构成。槟榔具有消积、行气、利水之功效^［33］；荜茇能够祛“巴达干”“赫依”、调元、滋补强壮^［34］；高良姜可以温胃止呕，散寒止痛^［35］；肉桂具有温肾助阳、补中益气的作用^［36］；石榴可以生津止渴、祛风止痛^［37］；益智仁具有温脾止泻摄涎、暖肾缩尿固精之功效^［38］；白硇砂有软坚消积、散瘀消肿的功能^［39］。诸药合用能够发挥撤肾寒，纠正三根平衡，最终达到治疗肾病的作用。

本研究利用网络药理学的方法系统分析了高尤‑7味丸治疗AKI的物质基础和作用机制。研究结果表明，槲皮素、T‑依兰油醇、棕榈酸、蛇麻烯、亚油酸、顺式肉桂醛、乙酸苯乙酯是高尤‑7味丸治疗AKI的核心活性成分。Lu等^［40］发现槲皮素治疗AKI的作用机制与细胞凋亡和炎症因子相关；另有研究表明，槲皮素通过Smad3依赖性G1细胞周期阻滞机制抑制SARS‑CoV‑2N蛋白诱导的AKI^［41］；T‑依兰油醇来源于多种精油，主要发挥抗炎和抗氧化的生物活性^［42］。李佳维等^［43］指出棕榈酸对细胞的增殖、迁移与侵袭具有抑制作用；蛇麻烷型倍半萜蛇麻烯具有抗炎、抗菌和抗肿瘤的药理作用^［44］；亚油酸可以通过巨噬细胞调节炎症反应^［45］；顺式肉桂醛具有抗菌和抗氧化的生物活性^［46］；乙酸苯乙酯被用于芳香疗法，可以调节神经系统功能^［47］。以上研究证实了这些核心活性成分是高尤‑7味丸治疗AKI的重要分子基础。

PPI网络分析发现AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、EGFR是高尤‑7味丸治疗AKI的关键作用靶点。AKT1为丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种多功能蛋白，与调节细胞生长、存活和增殖有关^［48］；TNF‑α、IL‑6、IL‑1β为重要促炎性细胞因子，这些细胞因子水平的上升会加剧炎症和免疫反应，甚至引发细胞因子风暴^［49］；TP53蛋白是一种转录因子，可以激活多个靶基因的表达，在调节细胞周期、细胞凋亡和基因组稳定性方面发挥关键作用^［50］；EGFR为表皮生长因子受体，在细胞增殖和抗凋亡等方面具有重要作用^［51］。

GO富集分析结果主要涉及转录因子、细胞分化、激素调节和细胞因子等方面，提示高尤‑7味丸治疗AKI生物途径复杂。KEGG富集分析表明，高尤‑7味丸治疗AKI与PI3K/Akt、IL‑17、TNF、HIF‑1信号通路相关，其中PI3K/Akt信号通路富集程度较高，是高尤‑7味丸治疗AKI的关键信号通路，其在代谢、生长、增殖、转录以及蛋白质合成等方面发挥重要作用^［52］。研究表明，通过调控PTEN/PI3K/Akt通路抑制细胞凋亡可以缓解AKI^［53］；陈效等^［54］发现甘草甜素通过调控PI3K/Akt通路治疗脂多糖诱导的AKI；宋银雪等^［55］指出番石榴叶总三萜通过改变p‑PI3K、p‑Akt、Nrf2水平减轻脓毒症大鼠AKI。以上研究证实PI3K/Akt通路是治疗AKI的关键通路。IL‑17、TNF‑α是重要的促炎因子，通过影响多条信号通路发挥作用^［56］。HIF‑1为缺氧应答的全局性调控因子，能对细胞环境中可用氧的变化做出反应^［57］。这些研究表明上述信号通路在高尤‑7味丸治疗AKI的过程中发挥重要作用。

采用分子对接技术验证核心成分与核心靶点的结合能力。结果显示，高尤‑7味丸核心活性成分槲皮素、T‑依兰油醇、棕榈酸、蛇麻烯、亚油酸、顺式肉桂醛、乙酸苯乙酯与核心作用靶点AKT1、TNF、IL6、TP53、IL1B、EGFR均具有较强的结合能力，说明这些活性成分和作用靶点是高尤‑7味丸治疗AKI的关键。

最后，通过体内实验进一步验证高尤‑7味丸治疗AKI的作用机制。小鼠体重、肾形态、肾指数的变化均说明高尤‑7味丸具有治疗AKI的作用。低、高剂量组H&E染色结果以及血尿素氮、血肌酐和血尿酸水平的降低表明高尤‑7味丸通过保护肾功能缓解AKI。此外，TNF‑α、IL‑6和IL‑1β水平的降低提示高尤‑7味丸通过缓解炎症治疗AKI。给药组PI3K和p‑Akt/Akt表达水平的改变表明高尤‑7味丸通过调控PI3K/Akt通路治疗AKI，这进一步验证了网络药理学的预测结果。机制上，PI3K由催化亚基和调节亚基组成，位于PI3K/Akt信号通路的起始端，其可以使磷脂酰肌醇‑4，5‑二磷酸（phosphatidylinositol‑4，5‑bisphosphate，PIP2）转化为磷脂酰肌醇‑3，4，5‑三磷酸（phosphatidylinositol‑3，4，5‑trisphosphate，PIP3）^［58］。而PIP3作为第二信使招募细胞生存关键蛋白Akt转移至细胞核，进而抑制炎症因子的过度释放^［59］。炎症因子的减少能够明显降低肾小管上皮细胞的损伤，促进其修复和再生，从而减轻肾脏的损害，改善肾功能，缓解AKI的发展^［60］。而从本研究的结果来看，高尤‑7味丸改善AKI的机制正是从调控PI3K/Akt通路开始，PI3K对PIP2的转化到Akt对炎症因子的调节再到肾功能的改善，最终达到延缓AKI疾病进程的治疗效果。

综上所述，本研究通过网络药理学和分子对接技术揭示了高尤‑7味丸缓解AKI的作用机制，此过程涉及多种活性成分、多个分子靶点及多条作用路径，有力的支持了高尤‑7味丸通过复合机制干预AKI的理论假设。同时采用体内实验证明高尤‑7味丸通过调控PI3K/Akt通路抑制炎症因子水平保护肾功能从而治疗AKI。然而，网络药理学仅作为预测工具，可靠性有待考察。本研究仅采用小样本动物实验验证，未来仍需要进行体外实验和大样本临床试验，来进一步探讨高尤‑7味丸治疗AKI的作用机制，以期为蒙药的临床合理应用及开发提供科学依据。

作者贡献度说明：

杨雨霏：实验设计与实施，文章撰写，网络药理学实验；邬国栋：动物饲养，分子生物学实验；郭叶：动物饲养，分子生物学实验；薄彧坤：动物饲养，组织形态学实验；杨丹：数据可视化和图片制作；安明：文章撰写，资金支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82460807)

内蒙古自治区自然科学基金项目(2023MS08046)

中央引导地方科技项目(2022ZY0167)

内蒙古自治区蒙医药标准化项目(2023MB031)