抗菌肽FR‑13温敏水凝胶用于皮肤创伤感染的研究

Research on antimicrobial peptide FR‑13 thermosensitive hydrogel applications for skin wound infections

摘要

目的 构建一种包载抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）FR‑13的壳聚糖（chitosan，CS）温敏水凝胶（FR‑13/CS），研究其理化性质、抗菌效果及对小鼠创伤愈合的作用，为治疗战创伤引起的皮肤损伤提供新策略。 方法 采用物理交联法制备FR‑13/CS水凝胶，并通过扫描电子显微镜、流变学、机械性能测试及体外降解实验对其理化性质进行表征。此外，还评估了水凝胶的生物相容性和抗菌性能。在构建小鼠全层皮肤伤口模型的基础上，研究其促创面愈合效果。 结果 FR‑13/CS水凝胶显示出良好的温敏特性，具有均匀的微观结构、适宜的机械强度和生物降解性。体外抑菌实验表明FR‑13/CS对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果。体内药效学实验表明FR‑13/CS水凝胶明显促进小鼠皮肤创面愈合。安全性实验表明FR‑13/CS具有良好的生物相容性。 结论 FR‑13/CS水凝胶具有抗菌活性和促进伤口愈合能力，展现出良好的临床应用前景。

Abstract

Objective To prepare the antibacterial peptide FR‑13 loaded with chitosan thermosensitive hydrogel （FR‑13/CS）， and to investigate its physicochemical properties， antibacterial activity， and wound healing effects in mice， for providing a new strategy in treating skin injuries caused by battle wounds. Methods The FR‑13/CS hydrogel was prepared using a physical crosslinking method， and its physicochemical properties were characterized by a scanning electron microscopy， rheology， mechanical testing， and in vitro degradation testing. Additionally， the biocompatibility and antibacterial effects of the FR‑13/CS hydrogel were evaluated. By using a full‑thickness skin wound model in mice， its effect on promoting wound healing was investigated. Results The FR‑13/CS hydrogel exhibited excellent thermosensitive properties， a uniform microstructure， suitable mechanical strength， and good biodegradability. The results of in vitro antibacterial tests demonstrated that FR‑13/CS exhibited significant antibacterial activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. In vivo pharmacodynamic experiments showed that the FR‑13/CS hydrogel significantly promoted wound healing in mice. Safety assessments confirmed that FR‑13/CS had good biocompatibility. Conclusion The FR‑13/CS hydrogel possesses antibacterial activity and promotes wound healing， demonstrating a promising potential for clinical applications.

Graphical abstract

关键词

皮肤感染 / 水凝胶 / 温敏 / 抗菌肽 / 壳聚糖

Key words

Skin infection / Hydrogel / Thermosensitive / Antimicrobial peptides / Chitosan

战创伤引起的皮肤感染难以愈合，易导致脓毒症、败血症等严重并发症，甚至危及生命，因此针对战创伤感染的有效治疗极为重要^［1］，目前常用的策略是大剂量全身使用抗生素，这不可避免地带来耐药性问题，因此亟需新的治疗策略^［2，3］。与传统抗生素作用于单一靶点不同，抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）独特的溶菌破膜机制^［4］使其不易产生耐药性，并展现出广谱抗菌活性，成为抗感染治疗领域新生力量^［5，6］。然而，AMP普遍存在体内易降解、稳定性差、潜在细胞毒性等缺点，限制了其临床应用^［7］。因此，设计新型递送系统以降低AMP的副作用，能有效提高抗感染治疗效果。

水凝胶作为新型敷料，能为组织提供潮湿的愈合环境^［8］，可保护AMP免受蛋白酶的水解，降低毒副作用，因而受到较多关注^［9］。壳聚糖（chitosan，CS）来源于甲壳素，是天然多糖中唯一的阳离子碱性多糖^［10］，具有良好的生物相容性、可降解性和抗菌性能^［11］，广泛用于抗感染水凝胶制备。本研究选取组织蛋白酶抑制素家族LL‑37的有效片段FR‑13（FKRIVQRIKDFLR）作为抗菌活性成分，该片段在保留了LL‑37的强效抗菌特性的基础上，减少了LL‑37潜在的副作用^{［12，13］}。以CS为水凝胶基质，制备装载FR‑13的CS温敏水凝胶（FR‑13/CS）。通过系统评价所制备的FR‑13/CS水凝胶的外观、理化性质和抑菌效果，并进一步分析其在体内外的安全性及对皮肤创伤修复的作用，为治疗皮肤损伤和控制细菌感染提供新的解决方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及细胞

大肠杆菌菌株E.coli 25922、金黄色葡萄球菌菌株S.aureas 25923购自宁波明舟生物科技有限公司。小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、人脐静脉内皮细胞HUVEC及巨噬细胞RAW264.7由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

CS（上海麦克林生化科技有限公司）；盐酸、碳酸氢钠（国药集团化学试剂有限公司）；β‑甘油磷酸钠（北京酷来搏科技有限公司）；FR‑13（FKRIVQRIKDFLR，纯度>95%，西安瑞禧生物科技有限公司合成）；DMEM（赛默飞世尔科技公司）；四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；0.25%胰酶［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；青链霉素混合液、胰酪胨大豆肉汤培养基、琼脂粉（北京索莱宝科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（北京中生奥邦生物科技有限公司）；氧氟沙星凝胶（黑龙江天龙药业有限公司）；CCK‑8试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.1.3 实验仪器

AR2130型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；SZCL‑4型磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HH‑12数显恒温水浴锅［欧莱德科学仪器（北京）有限公司］；MX‑E型涡旋仪［大龙兴创实验仪器（北京）股份公司］；Spark型酶标仪（瑞士Tecan公司）；MIRA LMS型扫描电子显微镜（捷克TESCAN公司）；LGJ‑18型真空冷冻干燥机（北京松源华兴生物技术有限公司）；MCR 302型流变仪（奥地利Anton Paar公司）；AGS‑X‑10kN型电子万能试验机（日本Shimadzu 公司）。

1.1.4 实验动物

SPF级BALB/c小鼠，雄性，6~8周龄，体重20~23 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2024‑0001。动物实验通过军事医学研究院实验动物中心伦理审查，审批号：IACUC‑DWZX‑2024‑583，按规程进行操作符合动物伦理。

1.2 方法

1.2.1 水凝胶的制备与表征

1.2.1.1 水凝胶的制备

将CS溶解在0.1 mol/L盐酸溶液中制备成2%（w/v）CS溶液，并在室温下搅拌均匀，然后在4 ℃下保存。将50% β‑甘油磷酸钠溶解在0.4 mol/L碳酸氢钠中，逐滴加入到2%（w/v） CS溶液中，将FR‑13溶解在去离子水中，加入上述配方的预凝胶中，搅拌均匀后，37 ℃下形成凝胶。

1.2.1.2 水凝胶的微观结构分析

将FR‑13/CS水凝胶进行冷冻干燥，随后将冻干后的样品切片，进行喷金处理，使用扫描电子显微镜观察水凝胶的内部微观结构。

1.2.1.3 流变学性能测试

将适量凝胶前体溶液放置在直径为40 mm、间隙为0.5 mm的平行板上，设定温度范围为20~80 ℃。通过逐步加热，测定水凝胶的储能模量（storage modulus，G'）和损耗模量（loss modulus，G''）随温度变化的关系。

1.2.1.4 机械性能测试

将FR‑13/CS水凝胶制备成直径为15 mm、高度为15 mm的圆柱体，通过电子万能试验机进行机械性能测量，施加载荷大小为500 N，在试验过程中，加载速率设定为0.3 mm/min，当压缩应变达到60%时，实验将被停止。

1.2.1.5 体外降解性能评价

将制备好的FR‑13/CS水凝胶样品进行称重，记录初始质量W₀。将已称重的水凝胶浸泡在37 ℃的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）中。每隔24 h从PBS中取出水凝胶，使用滤纸吸取水凝胶表面水分后，再称重记为W_n，连续检测7 d。水凝胶的降解率（W_a）计算公式：

{\mathrm{W}}_{\mathrm{a}}(\mathrm{\%})=({\mathrm{W}}_{\mathrm{0}}-{\mathrm{W}}_{\mathrm{n}})/{\mathrm{W}}_{\mathrm{0}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.2 抗菌性能评价

1.2.2.1 FR‑13最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration， MIC）

FR‑13对大肠杆菌E.coli 25922和金黄色葡萄球菌S. aureas 25923的MIC测定采用二倍稀释法，用PBS对FR‑13溶液进行连续对半稀释，制备成不同浓度梯度（400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μɡ/mL）的溶液，每种浓度的多肽溶液各取100 μL加入96孔板中，随后向每个孔加入等体积的细菌悬液（1.5×10⁶ CFU/mL）。37 ℃恒温培养箱中培养18 h后，使用酶标仪测定600 nm处的吸光度。

1.2.2.2 水凝胶体外抗菌性能测试

选用大肠杆菌E. coli 25922和金黄色葡萄球菌S. aureas 25923进行抗菌性能测试。比较CS、FR‑13、FR‑13/CS的抗菌活性，PBS作为阴性对照，氧氟沙星凝胶作为阳性对照。将细菌悬液（1.5×10⁶ CFU/mL，500 μL）加入到等量的样品当中，在37 ℃孵育2 h。将菌液稀释后取100 μL均匀分散在琼脂平板上。在37 ℃培养箱中孵育18 h后，观察琼脂平板上的菌落数，拍照。

1.2.3 细胞毒性检测

采用CCK‑8法测定不同浓度FR‑13/CS水凝胶对小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、人脐静脉内皮细胞HUVEC以及巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性。将500 μL含有不同浓度多肽的水凝胶浸入5 mL添加10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃浸泡24 h，用0.22 μm滤膜过滤除菌。将细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养24 h至细胞完全贴壁。实验组加入含有不同浓度多肽的FR‑13/CS水凝胶提取液，对照组加入等量的DMEM培养基，孵育24 h后加入CCK‑8溶液培养2 h，用酶标仪在450 nm处测定OD值。细胞活力计算公式：

\mathrm{细胞}\mathrm{活力}(\mathrm{\%})=\frac{{\mathrm{D}}_{\mathrm{加药}}-{\mathrm{D}}_{\mathrm{空白}}}{{\mathrm{D}}_{\mathrm{未加}\mathrm{药}}-{\mathrm{D}}_{\mathrm{空白}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.4 小鼠皮肤创面愈合

将BALB/c小鼠随机分成5组，分别是对照、CS、FR‑13、FR‑13/CS、氧氟沙星凝胶组，每组3只。将小鼠麻醉，剃毛消毒后在背部剪开直径为10 mm的圆形伤口，随后给予等量的PBS、CS、FR‑13、FR‑13/CS、氧氟沙星凝胶进行治疗，连续7 d给药，7 d后隔1 d给药。在第0、7、14天对小鼠伤口进行拍照，监测创伤愈合过程。伤口愈合率计算公式：

\mathrm{伤口}\mathrm{愈合}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\mathrm{初始}\mathrm{伤口}\mathrm{面积}-\mathrm{治疗}\mathrm{后伤}\mathrm{口面}\mathrm{积}}{\mathrm{初始}\mathrm{伤口}\mathrm{面积}}\times \mathrm{100}\%

1.2.5 体内安全性

5组BALB/c小鼠治疗14 d后采集血液样本，检测血常规、血生化指标；解剖小鼠收集主要脏器，制备组织切片进行H&E染色。

1.3 统计学处理

计量资料以\overline{x}\pm s表示，数据采用GraphPad Prism 9.5.1软件进行统计学分析。多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 水凝胶的制备与表征

2.1.1 水凝胶的制备和形貌结构

本研究制备的FR‑13/CS水凝胶通过CS与β‑甘油磷酸钠交联，其凝胶化机制为CS分子中的氨基与甘油磷酸基团之间的氢键、静电作用及疏水作用，避免了化学交联可能带来的生物毒性，从而提升了生物安全性^［14］。该水凝胶在室温下呈液态，在37 ℃体温下由溶胶向凝胶转变，有利于在伤口部位的有效黏附。FR‑13/CS水凝胶的扫描电子显微镜图像显示其内部为多孔的三维网络结构，孔径分布相对均匀，见图1A、B。

2.1.2 流变性能检测

通过流变学研究，考察了FR‑13/CS水凝胶的G'和G''随温度的变化情况。在20~29 ℃范围内，G'和G''保持较低且稳定，表明水凝胶在低温下处于松散状态，呈现液态特征。随着温度的升高，G'和G''迅速上升，尤其是G'的增长更加明显，当温度到达29 ℃时，G'和G''交汇的温度即为溶胶‑凝胶相转变温度，表明此时水凝胶从溶胶状态转变为凝胶状态。该结果表明，水凝胶在升温过程中经历了从松散态向稳定态的相变，且在较高温度下形成了稳定的三维网络结构，见图2。

2.1.3 机械性能

FR‑13/CS水凝胶的机械性能结果显示，随着应变（%）的增加，水凝胶的应力（kPa）呈非线性上升趋势，尤其在较高应变范围（40%~60%）内应力急剧增加。这表明水凝胶具有良好的弹性和韧性，能在较大变形下承受明显的力。总体而言，该水凝胶表现出优异的力学性能，具备较好的应变‑应力恢复能力，见图3。

2.1.4 体外降解性能

从FR‑13/CS水凝胶的体外降解曲线可以看出，其降解速率在前2天迅速上升，从约20%增加到接近60%。随后，降解速率趋于平缓，至第6天时达到稳定状态，降解率保持在约70%。这表明该水凝胶在体外具有较快的初期降解速率，之后降解逐渐减缓并稳定，表现出较好的降解控制能力，适合作为可降解材料应用于生物医学领域，尤其在需要一段时间的长期治疗中，见图4。

2.2 体外抗菌性能

2.2.1 FR‑13的MIC

本研究对FR‑13的抗菌活性进行了考察，测定了其对2种不同种类细菌的MIC。FR‑13对革兰氏阴性标准大肠杆菌E. coli 25922和革兰氏阳性标准金黄色葡萄球菌S. aureas 25923的MIC分别为100、200 μg/mL，见图5A、B。

2.2.2 水凝胶体外抗菌性能测试

不同给药处理方式对大肠杆菌E. coli 25922和金黄色葡萄球菌S. aureus 25923的体外抗菌效果显示，对照组显示出大量细菌菌落生长，表明无抗菌活性。单独使用CS对2种细菌有轻微抑制作用，菌落数量有所减少。FR‑13处理对大肠杆菌的抑菌效果明显，而对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较弱。FR‑13/CS水凝胶与氧氟沙星凝胶组都显示出强效的广谱抗菌性能，2种细菌的菌落几乎完全消失，对2种细菌表现出完全抑制作用，见图6。

2.3 细胞毒效果评价

为了更好评估水凝胶对于不同细胞的毒性，本研究评估了FR‑13/CS水凝胶对NIH3T3、HUVEC以及RAW264.7的细胞毒性。结果显示，FR‑13/CS水凝胶（FR‑13含量12.5~200 μg/mL）对上述3种细胞无明显增殖抑制作用，细胞存活率与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。以上实验结果初步表明，本研究所构建的FR‑13/CS水凝胶具有良好的生物相容性，见图7A~C。

2.4 小鼠皮肤创面愈合

在给药后第0、7、14天拍照记录小鼠伤口愈合情况。在第14天FR‑13/CS治疗组与市售药物氧氟沙星凝胶治疗组的小鼠伤口几乎全部愈合，治疗效果好于单独FR‑13治疗组（图8A）。小鼠伤口愈合率也表明在第14天时，FR‑13/CS治疗组的小鼠伤口愈合率明显高于对照组及单独FR‑13治疗组，且FR‑13/CS治疗组的小鼠伤口愈合率与市售药物氧氟沙星凝胶组接近90%（图8B）。以上结果表明，本研究所构建的FR‑13/CS水凝胶可明显促进小鼠全层皮肤伤口的愈合，并达到与市售药物氧氟沙星凝胶组相似的疗效。

2.5 体内生物安全性

本研究进一步通过H&E染色实验评价了FR‑13/CS水凝胶对小鼠主要器官的影响。给药14 d后水凝胶处理组与对照组的心、肝、脾、肺、肾相比未发生明显病变。表明水凝胶在创面长期给药治疗后，未见损伤小鼠的重要脏器，具有良好的生物相容性，见图9A~E。

对5组小鼠进行血常规和血清生化检测。血常规结果显示，FR‑13/CS组的血常规指标：平均红细胞体积、淋巴细胞绝对值、平均血小板体积、中间细胞百分比在正常范围内，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），见图10。

血生化结果显示，FR‑13/CS组的高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、低密度脂蛋白胆固醇4项指标，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。综上所述，FR‑13/CS水凝胶表现出良好的生物相容性，无明显的血液毒性，见图11。

3 讨论

随着抗生素耐药性问题日益严重，迫切需要寻找新型抗菌策略^［15］。AMP通过非靶点特异性膜破解机制发挥抗菌作用，同时不受传统耐药机制的影响，因此极少引起细菌耐药^{［16，17］}。AMP具有良好的抗菌活性、高选择性和低毒性等特点，成为治疗耐药性细菌感染的理想替代方案^［18］。与传统抗生素通过靶向细菌内特定酶或蛋白质发挥抗菌作用不同，AMP通过破坏细菌细胞膜的完整性致使细菌死亡，因此AMP更不易诱发细菌耐药性^［19］。此外，AMP还具有抗炎、促进细胞增殖和血管生成等生物学活性，特别适用于创伤修复治疗^［20］。然而，AMP普遍存在体内易降解、稳定性差等问题，导致抗菌活性降低甚至失活^［21］，因此限制了其在伤口感染治疗方面的临床应用。

水凝胶作为药物载体，具有优良的生物相容性和高含水量，能保持伤口湿润并促进愈合^［22］，其中温敏水凝胶因其独特的温度响应特性而受到广泛关注。温敏水凝胶能根据温度变化由溶胶态转变为凝胶态，形成稳定的三维网络结构，这一特性使其在皮肤创伤修复展现出独特的优势^［23］。与传统水凝胶仅能简单附着于伤口表面不同^［24］，温敏水凝胶可依据体内温度自动调整状态，更佳贴合包括战创伤在内的复杂伤口形态，提供精准覆盖和局部治疗。此外，温敏水凝胶能持续的释放药物，其温度响应特性使得水凝胶能在创伤部位稳定存在，避免了传统药物释放系统中药物过早释放或局部浓度过高的情况^［25］。本研究选用CS作为温敏水凝胶的基质。CS是一种天然多糖，具有良好的生物相容性、低毒性和生物降解性，广泛应用于药物递送和组织修复^［26］。其天然抗菌特性还增强了水凝胶在创伤治疗中的抗菌效果，有助于减少感染风险，加速创伤愈合。将AMP包载于温敏水凝胶中，将二者的优势相结合，显示出在治疗皮肤创伤感染方面的应用潜力。在室温下呈液态，便于局部给药，接触创伤部位后会根据体温迅速转化为凝胶，形成稳定的覆盖层，填充创口并保持AMP的高局部浓度，增强抗菌效果并促进伤口愈合^{［27，28］}。其温度响应性提高了药物递送的靶向性与释放效率，同时优化创伤修复过程，减少系统性副作用，提升局部疗效。通过封装AMP，既保证了其稳定性，又实现了持续释放，避免药物快速流失，延长治疗效果^［29］。此外，温敏水凝胶还能形成保护屏障，防止外界感染，并促进组织再生，为皮肤创伤感染提供了新的治疗策略。

本研究制备了一种负载FR‑13的温敏水凝胶FR‑13/CS，呈三维网络结构且具有良好的温度响应特性，展现出良好的机械性能和体外降解控制能力。FR‑13/CS水凝胶对以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌和以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌表现出明显的抑制作用。体内药效实验结果显示，FR‑13/CS水凝胶对于全层皮肤伤口显示出良好的促愈合效果。体内外生物安全性实验结果未见明显毒性，表现出优良的生物相容性。综上所述，FR‑13/CS水凝胶较单独使用FR‑13和CS具有更好的抗菌和促愈合作用，并且与市售药物氧氟沙星凝胶效果相当，展示出良好的对抗细菌耐药性的潜力，为战创伤皮肤伤口治疗提供一种新策略。然而其作用机制仍需进一步研究。未来研究可进一步探索不同种类AMP与多种类型水凝胶组合的可能性，以期获得更加高效、安全的治疗方案。

作者贡献度说明：

巴琪：实验设计与操作，数据分析，论文撰写；姚佳欣、孟园园、孔祎琛、田豪：数据收集，辅助实验操作；龚伟、王玉丽、杨阳：实验技术指导；高春生、杨美燕：实验设计指导，提供经费支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

北京市自然科学基金(7234405)