基于NF‑κB磷酸化探讨交泰丸干预失眠大鼠小胶质细胞活化的机制

Investigation of the mechanism underlying Jiaotai Pill intervention in microglial activation in insomniac rats based on NF‑κB phosphorylation

摘要

目的 探讨交泰丸（Jiaotai Pill，JTP）干预失眠大鼠小胶质细胞活化的机制。 方法 SPF级雄性SD大鼠，随机分为5组：对照组、模型组、阳性对照组、交泰丸低剂量组、交泰丸高剂量组，每组10只。采用连续2 d腹腔注射400 mg/kg对氯苯丙氨酸（para‑chlorophenylalanine，PCPA）的方法建立大鼠失眠模型。交泰丸低、高剂量组分别按3.85、7.70 g/kg灌胃交泰丸水煎液，阳性对照组按2 mg/kg灌胃地西泮水溶液，其他组灌胃等量蒸馏水，连续7 d。末次给药后进行戊巴比妥钠协同睡眠实验。采用ELISA检测大鼠脑组织神经递质5‑羟色胺（5‑hydroxytryptamine，5‑HT）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、γ‑氨基丁酸（γ‑aminobutyric acid，GABA）、谷氨酸（glutamate，Glu）和褪黑素（melatonin，MT）水平，H&E染色观察海马组织形态，免疫荧光法检测脑组织离子钙结合适配器分子1（ionized calcium‑binding adaptor molecule 1，IBA‑1）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达情况，Western blot法检测脑组织核因子κB p65（nuclear factor‑κB p65，NF‑κB p65）和Phospho‑NF‑κB p65的表达水平。 结果 与模型组相比，交泰丸低、高剂量组睡眠时长明显增加，睡眠潜伏期缩短（P<0.05）；NE含量明显降低（P<0.01），MT和5‑HT含量明显增加（P<0.01）；海马CA1、CA3区的神经元排列较为整齐；IBA‑1和iNOS表达水平明显降低；脑组织Phospho‑p65/p65比值明显降低（P<0.05）。 结论 交泰丸能促进睡眠，改善海马组织形态学，调节神经递质水平，减轻小胶质细胞活化。交泰丸可能通过抑制NF‑κB信号通路减轻小胶质细胞活化，从而对神经元起到保护作用。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which Jiaotai Pill （JTP） modulate microglial activation in an insomnia rat model. Methods Male Sprague‑Dawley （SD） rats at SPF grade were randomly divided into 5 groups： the control group， the model group， the positive control group，the low‑dose JTP group， and the high‑dose JTP group， with 10 rats in each group. The insomnia model was established via intraperitoneal injection of para‑chlorophenylalanine （PCPA） at 400 mg/kg for 2 consecutive days. Rats in the low‑ and high‑dose JTP groups were administered JTP decoction intragastrically at doses of 3.85 and 7.70 g/kg respectively， while the positive control group received diazepam solution at 2 mg/kg， and other groups were given an equivalent volume of distilled water， all for 7 consecutive days. Pentobarbital sodium synergistic sleep experiment was performed after the final administration. ELISA was used to measure neurotransmitter levels in brain tissue， including 5‑hydroxytryptamine （5‑HT）， norepinephrine （NE）， γ‑aminobutyric acid （GABA）， glutamate （Glu）， and melatonin （MT）. Hippocampal morphology was observed using H&E staining. Immunofluorescence was employed to assess the expression of ionized calcium‑binding adaptor molecule 1 （IBA‑1） and inducible nitric oxide synthase （iNOS） and Western blot was used to detect nuclear factor‑κB p65 （NF‑κB p65） and phosphor‑NF‑κB p65. Results Compared to the model group， both low‑ and high‑dose JTP groups showed significantly increased sleep duration， and reduced sleep latency （P<0.05）. NE levels were significantly decreased （P<0.01）， while MT and 5‑HT levels were markedly increased （P<0.01）. Neurons in the CA1 and CA3 regions of the hippocampus exhibited more orderly arrangements. Expression levels of IBA‑1 and iNOS were significantly reduced. Phosphorylated p65/p65 levels in brain tissue were notably decreased （P<0.05）. Conclusion JTP can promote sleep， improve hippocampal morphology， regulate neurotransmitter levels， and alleviate microglial activation. The neuroprotective effect of JTP may be attributed to the inhibition of the NF‑κB signaling pathway， thereby mitigating microglial activation.

Graphical abstract

关键词

交泰丸 / 失眠 / 小胶质细胞活化 / NF‑κB信号通路

Key words

Jiaotai Pill / Insomnia / Microglia / NF‑κB pathway

交泰丸是治疗心肾不交型失眠的经典方剂，已有悠久的应用历史，并逐渐扩大应用于包括焦虑、更年期综合征、糖尿病及抑郁症等疾病的临床治疗。研究显示，交泰丸可以提高心肾不交型老年失眠患者睡眠质量，增加失眠大鼠的慢波睡眠，调节失眠大鼠脑内神经递质水平，改善抑郁模型大鼠的抑郁样行为及海马组织形态，调节糖尿病大鼠的肠道菌群，改善阿尔茨海默病模型小鼠大脑的葡萄糖代谢^［1‑6］。小胶质细胞是中枢神经系统中的主要免疫细胞，近年来的研究揭示了其在睡眠调节中的关键作用^［7］。睡眠剥夺或睡眠紊乱通常伴随着小胶质细胞的过度激活，导致神经炎症和睡眠障碍^［8］。本文将从小胶质细胞活化的角度，深入探讨交泰丸对失眠的干预机制，为其进一步应用于抑郁症及神经退行性疾病的治疗与预防提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

黄连、肉桂饮片购自北京同仁堂；50只SPF级雄性SD大鼠，体质量180~220 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司（SCXK（京）2024‑0001）；氯苯丙氨酸（para‑chlorophenylalanine，PCPA）（7424‑00‑2）购自HEOWNS；Rat 5‑HT ELISA KIT（YJ65445）、Rat NE ELISA KIT（YJ99785）、Rat GABA ELISA KIT（YJ02669）、Rat Glu ELISA KIT（YJ23659）、Rat MT ELISA KIT（YJ02365）购自上海源桔生物科技中心，RIPA裂解液（M176583）购自MREDA，通用型组织固定液（G1101）、磷酸化蛋白酶抑制剂（G2008）、30% Acr‑Bis（29∶1）（G2004‑500ML）、Prestained Protein Marker Ⅱ（G2058‑250UL）、无蛋白快速封闭液（G2052）、GAPDH多克隆抗体（GB11002‑100）、Anti‑IBA‑1 Mouse mAb（GB12105）、Anti‑iNOS Rabbit pAb（GB11119）、FITC标记山羊抗小鼠（GB22301）、cy3标记山羊抗兔（GB21303）、抗荧光淬灭封片剂（BL739B）、羊抗兔IgG（GB23303）、超敏ECL化学发光试剂盒（G2020‑50ML）购自武汉赛维尔生物科技有限公司，NF‑κB p65多克隆抗体（PAA616Hu01）购自云克隆，Phospho‑NF‑κB p65（Ser536）Rabbit多克隆抗体（AF5881）购自碧云天。

1.2 方法

1.2.1 药物制备

称取黄连和肉桂饮片（10∶1，w/w），蒸馏水（1∶8，w/v）浸泡1 h后，煮沸，合并两次滤液，蒸发浓缩至药液浓度为0.77、1.54 g/mL。地西泮片研碎后，用蒸馏水配制成0.4 mg/mL的混悬液。PCPA用含1%吐温80的生理盐水配制成0.08 g/mL的混悬液，使用前充分乳化。

1.2.2 实验分组与处理

将大鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组、交泰丸低剂量组和交泰丸高剂量组，每组10只，饲养于北京中医药大学动物实验中心屏障环境，室内温度为（22±2） ℃，室内湿度为（50±5）%，昼夜循环12 h，正常光照，适应性喂养1周后，连续2 d按400 mg/kg腹腔注射PCPA，每日1次，制备大鼠失眠模型。对照组腹腔注射等量含1%吐温80的生理盐水。交泰丸低、高剂量组分别按3.85、7.70 g/kg灌胃交泰丸水煎液，阳性对照组按2 mg/kg灌胃地西泮水溶液，其他组灌胃等量蒸馏水，连续7 d。动物实验方案根据《实验动物护理与使用指南》制定并严格执行，经过北京中医药大学生命科学学院以及北京中医药大学学术委员会实验动物伦理分委员会批准，动物实验伦理批准号：BUCM‑4‑2022041401‑2012。

1.2.3 戊巴比妥钠协同睡眠实验

末次给药后，进行戊巴比妥钠协同睡眠实验。具体操作方法：腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠（45 mg/kg），观察15 min内各组入睡的动物数，以翻正反射消失超过1 min为入睡指标，从注射药物到翻正反射消失记为睡眠潜伏期，从翻正反射消失至翻正反射恢复记为睡眠时间。

1.2.4 标本采集

取材前大鼠禁食不禁水12 h，称重麻醉后，取脑组织，一侧置于4%多聚甲醛中固定，另一侧液氮冻存备用。

1.2.5 ELISA检测

称取约100 mg脑组织，加入预冷PBS，制备匀浆液，按试剂盒说明，检测5‑HT、NE、Glu、GABA、MT水平。

1.2.6 苏木精‑伊红（H&E）染色

取固定后脑组织，经修块、梯度脱水、包埋、4 μm超薄切片后，按常规方法进行H&E染色，镜下观察并采集图像，分析各组海马区组织形态学差异。

1.2.7 免疫荧光

取脑组织切片，经烤片、脱蜡至水、抗原修复、封闭后，加IBA‑1和iNOS一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗3次，每次5 min，加相应的荧光标记二抗室温避光孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min，DAPI染色10 min，PBST洗3次，每次5 min，抗荧光淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，分析各组小胶质细胞活化情况。

1.2.8 Western blot

称取约200 mg脑组织，加入含1 mmol/L磷酸化蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液200 μL，冰上匀浆，收集匀浆液，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清液，得到蛋白样品。经定量、变性、SDS‑PAGE电泳、转移电泳、封闭后，分别加GAPDH、NF‑κB p65、Phospho‑NF‑κB p65一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加相应的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，显影拍照，采用ImageJ软件对条带进行分析，用目的蛋白的灰度值/内参蛋白灰度值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料数据均以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用One‑Way ANOVA分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 交泰丸明显增加失眠大鼠的睡眠时长

与对照组相比，模型组睡眠潜伏期明显延长（P<0.01），睡眠时长明显缩短（P<0.01）；与模型组相比，交泰丸低、高剂量组睡眠潜伏期明显缩短（P<0.05），睡眠时长明显增加（P<0.05）。见表1。

2.2 交泰丸明显增加5‑HT和MT的水平，明显降低NE和Glu的水平

与对照组相比，模型组5‑HT和MT水平明显下降（P<0.05），NE和Glu水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，交泰丸低、高剂量组5‑HT和MT水平明显上升（P<0.05），NE和Glu水平明显降低（P<0.05）。各组GABA水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 交泰丸明显改善失眠大鼠海马组织形态

对照组的海马CA1区和CA3锥体层结构完整，神经元形态规则，胞浆透明且染色均匀；与对照组相比，模型组的海马CA1区和CA3椎体神经元排列紊乱，稀松无序；与模型组相比，交泰丸低、高剂量组椎体神经元排列整齐，胞核较清晰。见图1。

2.4 交泰丸明显降低失眠大鼠海马IBA‑1和iNOS的表达水平

与对照组相比，模型组大鼠海马CA1、CA3区IBA‑1和iNOS荧光强度明显增加；与模型组相比，交泰丸低、高剂量组IBA‑1和iNOS荧光强度明显下降。见图2。

2.5 交泰丸明显降低失眠大鼠脑组织Phospho‑p6/p65比值

各组NF‑κB p65表达水平均无明显差异。与对照组相比，模型组Phospho‑NF‑κB p65表达水平明显增加（P<0.01）；与模型组相比，交泰丸低、高剂量组Phospho‑NF‑κB p65表达水平明显降低（P<0.05）。见图3。

3 讨论

PCPA是一种选择性的色氨酸羟化酶的不可逆抑制剂，可抑制5‑HT的生成，因此常用于睡眠剥夺动物模型的制备。本文中模型组大鼠脑组织5‑HT和MT水平明显降低，同时NE和Glu水平明显升高。研究显示，5‑HT能够调控睡眠‑觉醒周期，并与小胶质细胞激活有关^［9，10］。5‑HT还能调节包括MT、NE、Glu、GABA等神经递质的释放。MT是人体内重要的诱导睡眠物质，在松果体中由5‑HT经过一系列反应生成，使用MT治疗能够明显消除炎症引发的NF‑κB磷酸化和小胶质细胞活化^［11］。NE是产生快波睡眠的必要条件，而升高的NE是引起睡眠障碍相关症状的关键因素^［12］。NE还是小胶质细胞的关键调节剂，升高的NE能够激活小胶质细胞，从而引起神经的过度兴奋而导致失眠^［7］。Glu是大脑主要的兴奋性神经递质，能够控制入睡的生理过程，高水平Glu能够维持动物的清醒状态^{［13，14］}。Glu还是GABA的前体，Glu和GABA的不平衡可能会触发过度的树突修剪，最终激活小胶质细胞，而活化的小胶质细胞能够释放高水平的Glu，引起神经递质的紊乱^{［15，16］}。交泰丸可明显提高5‑HT和MT的水平，明显降低NE和Glu的水平，说明交泰丸可通过调节神经递质的释放来改善睡眠，并提示了交泰丸影响小胶质细胞活化的可能性。

本文中模型组大鼠海马CA1和CA3区IBA‑1和iNOS的表达水平明显升高。IBA‑1是一种进化上保守的钙结合蛋白，作为F‑actin结合蛋白，IBA‑1可能重塑小胶质细胞的肌动蛋白细胞骨架，参与活化小胶质细胞/巨噬细胞状态相关的形态变化，常被用作小胶质细胞活化的标志物^{［17，18］}。iNOS是在大多数细胞正常条件下不表达的一种基因产物，在大脑受到炎症、感染、损伤、老化后能够检测到，大脑iNOS可能是受伤或受损后进行充分修复所必需的^［19］。交泰丸可明显降低海马CA1和CA3区IBA‑1和iNOS的表达水平，说明交泰丸改善了失眠大鼠的脑组织炎症状态，且减轻了小胶质细胞的活化状态。

有研究显示，小胶质细胞激活后，能够通过激活NF‑κB信号通路进一步导致神经元损伤^［20］。NF‑κB是一组蛋白质复合物的统称，哺乳动物NF‑κB家族由5种成员组成，其中p65对基因表达起正向调节的作用。NF‑κB在正常人体中稳定的大量存在，当炎症产生后，NF‑κB通路被激活。激活后释放的p50/p65二聚体进入细胞核后，将激活目标基因的转录，发挥促炎作用。活化的NF‑κB的核转位取决于p65的磷酸化。失眠能够引起大脑NF‑κB浓度的升高，抑制NF‑κB信号通路可以改善失眠^［21］。NF‑κB在小胶质细胞激活中起着至关重要的作用，活化的小胶质细胞能够通过NF‑κB信号通路介导神经炎症^［22］。本文中，交泰丸可明显降低失眠大鼠脑组织p65的磷酸化水平，提示交泰丸可能通过抑制NF‑κB信号通路的激活，减轻小胶质细胞的活化，从而进一步降低脑组织炎症水平，起到保护神经元的作用。

综上，本文从小胶质细胞活化角度探讨了交泰丸干预失眠的潜在机制，为进一步阐明交泰丸治疗失眠的作用机制提供了新的视角。后续还将继续通过含药血清药理学方法从细胞水平深入探讨这一机制，为交泰丸进一步应用于抑郁症、缺血性卒中、阿尔兹海默病等老年性脑病的临床治疗提供实验依据。

作者贡献度说明：

林鹭：实验实施、数据分析、检索文献、文章撰写；姬欣欣：指标检测、数据分析、检索文献、论文修改；金如意、区浩松、马鑫、李佳、赵俊云：审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

北京中医药大学横向课题(90020371720034)