二冬消渴方通过PI3K/AKT/mTOR通路调控泪腺自噬改善2型糖尿病干眼的机制

Mechanisms of the regulation of lacrimal gland autophagy through the PI3K/AKT/mTOR pathway by Erdong Xiaoke Decoction to relieve dry eye in type 2 diabetes mellitus

摘要

目的 探究二冬消渴方如何通过磷脂酰肌醇3‑激酶（phosphatidylinositol 3‑kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路调节泪腺自噬，从而改善糖尿病大鼠干眼状况的具体机制。 方法 20只健康雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组、中药组、阳药组，每组5只。对照组喂食标准饲料，其余各组大鼠喂食高糖高脂饲料，4周后腹腔注射链脲佐菌素，连续8周，构建2型糖尿病干眼大鼠模型。对照组和模型组予10 mL/kg生理盐水灌胃，中药组予11 g/kg二冬消渴方灌胃，阳药组予玻璃酸钠滴眼液滴双眼，连续4周。造模前、造模后、干预后比较各组大鼠角膜荧光染色（FL）、泪膜破裂时间（BUT）、酚红棉线试验（PRT）等干眼相关指标，取样后称量泪腺重量，H&E染色对泪腺进行病理学观察，透射电镜观察泪腺自噬小体，使用Western blot和RT‑PCR技术检测泪腺中的PI3K、AKT、mTOR、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、螯合体‑1（SQSTM1/p62）蛋白和mRNA表达情况。 结果 造模后，除对照组外各组间干眼指标差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组比较，其余组FL升高，BUT、PRT降低（P<0.05）。干预后，与对照组相比，模型组大鼠干眼明显，FL升高，BUT、PRT降低（P<0.05），泪腺重量减轻（P<0.05），H&E染色腺小叶萎缩，腺腔扩张，电镜下自噬小体减少，泪腺组织中PI3K、AKT、mTOR磷酸化激活且mRNA表达升高（P<0.05）；与模型组比较，中药组、阳药组上述指标皆逆转（P<0.05）。 结论 二冬消渴方抑制糖尿病干眼大鼠泪腺中PI3K/AKT/mTOR通路激活，提高自噬水平以减轻泪腺损伤，进而缓解干眼。

Abstract

Objective To investigate the specific mechanism of how Erdong Xiaoke Decoction （EDXKD） regulates lacrimal gland autophagy through the phosphatidylinositol 3‑kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin（mTOR） pathway， thereby improving the dry eye condition in diabetes rats. Methods A total of 20 healthy male SD rats were randomly divided into the control group， the model group， the traditional Chinese medicine（TCM）group， and the prophylactic drug group， with 5 rats in each group. The rats in the control group were fed with standard diet， and the rats in the other groups were fed with high sugar and fat diet. After 4 weeks， streptozotocin （STZ） was injected intraperitoneally for 8 consecutive weeks to establish the model of type 2 diabetes dry eye rats. The control group and the model group were given 10 mL/kg physiological saline by gavage， the TCM group was given 11 g/kg EDXKD by gavage， and the prophylactic drug group was given sodium hyaluronate eye drops in both eyes for 4 consecutive weeks. Before modeling， after modeling， and after intervention， dry eye related indicators such as corneal fluorescence staining （FL）， tear film rupture time （BUT）， and phenol red cotton thread test （PRT） were compared in each group of rats. After sampling， the weight of the lacrimal gland was measured， and H&E staining was used for pathological observation of the lacrimal gland. Transmission electron microscopy was used to observe autophagosomes in the lacrimal gland. And Western blot and RT‑PCR techniques were used to detect the expression of PI3K， AKT， mTOR， microtubule associated protein 1 light chain 3 （LC3）， chelator‑1 （SQSTM1/p62） protein and mRNA in the lacrimal gland. Results After modeling， there was no statistically significant difference in dry eye indicators among all groups except the control group （P>0.05）. Compared to the control group， the other groups showed an increase in FL and a decrease in BUT and PRT （P<0.05）. After intervention， compared to the control group， the model group rats showed significant dry eye symptoms， with an increase in FL， a decrease in BUT and PRT（P<0.05）， a reduction in lacrimal gland weight（P<0.05）， atrophy of H&E stained glandular lobules， dilation of glandular lumen， a decrease in autophagosomes under electron microscopy， and activation of PI3K， AKT， mTOR phosphorylation and increased mRNA expression in lacrimal gland tissue（P<0.05）. Compared to the model group， both the TCM group and the prophylactic drug group showed a reversal of the above indicators（P<0.05）. Conclusion EDXKD inhibits the activation of PI3K/AKT/mTOR pathway in lacrimal gland of diabetes dry eye rats， and increases autophagy level to alleviate lacrimal gland damage， thereby alleviating dry eye symptoms.

Graphical abstract

关键词

二冬消渴方 / 糖尿病干眼 / PI3K/AKT/mTOR通路 / 泪腺 / 自噬

Key words

Erdong Xiaoke Decoction （EDXKD） / Diabetic dry eye / PI3K/AKT/mTOR pathway / Lacrimal gland / Autophagy

干眼是糖尿病常见的并发症^［1］，伴有如眼部干涩等多项不适症状，是泪液分泌不足或泪膜不稳定导致的疾病^［2］。近年来已有多项国内外研究表明，正常自噬水平降低影响干眼的发生、发展^［3］，其中以微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3， LC3）、螯合体‑1（SQSTM1/p62）为参考指标^［4］。众多复杂的信号通路参与调控自噬过程，尤其与磷脂酰肌醇3‑激酶（phosphatidylinositol 3‑kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路密切相关^［5］。

前期研究中，本课题组证实二冬消渴方疗效确切，可明显改善糖尿病干眼大鼠眼表指标^［6］。本研究进一步从PI3K/AKT/mTOR信号通路介导泪腺自噬角度探究二冬消渴方对2型糖尿病干眼大鼠泪腺的影响及作用机制，为临床治疗提供更充足的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD大鼠（8周龄）20只，体质量180~220 g，裂隙灯检查眼表无明显异常，购自南通大学实验动物中心，生产许可证号SCXK（苏）2019‑0001，使用许可证号SYXK（苏）2017‑0069。饲养于南京中医药大学附属医院药理实验室，饲养温度（22±2） ℃、湿度60%±5%，昼夜明暗交替12 h，可自由摄食、饮水。本实验通过南京中医药大学附属医院动物实验伦理委员会批准（批号：2021 DW 0202）

1.2 药物

二冬消渴方：天冬10 g，麦冬10 g，天花粉10 g，石斛10 g，葛根15 g，黄连3 g，山药15 g，夏枯草10 g，鬼针草30 g。以上药材由南京中医药大学附属医院提供，用蒸馏水将其制成浓度为1.1 g/mL的溶液。

1.3 试剂及仪器

0.1%玻璃酸钠滴眼液（江西珍视明药业有限公司，批准文号：国药准字H20203143），链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，S0130‑188836664），p62（武汉博士德生物工程有限公司，PB0458），LC3（美国Abmart公司，TA5402S），PI3K（美国CST公司，4257t），AKT（60203‑2‑Ig）、mTOR（28273‑1‑AP）均购自武汉三鹰生物科技有限公司，p‑PI3K（AP0427）、p‑AKT（AP1453）、p‑mTOR（AP1413）、β‑Actin（AC026）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，兔二抗（杭州华安生物技术有限公司，HA1001），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，P0012），特超敏ECL化学发光底物（北京兰杰柯科技有限公司，BL520B），电镜固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，G1102‑CR2208118）。

手持裂隙灯显微镜（重庆上邦医疗设备有限公司，LS‑1B），电泳仪（美国BioRad公司，043BR49512），曝光机（上海天能，Tanon‑4600），荧光定量PCR仪（上海赛默飞世尔科技有限公司，7500F），正置白场显微镜（日本Nikon，Eclipse Ni‑U）

1.4 动物分组、造模及干预

20只大鼠随机划分至对照组、模型组、中药组、阳药组，每组5只。对照组喂食标准饲料，其余组喂食高糖高脂饲料。第5周对喂食高糖高脂饲料的大鼠进行腹腔注射，注射液为含1%STZ、30 mg/kg浓度的柠檬酸缓冲液；同时，予对照组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液。连续3次测量空腹血糖≥16.7 mmol/L，提示2型糖尿病造模成功^［7］；对动物干眼指标评估，以泪膜破裂时间（BUT）<5 s，角膜荧光素钠染色（FL）阳性，酚红棉线测试（PRT）<7 mm/20 s，提示干眼模型构建成功^［8］。

大鼠成功建立模型，且未发生死亡或脱落。造模成功后次日进行药物干预，对照组与模型组予10 mL/kg生理盐水灌胃，中药组予人临床等效剂量11 g/kg二冬消渴方灌胃^［9］，每日1次；阳药组予玻璃酸钠滴眼液滴眼^［10］，每次1滴，每日3次。连续干预4周。

1.5 干眼指标检测

分别于第0周、第12周、第16周检测大鼠干眼指标。FL：荧光素钠染色后在裂隙灯下观察，角膜4个象限累计染色评分（无染色得分为0分，点状染色≤30个得分为1分，点状染色超过30个但不融合得分为2分，点状染色超过30个且融合得分为3分）^［11］。BUT：角膜荧光素钠染色后辅助大鼠多次眨眼，裂隙灯下观察第一个角膜干燥斑出现的时刻。PRT：酚红棉线一端轻轻折叠后放置在大鼠下眼睑穹窿部外1/3处，确保闭眼20 s后测量泪液浸润棉线的长度。

1.6 标本采集与处理

饲养16周后，大鼠吸入异氟烷深度麻醉后处死，完整分离眶内泪腺并立即称量、记录，每组随机选取3个泪腺于4%多聚甲醛固定，3个泪腺于电镜固定液固定，其余置-80 ℃冰箱中保存。

1.7 泪腺组织病理学检查

将4%多聚甲醛固定的泪腺组织逐级脱水，石蜡渗透和包埋制成切片，再进行脱蜡、水化、苏木精‑伊红（H&E）染色，置于正置白场显微镜观察泪腺组织病理学改变。

1.8 透射电镜观察泪腺自噬小体

将泪腺样本置于4 ℃预冷的电镜专用固定剂中，持续固定至少2 h，固定完成后在100 mmol/L二甲砷酸钠缓冲液中进行3次充分漂洗，随后转移至1%四氧化锇溶液中，于4 ℃低温下固定90 min，随后用蒸馏水清洗3次后，经梯度浓度丙酮逐级脱水，与适量Epon812环氧树脂包埋剂充分混匀，最终在恒温箱内加温聚合。超薄切片机切片制备后，分别采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，置于透射电子显微镜下观察、拍照。

1.9 蛋白免疫印记（Western blot）技术检测泪腺中PI3K、AKT、mTOR、p62、LC3蛋白相对表达水平

取适量泪腺组织加入RIPA裂解液经研磨机研磨后冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min后吸取上清，采用BCA法测总蛋白浓度。后续进行样本变性、上样、电泳、转膜、封闭，分别于PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶5 000）、mTOR（1∶2 000）、p‑PI3K（1∶5 00）、p‑AKT（1∶5 00）、p‑mTOR（1∶5 00）、p62（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）中4 ℃一抗孵育过夜。TBST洗膜3次后兔抗（1∶50 000）/鼠抗（1∶20 000）室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次后使用使用特超敏ECL化学发光底物上级显影、成像、分析。

1.10 实时聚合酶链式反应（real‑time polymerase chain reaction， RT‑PCR）技术检测泪腺中PI3K、AKT、mTOR、p62、LC3表达水平

在液氮条件下将泪腺组织研磨至粉末状态，采用Trizol法抽提总RNA，测定RNA浓度后通过逆转录转换为cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增。所有指标遵循以下流程：95 ℃，30 s；40个PCR循环（95 ℃，10 s；60 ℃，30 s）。为构建PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按照95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s，并从60 ℃缓慢加热到95 ℃，由Primer 5.0软件设计引物序列（表1），数据采用2^-△△CT法进行分析。

1.11 统计学处理

采用SPSS 26.0软件对收集的数据进行分析处理，计量数据用\overline{x}\pm s表示，若数据符合正态分布且方差具有一致性，选择单因素方差分析；反之，若数据不符合正态分布或方差同质性，选择非参数检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 干眼指标检测比较

第0周，各组大鼠干眼指标差异无统计学意义（P>0.05）。第12周，除对照组外各组间干眼指标差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组相比，其余各组FL升高，BUT、PRT降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。第16周，与对照组相比，模型组FL升高，BUT、PRT降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，中药组、阳药组FL降低，BUT、PRT升高，差异具有统计学意义（P<0.05）（图1）。

2.2 各组大鼠泪腺重量指数（泪腺重量/大鼠质量，mg/g）比较

与对照组大鼠泪腺重量指数（1.03±0.04）比较，模型组大鼠泪腺重量指数（0.75±0.07）明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01）。中药组大鼠泪腺重量指数（0.91±0.03）和阳药组大鼠泪腺重量指数（0.90±0.07）干预后，较模型组均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）（图2）。

2.3 各组泪腺组织形态学改变

各组大鼠泪腺组织病理改变，对照组泪腺组织形态未见异常，细胞分布规整且间隙紧密，腺泡结构完整，腺腔狭窄。模型组泪腺呈现明显病理损伤，胞核呈现皱缩现象，各腺小叶体积缩减，腺腔扩张加剧，出现大量空泡。经过干预处理后，中药组和阳药组泪腺病变损伤程度减轻，泪腺腺小叶萎缩减轻，腺管腔径较模型组明显缩小。见图3。

2.4 透射电镜观察各组泪腺自噬小体情况

在对照组泪腺中可以观察到圆形细胞核和分布广泛的粗面内质网，线粒体数量充足且内部嵴结构保持完好，同时存在丰富的自噬溶酶体。在模型组中，细胞核出现碎裂和萎缩现象，粗面内质网发生肿胀并扩张，数量明显减少，线粒体基质部分出现中到重度水肿，部分区域外膜变得模糊甚至断裂，嵴结构遭到严重破坏甚至消失，少见自噬溶酶体。中药组和阳药组较模型组改善明显，线粒体嵴结构依然保持相对完整，自噬溶酶体数量增多。见图4。

2.5 各组泪腺中PI3K、AKT、mTOR、p62、LC3蛋白相对表达结果

与对照组相比，模型组p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT、p‑mTOR/mTOR、p62水平明显升高，LC3‑Ⅱ/LC3‑Ⅰ水平明显降低（P<0.05）；与模型组相比，中药组、阳药组p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT、p‑mTOR/mTOR、p62水平明显降低，LC3‑Ⅱ/LC3‑Ⅰ水平明显升高（P<0.05）（图5）。

2.6 各组泪腺中PI3K、AKT、mTOR、p62、LC3 mRNA表达比较

与对照组相比，模型组泪腺组织中PI3K、AKT、mTOR及p62的mRNA表达量明显上调，LC3 mRNA表达量明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，中药组和阳药组泪腺组织中PI3K、AKT、mTOR及p62的mRNA表达量明显降低，LC3 mRNA表达量明显升高，差异均具有统计学意义（P<0.01）（表2）。

3 讨论

中国糖尿病患病人群规模居全球首位，约占国际糖尿病总病例数的22%^［12］，并且超过90%的患者属于2型糖尿病类别^［13］。干眼为糖尿病最常见的并发症之一，其并发率高达20%~40%^［14］。眼泪在眼球表面铺展成泪膜，作为角膜和结膜的首道防护屏障。泪膜自外向内结构依次为脂质层、水液层及黏蛋白层，其中，主要由泪腺负责分泌的水液层占据泪膜的主体部分。糖尿病患者体内长期高血糖状态影响泪腺正常的泪液分泌功能^［15］，改变了泪液成分，进一步破坏泪膜的稳定性，从而导致干眼形成。研究发现近50%糖尿病患者患有水液缺乏型干眼或蒸发过强型干眼^［16］，而这恰与泪腺具有较强关联。大鼠的眶内泪腺，也被称为哈德腺（Harderian gland），是泪液分泌的重要组成部分。因此，眶内泪腺的正常功能对于维持泪膜的稳定性至关重要^［17］。

研究发现通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活可有效缓解干眼进程^［18］。在非激活状态下，PI3K的组成部分包括调节亚基p85和催化亚基p110，它们结合形成二聚体结构，对PI3K的活化起到抑制作用。当细胞受到外界刺激后，PI3K转为激活状态^［19］，并催化下游分子磷脂酰肌醇4，5‑二磷酸（PIP2），使其产生磷脂酰肌醇3，4，5‑三磷酸（PIP3），进一步使AKT发生PDK1依赖性激活，之后被激活的AKT通过磷酸化激活下游靶点mTOR参与自噬过程^［20］。泪腺内线粒体自噬功能障碍与糖尿病干眼发病密切相关^［21］，自噬的发生是为了从细胞质中清除功能失调的线粒体，从而保留功能正常的群体保证生理功能。根据形态学与功能学研究表明^{［22，23］}，糖尿病患者泪腺中线粒体受损，进而自噬减少泪腺明显改变及受损，泪腺线粒体生物能活性缺陷，使得泪腺难以维持正常功能。LC3、p62都是自噬过程中的关键标记物：在自噬过程中，LC3‑Ⅰ在酶的作用下转变为LC3‑Ⅱ，并定位于自噬体膜。p62蛋白在自噬过程中与泛素化的蛋白结合，进而与LC3‑Ⅱ联结形成复合物，最终在溶酶体内被降解。因此，p62的水平与自噬活性成负相关，即p62水平低意味着自噬活性高^［25］。

中医理论认为，干眼归类于中医学“白涩症”“燥证”范畴，其发病缘由为津液亏损、泪液不足。糖尿病属中医学“消渴”范畴，核心病机为阴虚燥热，阴虚为根本，燥热为表象。高卫萍教授在临床上采用江苏省中医院内分泌科协定方二冬消渴方（专利号：CN 116637154 A）对2型糖尿病干眼患者进行综合治疗，成效明显^［26］。二冬消渴方中以天冬、麦冬滋阴清热，润燥生津同为君药；以天花粉清火益阴，石斛滋阴清热、生津止渴同为臣药；以黄连清热，夏枯草清肝名目，鬼针草清热祛风活血，山药生津，治疗虚热消渴，诸药同为佐药；以葛根生津退热，明显改善糖尿病阴虚日久而致虚火灼津为佐使药；全方滋阴清热，生津明目。

本研究与课题组前期结果相同，二冬消渴方干预后糖尿病干眼大鼠FL降低，BUT、PRT升高^［27］。就泪腺重量指数而言，模型组大鼠较对照组明显降低，经中药干预后泪腺指数改善明显；同时，对大鼠泪腺组织进行病理观察可以看到模型组泪腺较对照组泪腺萎缩，腺腔扩张出现大量空泡，中药干预后泪腺组织结构改善，病理损伤减轻，腺腔径缩小，说明二冬消渴方改善糖尿病干眼大鼠泪腺生理功能以缓解干眼疗效肯定。透射电镜下可以观察到对照组泪腺中线粒体、内质网丰富，可见较多自噬溶酶体；模型组泪腺中线粒体、内质网损伤加剧，结构被破坏，几乎不可见自噬溶酶体；中药干预后线粒体、内质网结构损伤改善，自噬溶酶体增多。模型大鼠泪腺组织中LC3‑Ⅱ/LC3‑Ⅰ表达比例降低，而p62水平升高；电镜观察显示线粒体损伤严重。经二冬消渴方干预后，泪腺组织中LC3‑Ⅱ/LC3‑Ⅰ表达比例上升，p62水平下降。上述实验结果证实泪腺萎缩与自噬功能障碍对糖尿病干眼具有明显影响。同时，本研究蛋白表达结果与mRNA表达结果一致，糖尿病干眼大鼠PI3K、AKT、mTOR表达增高，p62表达升高，LC3‑Ⅱ/LC3‑Ⅰ表达降低；经二冬消渴方治疗后，PI3K、AKT、mTOR表达被抑制，LC3‑Ⅱ/LC3‑Ⅰ表达升高，p62表达降低；提示二冬消渴方可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，增强泪腺组织自噬，进而发挥缓解2型糖尿病干眼的作用。

综上所述，二冬消渴方针对2型糖尿病患者的干眼治疗效果明显，可考虑从调节PI3K/AKT/mTOR通路入手，为患者提供更加有效的治疗方案。同时，这也为未来的干眼症研究提供了新的思路和方法。

作者贡献度说明：

何璐平：实施实验、分析数据并撰写；石李、孙心怡、姬慧杰：实验验证、相关文献搜集；高卫萍：设计实验、文章审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82474638)

江苏省卫生健康委干部保健科研项目(BJ23012)

一种具有治疗糖尿病干眼症的中药复方及其制备方法与应用专利(CN 116637154 A)