SAA1对食管鳞癌细胞上皮间质转化和干性特性的影响

Effect of SAA1 on epithelial‑mesenchymal transition and stemness properties of esophageal squamous cell carcinoma cells

摘要

目的 探究血清淀粉样蛋白A1（SAA1）对食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞上皮间质转化（EMT）和干性特性的影响。 方法 利用NCBI‑GEO数据库分析ESCC癌组织与正常组织中SAA1 mRNA的表达及细胞干性，TCGA数据库用于生存分析、差异表达基因分析及富集分析；利用SAA1过表达慢病毒或SAA1小干扰RNA（siRNA）对ESCC细胞进行SAA1的过表达或敲低，转录组测序筛选差异表达基因并进行富集分析；Western blot检测EMT相关蛋白和干性标志物表达；肿瘤球形成试验检测SAA1对ESCC细胞球形成能力的影响。 结果 ESCC癌组织中SAA1 mRNA表达明显高于正常组织，SAA1高表达的患者预后较差；TCGA数据集和SAA1过表达ESCC细胞转录组测序均富集到EMT相关基因；过表达SAA1上调了ESCC细胞中EMT相关蛋白N‑cadherin、Vimentin、Snail、Twist1以及干性标志物CD44的表达，下调了E‑cadherin的表达，敲低SAA1则具有相反的效果；过表达SAA1增强了ESCC细胞的球形成能力。 结论 SAA1在ESCC组织中显著上调，并且促进ESCC细胞的EMT和干性特性。

Abstract

Objective To explore the effect of serum amyloid A1 （SAA1） on epithelial‑mesenchymal transition （EMT） and stemness properties of esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） cells. Methods The expression of SAA1 mRNA and cell stemness in ESCC tissues were analyzed using the NCBI‑GEO database， and TCGA database was used for survival analysis， differentially expressed gene analysis and enrichment analysis. Overexpression or knockdown of SAA1 in ESCC cells was performed using SAA1 overexpression lentivirus or SAA1 small interfering RNA （siRNA）. Transcriptome sequencing was used to screen differentially expressed genes. Western blot was used to detect the expression of EMT‑related proteins and stemness markers. Tumorsphere‑formation assay was used to detect the effect of SAA1 on the sphere‑forming ability of ESCC cells. Results SAA1 mRNA expression in ESCC tissues was significantly higher than that in normal tissues. High SAA1 expression indicated a poor prognosis. EMT‑related genes were enriched in both the TCGA dataset and the transcriptome sequencing data of SAA1 overexpressing ESCC cells. Overexpression of SAA1 upregulated the expression of the EMT‑related proteins N‑cadherin， Vimentin， Snail and Twist1， as well as the stemness marker CD44， and downregulated the expression of E‑cadherin. Knockdown of SAA1 had the opposite effects. Overexpression of SAA1 enhanced the sphere‑forming capacity of ESCC cells. Conclusion SAA1 is significantly upregulated in ESCC tissues and promotes EMT and stemness properties of ESCC cells.

Graphical abstract

关键词

血清淀粉样蛋白A1 / 食管鳞状细胞癌 / 上皮间质转化 / 干性

Key words

Serum amyloid A1 / Esophageal squamous cell carcinoma / Epithelial‑mesenchymal transition / Stemness

据全球2022年最新统计，食管癌（esophageal carcinoma，EC）发病率居癌症发病率第11位，其死亡率居癌症死因的第7位。全世界每年约有40万人死于EC^［1］。我国EC的发病率和死亡率分别位于我国癌症第6位和第5位^［2］。尽管近年EC的发病率有所降低，但死亡率仍居高不下^［3］。EC可分为两种常见的病理类型，即食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。我国是EC高发地区之一，其中绝大部分的食管癌病理类型为ESCC。虽然目前对ESCC的诊断和治疗方面取得了一定的进步，但该病的5年生存率仍然很低。因此，需要更加深入地探索ESCC进展中的分子机制，以及确定新的生物标志物和潜在的治疗靶点。

血清淀粉样蛋白A1（serum amyloid A1，SAA1）是血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）家族4个成员（SAA1、SAA2、SAA3和SAA4）之一。SAA1和SAA2是急性期蛋白，具有高度同源性。SAA1是急性期SAA的一个主要类型，在炎症、动脉粥样硬化、自身免疫病和癌症中都有明显升高；SAA4是组成型表达蛋白，对于炎症的刺激反应较少；SAA3基因在人类基因中是假基因，但在小鼠中表达^［4］。SAA1参与了许多炎症性疾病的发病机制，并且越来越多的研究证实SAA1参与肿瘤的发生、发展^［4‑6］。SAA1作为一种非特异性的肿瘤标志物和独立的预后指标，在卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌等肿瘤的诊断和预后中起着重要作用^［7‑9］。近来研究发现在ESCC病人血清及癌组织中，SAA1表达高于正常水平^［10］。本课题组在研究中也发现SAA1在ESCC癌组织中的表达明显高于正常组织，并且SAA1可以调控β‑catenin促进ESCC细胞的增殖、迁移，并抑制其凋亡^［11］。由于β‑catenin在多种肿瘤中均可调控上皮间质转化（epithelial‑mesenchymal transition，EMT）或肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）特性，本研究将进一步探究在ESCC中，SAA1是否可以通过调控ESCC细胞EMT和干性特性进而促进ESCC的进展。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

胰酶、B‑27、RPMI‑1640培养液购自Gibco公司；青霉素和链霉素购自HyClone公司；胎牛血清购自四季青公司；无脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid‑free bovine serum albumin，FAF‑BSA）购自Sigma公司；Lipofectamine^TM2000转染试剂购自Invitrogen公司；细胞裂解液、BCA蛋白检测试剂盒、β‑actin抗体和羊抗兔二抗购自碧云天公司；ECL发光液购自Abbkine公司；SAA1抗体购自R&D System公司；E‑cadherin抗体、Vimentin抗体、Twist1抗体和CD44抗体购自Proteintech公司；Snail抗体和N‑cadherin抗体购自CST公司；特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）由吉玛公司合成；SAA1过表达（OE‑SAA1）慢病毒载体及阴性对照（OE‑NC）慢病毒载体的构建和病毒包装由吉凯基因公司完成；嘌呤霉素购自Solarbio公司；EGF、bFGF购自PeproTech公司。

1.2 生物信息学分析

利用R语言进行生物信息学分析。美国国立生物技术信息中心基因表达数据库（national center for biotechnology information gene expression omnibus，NCBI‑GEO）中GSE23400、GSE75241用于分析ESCC癌组织与正常组织中SAA1基因表达水平，单细胞数据集GSE188900用于细胞干性分析。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库中160份食管鳞癌患者样本用于生存分析、差异表达基因分析和Hallmark富集分析。

1.3 细胞培养

人ESCC细胞TE‑1来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，Eca109来源于中国典型培养物保藏中心。所有细胞均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI‑1640培养液，于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中进行常规培养。

1.4 SAA1过表达细胞株筛选及转录组测序

慢病毒感染TE‑1细胞，通过嘌呤霉素筛选出SAA1过表达（OE‑SAA1）细胞和阴性对照（OE‑NC）细胞。细胞以2.5×10⁵个/孔接种于6孔板，24 h后换液为含0.1% FAF‑BSA的RPMI‑1640培养液，继续培养48 h后收集细胞，用Trizol裂解，送至华大基因公司进行RNA提取和转录组测序，后续差异表达基因分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析、Hallmark富集分析和基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）利用华大多组学系统和R语言进行。

1.5 siRNA转染ESCC细胞

由于SAA1与SAA2在基因编码区上具有97%的同源性，蛋白质序列上具有93%的同源性，所以设计只针对SAA1的siRNA极为困难，目前文献中报道的针对SAA1的siRNA实际也同时针对SAA2。本研究成功设计了一个特异靶向SAA1的siRNA，命名为siRNA‑SAA1，另一靶向SAA1和SAA2的siRNA，命名为siRNA‑SAA1/2。所用序列分别为，siRNA‑NC：sense： 5'‑UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT‑3'，antisense： 5'‑ACGUGACA CGUUCGGAGAATT‑3'；siRNA‑SAA1：sense：5'‑CUCUUUCCCAACAAGAUUATT‑3'，antisense：5'‑UAAUCUUGUUGGGAAAGAGTT‑3'； siRNA‑SAA1/2： sense： 5'‑CUGGCCUGCCUGA GAAAUATT‑3'，antisense：5'‑UAUUUCUCAGG CAGG CCAGTT‑3'。选择生长良好的Eca109细胞，细胞以2.5×10⁵个/孔接种于6孔板，24 h后换液为含有0.1% FAF‑BSA的RPMI‑1640培养液，利用Lipofectamine^TM 2000转染试剂将siRNA转染细胞，转染48 h后收集细胞提取蛋白。

1.6 Western blot

用含有蛋白酶抑制剂的预冷RIPA裂解液裂解细胞。采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。总蛋白利用SDS‑PAGE电泳分离，转移到PVDF膜。用5% BSA‑TBST在室温下封闭PVDF膜2 h，并与一抗在4 ℃下孵育过夜。使用TBST洗膜3次，然后将膜与二抗在室温下孵育60 min，TBST洗膜3次，加入超敏型ECL发光液，用Tanon Chemi Dog 5200T显影成像，Image J软件分析蛋白相对表达量。各抗体稀释比例：SAA1 （1∶1 000）、E‑cadherin （1∶1 000）、Vimentin （1∶1 000）、Snail （1∶1 000）、N‑cadherin （1∶1 000）、Twist1 （1∶2 500）、CD44 （1∶1 000）、β‑actin （1∶1 000）、羊抗兔二抗 （1∶2 000）。

1.7 肿瘤球形成试验

选取生长良好的过表达SAA1及对照组的TE‑1细胞，胰酶消化，使用含有20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、20 μL/mL B‑27的RPMI‑1640培养液重悬，细胞计数，铺板于超低吸附24孔板中，每3 d观察细胞成球情况并拍照记录直径>100 μm肿瘤球数量。

1.8 统计学处理

所有数据均使用GraphPad Prism 8软件进行分析，并以平均±标准差（\overline{x}\pm s）表示。采用两样本t检验进行两组数据间的比较，而多组数据间的比较则采用方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。所有实验均至少独立重复3次。

2 结果

2.1 人ESCC组织SAA1的表达水平

分别对GEO数据集（GSE23400，GSE75241）进行SAA1基因表达水平分析。结果显示SAA1在ESCC癌组织中的表达高于正常组织（P<0.001，图1A、B）。

2.2 生存分析及差异表达基因富集分析

将TCGA数据库中ESCC样本根据SAA1表达量中值分为高、低表达组，进行生存分析，结果表明SAA1高表达的患者生存率更低（P<0.05，图2A）。以P<0.05，logFC>0.5为阈值，筛选差异表达基因（图2B），并对差异表达基因进行Hallmark富集分析。结果显示TCGA数据集中SAA1高、低表达组的差异表达基因显著富集到了包括JAK STAT、补体、TNF、EMT等相关信号通路（图2C）。

2.3 SAA1对ESCC细胞EMT的调节

课题组利用慢病毒感染TE‑1细胞成功构建SAA1过表达细胞^［11］。见图3A，分别提取SAA1过表达细胞和对照细胞RNA并进行转录组测序，筛选出4 888个差异表达基因。对差异表达基因进行KEGG和Hallmark富集分析，KEGG富集分析结果显示与EMT相关的MAPK信号通路被富集（图3B），Hallmark富集分析结果显示EMT通路相关基因被富集（图3C）。GSEA富集分析结果显示EMT通路相关基因被显著激活（图3D）。

为了探究SAA1是否参与了ESCC细胞的EMT过程，在ESCC细胞中过表达或敲低SAA1，观察细胞形态的变化，以及检测EMT相关标志物蛋白E‑cadherin、N‑cadherin、Vimentin，EMT相关调控蛋白Snail、Twist1的表达。形态学结果显示，相较于对照细胞，SAA1过表达的TE‑1细胞，其形态呈梭形，伪足更长（图4A）。Western blot结果表明，SAA1过表达的TE‑1细胞，其N‑cadherin、Vimentin、Snail、Twist1的表达高于对照细胞的表达，E‑cadherin的表达低于对照细胞的表达（P<0.01）；反之，在SAA1敲低的Eca109细胞中，其N‑cadherin、Vimentin、Snail、Twist1的表达低于对照细胞的表达，E‑cadherin的表达高于对照细胞的表达（P<0.001，图4B、C）。

2.4 SAA1对ESCC细胞干性特性的调节

利用ESCC单细胞测序数据集GSE188900进行细胞干性分析，将6 025个恶性上皮细胞根据是否表达SAA1，分为SAA1阳性和SAA1阴性细胞。结果表明SAA1阳性细胞的细胞干性指数高于SAA1阴性细胞（P<0.001，图5A）。通过Cytotrace V2根据干性指数将6 025个恶性上皮细胞分成6类细胞：具有广泛分化潜能的全能干细胞和多能干细胞，能够产生不同数量的下游细胞类型的谱系限制性多能细胞，多能细胞和单能细胞，再到最终的分化细胞。SAA1阳性率在谱系限制性多能细胞（40%）中高于单能细胞（34%）与分化细胞（5%）（图5B、C）。

应用Western blot检测干性相关标志物CD44的蛋白表达。结果显示，与对照细胞相比，在ESCC细胞中过表达SAA1促进CD44蛋白表达，而敲低SAA1抑制CD44蛋白表达（P<0.05），见图6。

利用SAA1过表达的TE‑1细胞进行肿瘤球形成试验，过表达组中>100 μm的肿瘤球数量明显多于对照组，表明SAA1过表达的TE‑1细胞具有更强的细胞球形成能力（P<0.01，图7）。

3 讨论

SAA1参与肿瘤的发生、发展，现研究中发现SAA1可通过炎症、肿瘤微环境等途径影响肿瘤的发生、发展。在神经胶质瘤中，敲低SAA1可抑制AKT磷酸化，从而导致神经胶质瘤细胞凋亡^［12］；在卵巢癌中高表达SAA1的患者相较于低表达SAA1患者生存率更低^［13］；在肾癌中，敲低SAA1抑制了肾癌细胞的增殖和迁移，进而抑制肾细胞癌的发展^［14］。本课题组在研究中发现SAA1可以诱导β‑catenin的磷酸化，进而影响ESCC细胞的增殖和迁移^［11］。在本研究中SAA1在ESCC癌组织中高表达并与生存率呈负相关，说明SAA1促进ESCC的发生、发展。

EMT是发育、伤口愈合和干细胞分化不可或缺的过程，并在病理上导致纤维化和促进肿瘤的发生。研究表明，在食管鳞癌、卵巢癌、口腔鳞癌等肿瘤中，EMT可增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，对肿瘤的转移至关重要^［15］。本研究通过生物信息学分析，将TCGA中ESCC样本根据SAA1的表达量分组并进行富集分析，同时对转录组测序结果进行富集分析，结果表明EMT通路相关基因被显著富集。SAA1过表达的ESCC细胞表型由上皮样向间质样转变。Western blot结果表明SAA1可以调节ESCC细胞EMT相关标志物蛋白和调控蛋白的表达。EMT的发生受多种信号通路的调节，如：JAK STAT、MAPK/ERK、β‑catenin等信号通路^［16］。β‑catenin信号通路在包括EC在内的多种人类癌症中促进肿瘤细胞EMT，例如，在食管鳞癌中，相较于单独敲低EphA5，同时敲低EphA5和β‑catenin下调了EMT相关标志物N‑cadherin、Vimentin表达，增加E‑cadherin表达^［17］；在胃癌中，β‑catenin能激活TFAB介导的EMT和肿瘤转移；在卵巢癌中，抑制β‑catenin信号通路，可抑制EMT相关标志物N‑cadherin、Vimentin表达，增加E‑cadherin表达并抑制肿瘤细胞迁移；在结直肠癌中，NCAG会诱导β‑catenin，增强肿瘤的EMT和侵袭能力^［18］。课题组之前的研究发现，SAA1可调控β‑catenin的磷酸化^［11］，SAA1可能通过β‑catenin影响EMT过程。

CSC是癌症中一小群高度恶性的细胞，它们参与肿瘤的发生、自我更新，对放射和化学疗法的抵抗以及逃避免疫监视具有关键作用。在大多数人类肿瘤中都发现了CSC群，包括胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和食管鳞癌等，它们在肿瘤的发病机制中起着重要作用，是肿瘤治疗的潜在靶点^［19］。本研究通过生物信息学分析ESCC单细胞测序数据发现，SAA1阳性的恶性上皮细胞相较于SAA1阴性的恶性上皮细胞具有更强的干性指数。SAA1可以上调干性标志物蛋白CD44的表达。肿瘤球形成试验发现过表达组相较于对照组具有更强的细胞球形成能力。以上结果都表明SAA1可以促进ESCC细胞的干性特性。

EMT作为CSC的主要调节因素也在多篇文献中报道^{［16‑19］}，在大部分研究中发现肿瘤细胞可通过EMT增强干性特性，不仅可以使非肿瘤干细胞转换为肿瘤干细胞，还可以促进它们的自我更新与干性标志物的表达。CD44作为CSC的标志物受到Twist1的调节，Twist1通过与启动子结合调控SOX2、CD44、GDF3、NANOG、MEIS1和SAL4基因的表达^［19］。有研究报道Twist1通过调节CD24，使CD24阳性细胞减少而CD44阳性细胞增加，以此来增加乳腺癌干性特性^［20］。此外Twist1可通过降低E‑cadherin的表达来促进肿瘤细胞的EMT^［21］。本研究中EMT可能导致了干性特性的产生，如间质细胞特征的增加、干性标志物表达的增加、肿瘤细胞球形成能力增强。结合我们之前的研究，SAA1可能通过β‑catenin来调控ESCC细胞的EMT和干性特性，促进ESCC细胞的增殖、迁移等，进而参与ESCC的恶性进展。

综上所述，SAA1在ESCC组织和ESCC细胞中高表达，并且可以促进ESCC细胞的EMT和干性特性，参与ESCC的进展。后续课题组将进行进一步实验探究SAA1与EMT及干性特性的关系，为ESCC诊断治疗及预后提供可能的新思路。

作者贡献度说明：

赵世聖：设计实验、完成实验、论文撰写；李倩倩：完成实验；王荣婧、江楠、唐茂林：数据统计及分析；胡为民：设计实验、论文指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

南充市市校科技战略合作专项(20SXQT0332)

南充市市校科技战略合作专项(19SXHZ0344)