丙酰肉碱调控xCT/GPX4铁死亡途径并缓解骨质疏松症进展

Propionylcarnitine regulates the xCT/GPX4 ferroptosis pathway and alleviates osteoporosis progression

摘要

目的 探讨丙酰肉碱在调控xCT/GPX4铁死亡通路及改善骨质疏松症中的潜在机制，揭示其在铁死亡与成骨活性调节中的双重作用。 方法 考察丙酰肉碱对前成骨细胞MC3T3‑E1中铁死亡通路和成骨相关蛋白表达的影响，采用铁死亡激动剂对MC3T3‑E1进行预处理，经丙酰肉碱和铁死亡抑制剂治疗后，通过活性氧自由基（ROS）免疫荧光染色、MDA检测、线粒体透射电镜和Western blot等方法检测细胞的铁死亡相关指标；通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色和Western blot方法检测成骨相关蛋白的表达。构建SD大鼠双侧卵巢切除（OVX）骨质疏松症模型，采用丙酰肉碱处理，3个月后收集大鼠股骨组织标本，通过Micro‑CT扫描和组织H&E染色，分析组织标本中骨密度、骨小梁等参数的变化。 结果 细胞实验结果表明，铁死亡抑制剂或丙酰肉碱处理后，MC3T3‑E1细胞中抗铁死亡相关蛋白（GPX4/xCT）表达水平明显升高，细胞中线粒体形态有所改善；此外，这两组的碱性磷酸酶活性、钙沉积量和成骨相关蛋白表达也明显增高。大鼠股骨Micro‑CT结果显示，丙酰肉碱处理组相较于OVX模型组，骨组织中骨小梁密度和骨小梁数量增加。H&E染色显示丙酰肉碱处理组骨小梁厚度相较于OVX模型组明显增高。 结论 丙酰肉碱可减少铁死亡激动剂诱导的前成骨细胞铁死亡，上调其成骨活性，并可在OVX大鼠中改善其骨质疏松症的进展。

Abstract

Objective To investigate the potential mechanism of propionylcarnitine in regulating xCT/GPX4 ferroptosis pathway and improving osteoporosis， and to reveal its dual role in the regulation of ferroptosis and osteogenic activity. Methods The effect of propionylcarnitine on ferroptosis pathway and osteogenesis‑related protein expression in pre‑osteoblasts MC3T3‑E1 was investigated. MC3T3‑E1 was pretreated with ferroptosis agonist， and after treatment with propionylcarnitine and ferroptosis inhibitors， ROS immunofluorescence staining， MDA detection， mitochondrial transmission electron microscopy and Western blot were used to detect ferroptosis‑related indexes of cells. The expression of osteogenesis‑related proteins was detected by alkaline phosphatase staining， alizarin red staining and Western blot. An osteoporosis model of bilateral oophorectomy （OVX） in SD rats was constructed， treated with propionylcarnitine， and femur tissue samples were collected three months later， and the changes of bone density， trabecular bone and other parameters in the tissue samples were analyzed by Micro‑CT scanning and tissue H&E staining. Results The results of cell experiments showed that the expression level of anti‑ferroptosis‑related proteins （GPX4 / xCT） in MC3T3‑E1 cells was significantly increased after ferroptosis inhibitor or propionylcarnitine treatment， and the mitochondrial morphology in cells was improved. In addition， alkaline phosphatase activity， calcium deposition and osteogenesis‑related protein expression were also significantly increased in these two groups. The results of micro‑CT of the femur of rats showed that the trabecular bone density and trabecular number in the bone tissue of the propionylcarnitine treatment group increased compared to the OVX model group. H&E staining showed that the trabecular bone thickness in the propionylcarnitine treatment group was significantly higher than that in the OVX model group. Conclusion Propionylcarnitine can reduce ferroptosis induced by ferroptosis agonist， up‑regulate osteogenic activity， and improve the progression of osteoporosis in OVX rats.

Graphical abstract

关键词

丙酰肉碱 / 活性氧自由基（ROS） / 铁死亡 / 骨质疏松 / xCT/GPX4

Key words

Propionylcarnitine / ROS / Ferroptosis / Osteoporosis / xCT/GPX4

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis）是因衰老、雌激素减少等多种因素导致的一种以骨密度降低、骨小梁减少为特征的全身性骨代谢疾病^［1，2］。患者骨密度降低，发生脆性骨折的风险也随之增高，该疾病所引起的骨折和疼痛严重影响患者的生命健康和生活质量^［3，4］。因此，尽管目前已有治疗方法，但针对该疾病病理机制的精准靶向干预手段仍有限。

破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞介导的骨形成之间的骨稳态（bone homeostasis）失衡是骨质疏松症发病的病理基础^［5，6］。有研究表明，绝经后骨质疏松症患者体内由于铁蛋白沉积导致的成骨细胞铁死亡是骨形成弱于骨吸收导致骨稳态破坏的重要因素^［7，8］。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的细胞程序性死亡，其功能的实现由铁依赖性磷脂过氧化驱动^［9，10］。其产生的过程为体内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）积累，导致细胞内不稳定铁离子发生芬顿反应，产生氧化性更强的脂质活性氧和羟基自由基，可诱发细胞膜磷脂发生过氧化，最终导致细胞铁死亡^{［11‑13］}。在正常人体细胞中，存在着抗氧化和抗铁死亡相关的通路，其中胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白（system X⁻，xCT）/谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPX4）途径扮演着重要角色^{［14，15］}。GPX4的抗氧化功能依赖于GSH作为其辅酶。尤其在氧化应激条件下，xCT的表达通常会增加，以增强细胞对半胱氨酸的摄取，从而促进GSH的合成，增强其抗铁死亡的能力。但是当铁死亡发生时该通路无法处理过高的氧化应激水平而表达降低^［16］。因此该通路也常用来评估细胞铁死亡水平。过去有研究表明，维生素D受体（VDR）可以通过刺激成骨细胞中的Nrf2/GPX4通路来减轻成骨细胞铁死亡^［17］。并且在衰老或绝经患者组织微环境中，脂质活性氧累积造成脂质过氧化，xCT和GPX4蛋白水平降低，最终导致成骨细胞细胞膜受损和铁死亡发生，破坏骨稳态^{［18，19］}。因此，降低骨质疏松患者体内成骨细胞ROS水平、抑制细胞铁死亡通路可能是恢复骨稳态的一种有效策略。

有研究证明左旋肉碱（L‑carnitine）可促进人成骨细胞样细胞中的细胞分化和骨基质蛋白表达，而且还可调节骨质疏松症中的巨噬细胞极化来抑制破骨细胞生成^{［20，21］}。除此之外，左旋肉碱还具有增强线粒体活性和清除自由基的功能^{［22，23］}。左旋肉碱的代谢产物酰基肉碱是肉碱的酰基化衍生物，其功能之一是作为肉碱的补充剂而存在^［24］。并且在过去的研究中发现，左旋肉碱的其中一个衍生物乙酰肉碱具有一定程度的抗氧化功效^{［25，26］}。它的另外一个酰基肉碱形式丙酰肉碱（propionylcarnitine）是否和乙酰肉碱同样具有抗氧化和抗细胞铁死亡的功能目前尚不明确。

本实验旨在确定左旋肉碱的衍生物丙酰肉碱可否调控成骨细胞xCT/GPX4铁死亡通路及改善骨质疏松症，揭示其在铁死亡与成骨活性调节中的双重作用，为丙酰肉碱在骨质疏松症方面的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

本研究所用到的试剂包括：α‑MEM培养基（白鲨，中国，Cat NO：NL306A），胎牛血清（Gibco，美国，LOT 2281654CP），青霉素‑链霉素溶液（白鲨，中国，Cat NO：BL505A），L‑抗坏血酸（Sigma，美国，CAS NO：50‑81‑7），β‑甘油磷酸钠（Sigma，美国，CAS NO：154804‑51‑0），铁死亡激动剂Erastin（MCE，美国），铁死亡抑制剂Ferrostatin‑1（MCE，美国，HY‑100579），丙酰肉碱（Propionylcarnitine，Sigma，美国，42602），RIPA裂解液（碧云天，中国，BL504A），β‑actin（Affinity，中国，Cat.＃AF7018），骨钙素（OCN，Affinity，中国，Cat.＃DF12303），Runt相关转录因子（RUNX2，Affinity，中国，Cat.＃AF5186），xCT（Affinity，中国，Cat.＃DF12509），GPX4（Affinity，中国，Cat ＃DF6701），ROS检测试剂盒（碧云天，中国，S0033S），MDA检测试剂盒（碧云天，中国，S0131S），DAPI（塞维尔，中国，Lot：CR2405122），碱性磷酸酶检测试剂盒（翌圣生物，中国，40749ES60），茜素红染色液（索莱宝，中国，Cat＃G1452），戊二醛固定液（索莱宝，中国，P1126），4%多聚甲醛（白鲨，中国，BL539A）。

1.2 实验动物

24只6~8周的SD雌性大鼠，体重200~240 g，购自北京凌菲生物科技有限公司（许可证号：SCXK（浙）2024‑0002），喂养条件为20~26 ℃，湿度30%~70%，每天正常喂养。本实验已经过蚌埠医科大学伦理审查委员会批准（2024437）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及处理

MC3T3‑E1细胞培养于α‑MEM完全培养基（含10%胎牛血清和1%青‑链霉素）中，接种于6孔板上。培养至铺满孔板70%后，更换为成骨诱导培养基（含10%胎牛血清，1%青链霉素，10 mmol/L β‑甘油磷酸钠，50 μg/mL L‑抗坏血酸，10 nmol/L地塞米松）。培养至第7天，将细胞分为4组，分别是空白对照（Control）组、铁死亡激动剂（Erastin）组、铁死亡激动剂+抑制剂（Ferrostatin‑1）组、铁死亡激动剂+丙酰肉碱（Propionylcarnitine）组。其中Control组不做任何处理；在铁死亡激动剂组加入8 μmol/L Erastin；铁死亡激动剂+抑制剂组加入8 μmol/L Erastin和20 mmol/L铁死亡抑制剂Ferrostatin‑1；铁死亡激动剂+丙酰肉碱组加入8 μmol/L Erastin和4 μmol/L 丙酰肉碱。共同培养至第14天。

1.3.2 CCK‑8检测丙酰肉碱、Ferrostatin‑1、Erastin的最佳浓度

以5×10³/孔的浓度，每孔200 μL的数量将前成骨细胞悬液种植在96孔板上，将96孔板放置于37 ℃、5% CO₂浓度的细胞培养箱过夜待细胞贴壁。24 h后更换含有Ferrostatin‑1和丙酰肉碱的DMEM/F12完全培养基。其中，Erastin的浓度梯度为0、1、2、4、8、16 μmol/L，Ferrostatin‑1的浓度梯度为0、5、10、20、40、80 mmol/L，丙酰肉碱的浓度梯度为0、1、2、4、8、16 μmol/L。培养至第2天后以10∶1的比例配比DMEM/F12完全培养基和CCK‑8溶液作为工作液。将96孔板中的培养液吸出，用PBS冲洗2次，在避光条件下每孔加入100 μL工作液。将96孔板在避光、37 ℃的条件下孵育2 h。2 h后取出96孔板，测量其450 nm的吸光度值。

1.3.3 MDA氧化检测

细胞处理方法和“1.3.1”相同。将T25培养瓶中的细胞用细胞刮刀转移进15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min。5 min后弃上清加入RIPA裂解液冰上裂解20 min。将裂解液转引进2 mL离心管中15 000×g离心30 min取上清为细胞蛋白。取一部分用于BCA测量蛋白含量，剩余样品测量MDA含量。以150∶50∶3的比例将TBA稀释液和TBA储存液及抗氧化剂混合配成TBA工作液。每100 μL蛋白溶液中加入200 μL的TBA工作液，充分混合，100 ℃水浴15 min。使用蛋白样品充分混匀，100 ℃孵育15 min，测定在540 nm的吸光度值。

1.3.4 碱性磷酸酶染色

实验分组和“1.3.1”一致。在细胞经过成骨培养基诱导后使用药物处理至第7天，去掉培养液，使用PBS溶液清洗两遍，加入4%多聚甲醛固定15 min。PBS冲洗后，采用碱性磷酸酶检测试剂盒处理细胞，观察染色结果并拍照。

1.3.5 茜素红染色

实验分组和“1.3.1”一致。在细胞经过成骨培养基诱导后使用药物处理至第14天，经PBS溶液清洗、4%多聚甲醛固定，随后加入1 mL茜素红染液，室温孵育10 min。随后PBS清洗2~3遍，观察并拍照。

1.3.6 免疫荧光

1.3.6.1 固定

细胞处理方法和“1.3.1”相同。将6孔板中的培养基吸出，加入PBS清洗2次。清洗完成后在每个孔中加入1 mL 4%多聚甲醛固定室温下固定15 min。待细胞固定完成后将固定液吸出，使用PBS冲洗3次，每次3 min，将多余的固定液冲洗出去。去除多余固定液后加入0.3%的triton×100，孵育20 min使细胞膜穿透。20 min后吸出多余的triton，加入PBS在恒温摇床上清洗2遍。

1.3.6.2 封闭

将山羊血清和PBS 1∶9稀释为10%山羊血清。将10%山羊血清加入细胞中封闭90 min。90 min后吸出多余的山羊血清，加入PBS在恒温摇床上清洗3次，每次15 min。

1.3.6.3 抗体孵育

将所要用到的免疫荧光一抗（OCN、RUNX2、GPX4、xCT）和山羊血清以1∶200的比例稀释加入到细胞培养板中，在恒温摇床上孵育90 min。90 min后将一抗回收，加入PBST清洗3次以去除没有结合的一抗。以1∶200的比例使用山羊血清稀释荧光二抗，每孔加入1 mL稀释过的荧光二抗覆盖全部细胞，避光孵育90 min。90 min后回收二抗，避光放置于-20 ℃长期保存。PBST在恒温摇床上清洗3遍，每次10 min，去除未结合的二抗。每孔加入1 mL DAPI染液，避光孵育15 min后将DAPI回收。PBST在恒温摇床上清洗3遍每次10 min以去除未结合的DAPI染液。每孔加入PBS后使用锡箔纸包起来防止荧光猝灭，尽快在荧光倒置显微镜下观察，拍照并记录。

1.3.7 Western blot分析

实验分组和“1.3.1”一致，在细胞经过成骨培养基诱导后使用药物处理至第14天后将细胞收集至离心管内，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂）冰上裂解30 min，离心去除上清后，加入SDS‑PAGE上样缓冲液100 ℃煮10 min。上样使用快速电泳液恒压220 V跑胶20 min。使用免水浴快速转膜液恒流400 mA转膜20 min。转膜结束后，使用快速封闭液封闭PVDF膜15 min。加入GPX4、xCT、OCN、RUNX2一抗4 ℃孵育过夜。随后，使用TBST清洗PVDF膜2遍，加入二抗室温孵育90 min。使用ECL化学发光液曝光并拍照。

1.3.8 ROS检测

实验分组和“1.3.1”一致，在细胞经过成骨培养基诱导后使用药物处理至第14天后，按照ROS检测试剂盒指示装载探针。在倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.3.9 线粒体形态观察

使用细胞刮刀收集细胞于1.5 mL离心管中，1 000×g离心10 min。弃上清，沿管壁缓慢加入4 ℃预冷的2.5%戊二醛固定液，放入冰箱4 ℃保存。在生物透射电镜下观察其线粒体形态。

1.3.10 鼠OVX骨质疏松模型构建及给药

健康6~8周龄雌性SD大鼠，随机分为4组：骨质疏松症模型（OVX）组、骨质疏松症模型+PBS（PBS）组、骨质疏松模型+丙酰肉碱（Propionylcarnitine）组，每组6个平行样。其中，假手术（Sham）组大鼠仅进行皮肤切开和缝合，不进行其他手术和给药处理，设为空白对照组。其余3组均进行双侧卵巢切除术以进行骨质疏松症造模：大鼠首先采用350 mg/kg的剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液实施术前麻醉，剔除其背部毛发，俯卧位固定。在腹背部两侧开1~2 cm切口，逐层切开组织，进入腹腔后摘除双侧卵巢并结扎，逐层缝合。术后连续1周给大鼠肌肉注射青霉素（4万单位/d），以预防手术感染。

剩余3组中，OVX组大鼠仅进行卵巢切除术、不给药治疗，设为阴性对照组。行卵巢切除术2个月后，OVX+PBS组以2 mL/d的剂量灌胃给药作为阴性对照组用于排除溶剂的作用，OVX+Propionylcarnitine组以3 μg∙kg^‑1∙d^‑1的剂量灌胃给药丙酰肉碱溶液，丙酰肉碱的给药时间为1个月。4组大鼠共同饲养3个月后，对所有大鼠进行双侧股骨灌注取材。取出的股骨先对其远端矢状面进行Micro‑CT扫描，再脱钙30 d进行切片和染色。

1.3.11 Micro‑CT扫描分析

将SD大鼠麻醉后取仰卧位，打开腹腔暴露心脏，先灌注200 mL PBS，待右心耳中流出的血液为透明的PBS后，将灌注液换为4%多聚甲醛。将大鼠的股骨取下，使用股骨远端矢状位进行Micro‑CT扫描。

1.3.11.1 扫描

所有取样标本进行固定处理后进行Micro‑CT扫描。扫描参数为：射线管电流200 μA，电压70 kV，扫描整个物体，扫描分辨率6.534 165 μm，曝光时间350 ms，扫描角度180°。相同条件下扫描体模（Phantom；设备生产商统一配置提供）进行标定。扫描后得到原始图像。

1.3.11.2 重建

使用三维重建软件NRecon（软件版本V1.7.4.2，德国Bruker公司）对原始图像进行选择区域的重建。重建前，先对重建图像进行预览。为了降低图像伪影，以达到最佳重建效果，调整重建参数，设定为以下各值：Smoothing=5（平滑度）、Beam‑hardening=8（光线强度）、Ring artifacts=25%（环状尾影）等参数。参数设置好后，编辑选定指定文件夹开始图像重建。

1.3.12 H&E染色

将取下的大鼠股骨脱钙30 d后，进行脱水、浸蜡、包埋，最后进行冷冻和凝固。使用切片机切成4 μm的薄片，待烤片后常温保存。

1.4 统计学处理

使用SPSS 23.0进行统计学分析，所有数据和统计分析遵循药理学实验设计的建议。从3次重复实验中收集所有实验数据，并以\overline{x}\pm s表示。其中多组之间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较用最小差异性检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Erastin、Ferrostatin‑1、丙酰肉碱的最佳药物浓度

为确定细胞可承受的最佳药物浓度，选取了几种不同的浓度诱导MC3T3‑E1细胞，最后通过CCK‑8分析细胞活性。Erastin处于0、1、2、4、8、16 μmol/L的浓度时，细胞活性随药物浓度增加而降低。Erastin为铁死亡激动剂，在适宜的浓度下可以诱发前成骨细胞铁死亡，过高的浓度会导致细胞大量死亡，影响实验结果，最终选择8 μmol/L（P<0.001）作为最终诱导浓度进行后续实验（图1A）。当Ferrostatin‑1处于0、5、10、20、40、80 mmol/L的浓度时，细胞在20 mmol/L的Ferrostatin‑1浓度时活性无明显变化，但是当药物浓度达到40 mmol/L时细胞活性出现降低（P<0.001），当药物浓度达到80 mmol/L时细胞活性降低明显，因为Ferrostatin‑1为铁死亡抑制剂，过高的剂量会影响实验结果，因此选择20 mmol/L（P=0.059）作为实验剂量（图1C）。当丙酰肉碱处于0、1、2、4、8、16、32 μmol/L的浓度时，细胞活性在8 μmol/L时出现降低见图1B（P<0.05），为避免浓度过高影响实验结果，最终选取4 μmol/L（P=0.754）作为最终诱导浓度（图1B）。

2.2 使用丙酰肉碱前后ROS、MDA含量检测

观察荧光强度发现，Erastin组ROS荧光强度较Control组明显增加（P<0.005），阳性对照组和实验组较Erastin组ROS荧光强度明显减低（P<0.005）。MDA含量和ROS荧光强度观察到的结果一致。阳性对照组和实验组的MDA含量明显少于Erastin组（P<0.005），和Control相当。见图2A~C。

2.3 使用丙酰肉碱前后的线粒体形态变化检测

红色箭头指向为线粒体。当细胞发生铁死亡时线粒体皱缩并伴有嵴减少、内膜折叠度降低等。相较于Control组，在Erastin组可以很明显地看出。而在阳性对照组和治疗组中线粒体形态饱满，结构完整，并未出现破裂。见图3。

2.4 碱性磷酸酶和茜素红染色检测在使用丙酰肉碱前后的成骨分化影响

碱性磷酸酶为成骨早期分泌的蛋白，大概在成骨诱导第7天分泌达到顶峰，在加入了Erastin诱导后细胞的碱性磷酸酶分泌量相较于Control明显减少，在加入了铁死亡抑制剂后碱性磷酸酶分泌量上升，并且在治疗组表现出和阳性对照组相同的效果，这暗示了丙酰肉碱可能具有和铁死亡抑制剂相同的功效。见图4A。茜素红是晚期成骨的指标，在成骨诱导至第14天可被观察到，其结果和碱性磷酸酶染色结果一致。见图4B。该部分证明了丙酰肉碱可影响铁死亡激动剂诱导下的成骨分化。

2.5 Western blot检测丙酰肉碱对Erastin处理下的成骨和铁死亡影响

为确定丙酰肉碱处理后的细胞成骨和铁死亡通路xCT/GPX4的蛋白表达，使用蛋白免疫印记法进行检测。当丙酰肉碱处理后，细胞成骨蛋白和铁死亡抑制通路蛋白表达量增高和阳性对照组一致，见图5A~E。统计结果说明了丙酰肉碱可以通过调控成骨前体细胞xCT/GPX4铁死亡途径改善细胞成骨，见表1。

2.6 免疫荧光检测丙酰肉碱对Erastin处理下的成骨和铁死亡影响

为进一步确定细胞内成骨和铁死亡蛋白的表达，使用细胞免疫荧光的方法检测。其中A为荧光图片成骨相关蛋白OCN和RUNX2，铁死亡通路蛋白xCT、GPX4，见图6。统计结果与Western blot实验一致，给予4 μmol/L丙酰肉碱后细胞成骨蛋白和铁死亡通路蛋白相较于Erastin组表达增加，见表2。说明丙酰肉碱可以通过调控成骨前体细胞xCT/GPX4铁死亡途径改善细胞成骨。

2.7 Micro‑CT检测丙酰肉碱对OVX大鼠骨密度的影响

为进一步确定丙酰肉碱的药用价值，使用丙酰肉碱对SD大鼠进行了灌胃处理。在灌胃1个月后，取出大鼠远端股骨，进行矢装位扫描。观察股骨远端矢装位骨密度、骨小梁数量、骨体积占组织体积比。给予丙酰肉碱灌胃处理后，大鼠骨密度和骨小梁数量、骨小梁分离度、骨体积/组织体积比相较于未经处理的SD大鼠骨质疏松模型均有一定程度的恢复，见图7A~E、表3。

2.8 H&E染色检测丙酰肉碱对OVX大鼠骨组织的影响

为进一步确定丙酰肉碱的药用价值，使用丙酰肉碱对SD大鼠进行了灌胃处理。在灌胃1个月后，取出大鼠远端股骨，进行H&E染色。见图8。相较于未经任何处理的OVX组大鼠，经过丙酰肉碱处理过的SD大鼠股骨远端骨组织面积变多，骨小梁连续性和厚度转好肉眼可见，这提示丙酰肉碱具有一定程度的缓解骨质疏松的作用。

3 讨论

骨稳态破坏是骨质疏松发生的关键原因。在骨稳态被破坏的前提下，成骨细胞活性弱于破骨细胞，骨吸收大于骨形成。过去有大量研究表明，骨髓间充质干细胞可通过WNT/β‑Catenin通路和经典的成骨相关通路RUNX2/SP7促进其分化为成骨细胞^{［27，28］}。但前人研究多集中在如何调控这两个通路来刺激成骨活性，改善骨质疏松。近来研究发现，成骨细胞铁死亡可能是骨质疏松骨稳态被破坏的重要原因。

铁死亡的发生是由于体内ROS过量聚集导致细胞脂质过氧化升高^［29］。本研究发现，丙酰肉碱可下调铁死亡激动剂诱导后的前成骨细胞中ROS水平，改善线粒体形态，并上调抗铁死亡关键蛋白xCT、GPX4的表达。此外，检测前成骨细胞的成骨相关指标，包括碱性磷酸酶活性、钙沉积量及RUNX2和OCN的表达，发现丙酰肉碱处理在改善成骨细胞铁死亡后，细胞中成骨相关蛋白表达明显上调，与铁死亡抑制剂具有相似的作用。这一结果说明，丙酰肉碱可通过抑制铁死亡通路促进前成骨细胞的成骨活性。最后，通过体内给药方式考察丙酰肉碱在OVX模型大鼠体内缓解骨质疏松的效果。结果表明，在给予丙酰肉碱或铁死亡抑制剂后，OVX模型大鼠的骨密度和骨小梁数量上调，骨质疏松得到改善，这说明丙酰肉碱具有改善骨质疏松进展的能力。但是，本研究中并未对OVX大鼠骨组织标本进行免疫组化、免疫荧光等蛋白表达相关的验证实验，因此在动物实验部分不能证明丙酰肉碱可以通过铁死亡途径来缓解骨质疏松。并且本研究中没有通过敲低和过表达铁死亡相关的通路来进一步确定丙酰肉碱的具体作用机制，丙酰肉碱的作用靶点还需要进一步实验证明。

早期的研究中发现左旋肉碱可降低细胞ROS水平^［30］。这可能是由于左旋肉碱促进了TGA循环，而TGA循环过程中会产生一定量的还原性氢离子，这些氢离子将优先结合氧化性更强的自由基，借此可减少ROS的产生。丙酰肉碱作为左旋肉碱的代谢产物，补充丙酰肉碱后体内的左旋肉碱含量增加^［31］。因此丙酰肉碱可以抵抗铁死亡的具体作用机制可能是通过左旋肉碱促进TGA循环所产生的还原性氢离子在起作用。

综上所述，本研究结果证实丙酰肉碱具有缓解骨质疏松症的作用，其机理可能是通过清除细胞内源性ROS生成，进而调控xCT/GPX4铁死亡信号途径来实现的。本研究拓展了对丙酰肉碱生物学功能尤其是在抗骨质疏松方面的认识，为其潜在的临床应用提供了进一步的实验支撑。

作者贡献度说明：

梁田：研究设计，文章撰写；徐陈、刘柯：研究实施，数据收集整理；黄家辉，陈龙，于浩杰：统计分析；官建中：对文章的知识性内容作批评性审阅，行政支持。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

安徽省自然科学基金项目(2408085MH235)

安徽省优秀科研创新团队(2024AH010020)

安徽省厅级重点实验室开放课题重点项目(AHTT2024A002)