Th1/Th2、Th17/Treg失衡与儿童激素耐药型肾病综合征的相关性分析

Correlation between Th1/Th2, Th17/Treg imbalance and steroid‑resistant nephrotic syndrome in children

摘要

目的 探讨辅助性T细胞（helper T cell，Th）Th1/Th2、Th17/调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）失衡与儿童激素耐药型肾病综合征（steroid‑resistant nephrotic syndrome，SRNS）的相关性。 方法 招募原发性肾病综合征患儿142例，给予4周的糖皮质激素治疗，根据治疗反应将患儿分为激素敏感型肾病综合征（steroid‑sensitive nephrotic syndrome，SSNS）31例（SSNS组）和SRNS 111例（SRNS组），另选择53例健康儿童作为对照组。检测外周血Th1/Th2、Th17/Treg，分析影响SRNS的相关因素以及Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS的价值。 结果 SRNS组、SSNS组外周血Th2、Th17、Th17/Treg比值水平高于对照组（P<0.05），且SRNS组高于SSNS组（P<0.05），SRNS组、SSNS组Th1、Treg、Th1/Th2比值低于对照组（P<0.05），且SRNS组低于SSNS组（P<0.05）。镜下血尿、尿蛋白、Th17/Treg是SRNS的危险因素（P<0.05），Th1/Th2是保护因素（P<0.05）。联合Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS的曲线下面积为0.831，高于单独Th1/Th2、Th17/Treg（P<0.05）。 结论 SRNS患儿外周血Th1/Th2降低，Th17/Treg增高与SRNS发生有关，是诊断SRNS的潜在生物学标志物。

Abstract

Objective To investigate Helper T cells （Th） 1/Th2， Th17/ regulatory T cells （Treg）. Association between Treg imbalance and steroid resistant nephrotic syndrome （SRNS） in children. Methods A total of 142 children with primary nephrotic syndrome were recruited and were given glucocorticoid therapy for 4 weeks. The children were classified into steroid‑sensitive nephrotic syndrome（SSNS） according to treatment response. SSNS 31 cases （SSNS group） and SRNS 111 cases （SRNS group）. Another 53 healthy children were selected as control group. Th1/Th2 and Th17/Treg in peripheral blood were detected. The correlation factors affecting SRNS and the value of Th1/Th2 and Th17/Treg in diagnosing SRNS were analyzed. Results The levels of Th2， Th17 and Th17/Treg in peripheral blood of SRNS and SSNS groups were higher than those of control group （P<0.05）， SRNS group was higher than that of SSNS group （P<0.05）， and Th1， Treg and Th1/Th2 ratios of SRNS and SSNS groups were lower than those of control group （P<0.05）. The SRNS group was lower than the SSNS group （P<0.05）. Microscopic hematuria， urinary protein and Th17/Treg were risk factors for SRNS （P<0.05）， and Th1/Th2 were protective factors （P< 0.05）. Combined Th1/Th2 and Th17/Treg diagnosed that the area under the curve of SRNS was 0.831， which was higher than that of Th1/Th2 and Th17/Treg alone （P<0.05）. Conclusion The decrease of Th1/Th2 and the increase of Th17/Treg in peripheral blood of children with SRNS are related to the occurrence of SRNS， and are potential biomarkers for the diagnose of SRNS.

Graphical abstract

关键词

原发性肾病综合征 / 激素耐药型肾病综合征 / 免疫 / 辅助性T细胞 / 调节性T细胞 / 儿童

Key words

Primary nephrotic syndrome / Steroid‑resistant nephrotic syndrome / Immune / T helper cells / Regulatory T cells / Children

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是儿童常见的肾小球疾病之一，患病率达16.9/10万，糖皮质激素是PNS的首选治疗方法，其中50%~70%的患儿接受治疗后可达完全或部分缓解，而少部分患儿不能缓解，被称为激素耐药型肾病综合征（steroid‑resistant nephrotic syndrome，SRNS）。SRNS患儿可能会在未来5~10年进展为终末期肾病^［1，2］。SRNS确诊后需要肾活检和基因检测，并进行针对性的治疗，如果能在疾病早期诊断SRNS可避免不必要的治疗，降低糖皮质激素暴露产生的不良反应，延缓SRNS向终末期肾病进展^［3］。免疫失调是PNS发病的主要病理基础之一，T细胞功能异常和细胞因子失调介导的局部和全身炎症反应在肾微小病变病和局灶节段性肾小球硬化中发挥关键作用^［4，5］，辅助性T细胞（helper T cells，Th）1/Th2、Th17/调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）可能调节对糖皮质激素或其他免疫抑制剂的反应^［6］。既往研究显示SRNS患儿CD4⁺T细胞增殖反应增加，Th2细胞活性增强^［7］，与激素敏感型肾病综合征（steroid‑sensitive nephrotic syndrome，SSNS）比较，SRNS患者Treg百分比显著降低^［8］。但是Th1/Th2、Th17/Treg平衡状态与SRNS的具体关系尚不明确，鉴于此本研究检测Th1/Th2、Th17/Treg及其细胞因子水平，分析其与SRNS的关系，以期为临床SRNS诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2021年6月~2023年6月海南医学院第二附属医院收治的PNS患儿142例为研究对象。纳入标准：（1）初次诊断为PNS，符合诊断标准^［9］；（2）年龄<12岁，过去3个月内未接受糖皮质激素治疗；（3）肝功能正常，无药物过敏史；（4）临床资料完整。排除标准：（1）继发性肾小球肾炎或遗传性肾炎；（2）合并癫痫，正在服用抗癫痫药物者；（3）严重感染、血液系统疾病；（4）合并系统性红斑狼疮、儿童类风湿、川崎病等自身免疫疾病。SSNS诊断标准：初始泼尼松60 mg/（m²·d）或2 mg/（kg·d）（最大量60 mg/d）口服4周后达到完全缓解，且连续3次或2次以上尿蛋白/肌酐比≤0.2 mg/mg或尿试纸蛋白阴^［10］。SRNS诊断标准：初始泼尼松口服4周后未达缓解^［10］。另选择53例健康儿童作为对照组，需排除原发或继发性肾病、先天遗传疾病、自身免疫性疾病、急慢性感染以及炎症性疾病等。

本研究已经获得海南医科大学第二附属医院伦理委员会批准（LW210115）。

1.2 外周血Th1/Th2、Th17/Treg检测

PNS患儿治疗前（对照组体检当日）采集外周静脉血2 mL，Ficoll梯度离心法（Ficoll Paque购自上海浩然生物技术有限公司，加入Ficoll 后于18 ℃下4 500 r/min 离心10 min）分离外周血单个核细胞，磷酸盐缓冲液洗涤2次，将细胞悬浮在RPMI 1640 培养基（美国Sigma‑Aldrich）中，37 ℃ 孵育4 h，加入50 μL 乙二胺四乙酸涡旋，室温下孵育15 min，加入5 mL FACS Permeabilizing Solution （美国BD Biosciences），使用前用去离子水以1∶10比例稀释，涡旋并孵育10 min，-80 ℃储存。37 ℃复融血标本，离心（2 000 r/min 10 min）加入7 mL Cell Wash洗涤弃上清再次洗涤，后平均注入3个流式管中，每管100 μL。分别加入20 μL IFN‑γ PE （美国Biolegend）、5 μL IL‑10 PE‑Cy7（美国Biolegend）、20 μL IL‑13 PE和IL‑17 PE‑Cy7（美国Biolegend），4 ℃避光孵育30 min，PermWash 缓冲液重复洗涤2次，加入450 μL PBS 重悬细胞，FACSCalibur 流式细胞仪（配Cell Quest 软件）检测Th1、Th2、Th17、Treg细胞百分比，计算Th1/Th2和Th17/Treg比值。

1.3 Th1、Th2、Th17、Treg细胞因子检测

PNS患儿治疗前（对照组体检当日）采集外周静脉血3 mL注入干燥试管，待血液凝固后取上层液离心（常州金坛良友仪器有限公司生产的TGL20M台式高速冷冻离心机，相对离心力800 r/min，离心时间5 min）分离血清，-80 ℃保存备检。取血清样本，采用Varioskan LUX全自动酶标仪（美国赛默飞公司）运用酶联免疫吸附试验检测血清干扰素‑γ（interferon‑γ，IFN‑γ）、白细胞介素（interleukin，IL）‑4、IL‑17、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）‑β水平，试剂盒购自武汉赛培生物科技公司。

1.4 其他生化指标检测

取血清样本，检测血清三酰甘油、总胆固醇、血尿素氮、血肌酐、β2‑微球蛋白、白蛋白、C反应蛋白水平，白细胞计数、中性粒细胞占比、淋巴细胞占比，尿白蛋白水平。

1.5 临床资料收集

收集患儿入组年龄、性别、体重、身高、收缩压、舒张压、PNS病程、家族遗传史、镜下血尿、双肾增大或弥漫性病变以及实验室检查结果。镜下血尿患儿均行肾脏病理检查，并排除IgA肾病和Alport综合征。

1.6 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件分析数据。计量资料经Kolmogorov‑Smirnov检验符合正态分布，经Bartlett检验具备方差齐性，以\overline{x}\pm s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD‑t检验。计数资料以%表示，组间比较采用χ² 检验。多因素Logistic回归分析SRNS发生的影响因素。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS的价值。使用PASS 11.0软件进行样本量估算。使用MedCalc v19.2.6软件Z检验对诊断指标的曲线下面积 （area under the curve，AUC）进行比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组基线资料比较

SSNS、SRNS组血清三酰甘油、尿素氮、血肌酐、β2‑微球蛋白、尿蛋白、白细胞计数、中性粒细胞占比、C反应蛋白水平高于对照组（P<0.05），且SRNS组高于SSNS组（P<0.05）。SSNS、SRNS组血白蛋白、淋巴细胞占比低于对照组，且SRNS组低于SSNS组（P<0.05）。SRNS组体重高于SSNS组（P<0.05），PNS病程长于SSNS组（P<0.05），镜下血尿、双肾增大或弥漫性病变比例高于SSNS组（P<0.05），3组患儿性别、身高、收缩压、舒张压、TC等其他资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 3组外周血Th1/Th2、Th17/Treg以及血清细胞因子水平比较

SRNS组、SSNS组外周血Th2、Th17、Th17/Treg比值，血清IL‑4、IL‑17水平高于对照组（P<0.05），且SRNS组高于SSNS组（P<0.05），SRNS组、SSNS组Th1、Treg、Th1/Th2比值，血清IFN‑γ、TGF‑β水平低于对照组（P<0.05），且SRNS组低于SSNS组（P<0.05），见表2。

2.3 影响SRNS的因素分析

以SRNS为因变量（赋值：0=否，1=是），Th1/Th2、Th17/Treg、双肾增大或弥漫性病变（赋值：0=否，1=是）、镜下血尿（赋值：0=否，1=是）、尿蛋白（赋值：0=否，1=是）、三酰甘油、尿素氮、血肌酐、β2‑微球蛋白、白细胞计数、中性粒细胞占比、C反应蛋白、白蛋白、淋巴细胞占比、体重、PNS病程（均为连续变量）为自变量，构建多因素Logistic回归方程，采用向后逐步法排除无关变量（P>0.05），校正性别、年龄、体重、病史等混杂因素影响，最终镜下血尿、尿蛋白、Th17/Treg是SRNS的危险因素（P<0.05），Th1/Th2是保护因素（P<0.05），见表3

2.5 Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS的价值分析

以142例PNS患儿为样本，Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS的曲线下面积分别为0.736、0.677，联合Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS的曲线下面积为0.831，高于单独Th1/Th2、Th17/Treg（z=2.332、3.294，P<0.05），见表4和图1。

3 讨论

糖皮质激素是PNS标准初始治疗方案，可有效阻断免疫细胞和非免疫细胞中细胞因子的产生，但是临床上PNS患儿往往表现出不同程度的糖皮质激素反应性，其中SRNS是影响PNS患儿预后的关键因素^{［11，12］}。SRNS的病因复杂，涉及药物遗传学和表观遗传学、足细胞表达基因突变、免疫、细胞因子改变等^{［13‑15］}。据报道T细胞功能障碍介导细胞因子分泌异常，可攻击足细胞，导致肾小球滤过膜损伤和PNS^［16］。已知糖皮质激素能介导T 细胞亚群及其细胞因子的改变发挥治疗作用，因此推测SRNS和SSNS患者T细胞亚群理论上应存在一定差异性，T 细胞亚群失衡及其细胞因子改变可能参与调节PNS对糖皮质激素治疗的反应。

Th2和Th17占优势使Th1/ Th2、Th17/ Treg平衡破坏，导致更强烈的自身免疫反应^{［17，18］}，参与包括哮喘、过敏性紫癜、肾病综合征等多种免疫疾病发病过程。既往研究发现Th1/Th2免疫失衡引起的以Th2为主的免疫反应与PNS发病密切相关，PNS患者Th2 细胞占比和血清IL‑4、IL‑13水平明显增高，Th2活化可导致其细胞因子合成和释放，引起肾小球毛细血管壁内带负电荷的糖蛋白丢失，增加肾小球毛细血管壁的通透性^［19］。PNS患儿Treg细胞减少，Th17/Treg比值增加，在PNS发病过程中IL‑23信号通路激活通过活化γδ T 细胞分泌IL‑21，继而促使Th17细胞活化和抑制Treg细胞，影响Th17/Treg平衡，向Th17偏移^［20］，导致Th17活化以及IL‑17表达上调，继而引起足细胞损伤，促进肾病发生和进展^［21］。但是Th1/Th2、Th17/Treg平衡状态是否影响PNS患者对激素治疗的反应性尚不清楚。

本研究发现SRNS组Th2、Th17、Th17/Treg比值，血清IL‑4、IL‑17水平高于SSNS组和对照组，Th1、Treg、Th1/Th2比值，血清IFN‑γ、TGF‑β水平低于SSNS组和对照组，表明SRNS患儿存在Th1/Th2和Th17/Treg失衡及其介导的细胞因子紊乱。Jaiswal等^［22］报道也显示SRNS患者Treg细胞百分比较SSNS和健康对照降低，Th2、Th17细胞百分比、Th17/Treg显著增高。进一步回归分析提示Th1/Th2是SRNS的保护因素，Th17/Treg是危险因素，表明Th1/Th2、Th17/Treg失衡可能是导致SRNS发生的主要原因。Th1/Th2、Th17/Treg失衡参与SRNS的机制尚不清楚，Arellano‑Rodríguez等^［23］研究认为炎症刺激可改变细胞内Wilm′s瘤基因（WT1）蛋白易位和转录功能，WT1突变可导致足细胞基因nephrin表达减少，而nephrin在维持足细胞裂隙隔膜和正常肾小球滤过功能方面具有重要作用，WT1突变可能通过抑制nephrin表达导致局灶节段性肾小球硬化和弥漫性系膜硬化，并与SRNS有关。因此推测Th1/Th2向Th2偏移、Th17/Treg向Th17偏移可能通过诱导炎症反应导致WT1突变，引起PNS患儿对糖皮质激素治疗抵抗。

ROC分析结果显示Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS的曲线下面积达0.736、0.677，说明检测外周血Th1/Th2、Th17/Treg可能有助于早期识别SRNS风险，对临床治疗具有较高的指导价值。回归分析中镜下血尿、尿蛋白与SRNS有关，尿蛋白增多是PNS的基本病理改变，与PNS疾病严重程度、病情进展以及预后均密切相关，大量尿蛋白可能通过促使足细胞骨架破坏引起足细胞凋亡^［24］。

综上，SRNS患儿外周血Th1/Th2降低，Th17/Treg增高，低Th1/Th2，高Th17/Treg与PNS患儿SRNS有关，联合Th1/Th2、Th17/Treg诊断SRNS具有较高的效能，可作为SRNS的潜在标志物。本研究创新之处在于证实了Th1/Th2、Th17/Treg与SRNS的关系，为临床SRNS诊断和治疗提供了新的参考，本研究也存在不足之处，首先，样本例数偏少，其次，缺乏多中心的研究数据，未来研究中仍需进一步扩大样本例数，开展多中心研究以证实本结论的可靠性。

作者贡献度说明：

廖赵妹：数据分析、论文撰写；梁振明、徐莉：数据收集、整理和分析；蔡思铭：文章构思、设计与修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省卫生健康行业科研项目(22A200262)