γδT细胞通过IL‑17调控TGF‑β/Smad信号通路促进CD小鼠肠纤维化

γδT cells promote intestinal fibrosis in CD mice by regulating the TGF ‑ β/Smad signaling pathway through IL‑17

摘要

目的 基于克罗恩病（Crohn's disease，CD）肠纤维化模型探讨γδT细胞通过白细胞介素‑17（IL‑17）调控转化生长因子‑β（TGF‑β）/Smad信号通路对肠纤维化的作用及机制研究。 方法 雄性BALB/c小鼠28只，随机分为对照组，模型组、抗IL‑17A抗体干预组、抗TCR γ/δ抗体干预组。采用TNBS/50%酒精灌肠构建CD肠纤维化模型，注射相应抗体。记录小鼠体重，疾病活动度指数（DAI），第7周处死小鼠后取结肠组织并测量其长度。H&E染色观察结肠组织形态结构变化；Masson染色观察结肠组织中胶原蛋白；免疫组化检测α‑平滑肌肌动蛋白（α‑SMA）的表达；ELISA检测IL‑17、TGF‑β、干扰素‑γ（IFN‑γ）和IL‑10的表达水平；Western blot检测α‑SMA、结缔组织生长因子（CTGF）、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Collagen Ⅲ及TGF‑β/Smad信号通路相关蛋白。 结果 与对照组相比，模型组DAI评分升高，结肠长度缩短；病理显示结肠组织损伤严重，Masson染色可见大量蓝染的胶原纤维；IFN‑γ、IL‑10表达下降，IL‑17、TGF‑β、α‑SMA、CTGF、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF‑β1、Smad2/3、p‑Smad2/3表达明显升高（P<0.05）。与模型组相比，给予抗IL‑17A抗体或抗TCR γ/δ抗体处理后，明显抑制小鼠TNBS诱导的各项指标变化（P<0.05），减轻肠道纤维化。 结论 γδT 细胞能促进肠道纤维化，作用机制可能与激活相关IL‑17信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of γδT cells regulating the transforming growth factor‑β （TGF‑β）/Smad signaling pathway through interleukin‑17 （IL‑17） in intestinal fibrosis， based on the Crohn's disease （CD） intestinal fibrosis model. Methods A total of twenty‑eight male BALB/c mice were randomly picked out. Thereafter， these mice were classified into four separate groups： the control group， the model group， the anti‑IL‑17A antibody intervention group， and the anti‑TCR γ/δ antibody intervention group. Construct a CD intestinal fibrosis model using TNBS/50% alcohol enema and inject corresponding antibodies. Record the weight and disease activity index （DAI） of mice， and after euthanizing the mice in the 7th week， take colon tissue and measure its length. H&E staining was used to observe changes in tissue morphology and structure； Masson staining was used to observe collagen in colon tissue； Immunohistochemical detection of the expression of α‑smooth muscle actin （α‑SMA）； ELISA was used to detect the expression levels of IL‑17， TGF‑β， interferon‑γ （IFN‑γ）， and IL‑10； Western blot was used to detect α‑SMA， connective tissue growth factor （CTGF）， type Ⅰ collagen （Collagen Ⅰ）， Collagen Ⅲ， and TGF‑β/Smad signaling pathway related proteins. Results Compared to the control group， the model group showed an increase in DAI score and a reduction in colon length； Pathological examination showed severe damage to the colon tissue， and Masson staining revealed a large number of blue stained collagen fibers； The expression of IFN‑γ and IL‑10 decreased， while the expression of IL‑17， TGF‑β， α‑SMA， CTGF， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， TGF‑β1， Smad2/3， and p‑Smad2/3 showed a significant increase （P<0.05）. However， in comparison to the model group， treatment with anti‑IL‑17A antibody or anti TCR γ/δ antibody significantly inhibited the changes in various indicators induced by TNBS in mice （P<0.05） and alleviated intestinal fibrosis. Conclusion Gamma delta T cells can promote intestinal fibrosis， and the mechanism of action may be related to the activation of the IL‑17 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

克罗恩病（CD） / 肠道 / 纤维化 / γδT细胞 / IL‑17

Key words

Crohn's disease（CD） / Intestine / Fibrosis / γδT T cells / IL‑17

克罗恩病（Crohn's disease，CD）是一种非特异性肠道炎症性疾病，可累及整个胃肠道，主要见于回盲部和结肠^［1，2］。研究显示，CD在初始诊断时，至少10%的患者表现为纤维狭窄表型^［3］。50%的CD患者最终会发展为狭窄或穿透性并发症，超过80%的CD患者一生中至少需要接受1次手术，且手术后易发生狭窄^［4，5］。因此有效的预防与治疗对CD纤维化患者的预后至关重要。

纤维化作为CD的常见并发症，其发生机制复杂，涉及多种信号通路的调控。其中，转化生长因子‑β（transforming growth factor‑β，TGF‑β）/Smad信号通路在纤维化过程中起关键作用。TGF‑β通过激活Smad蛋白，促进细胞外基质（ECM）的沉积，导致纤维化^［6］。在CD小鼠模型中，TGF‑β/Smad信号通路的异常激活与肠纤维化的进展密切相关^［7，8］。因此，深入研究该通路在CD肠纤维化中的作用，不仅有助于揭示其分子机制，还可能为治疗提供新的靶点。

γδT细胞作为一种非常规T细胞，可以产生白细胞介素‑17（interleukin‑17，IL‑17）、TGF‑β、干扰素‑γ（interferon‑γ，IFN‑γ）、白细胞介素‑10（interleukin‑10，IL‑10）等细胞因子，主要在皮肤、呼吸道、消化道和生殖道等黏膜和上皮部位富集^［9，10］。目前研究表明，γδT细胞通过其分泌的细胞因子或其自身的细胞毒性作用对多种器官的纤维化产生促进或抑制的作用^［11-13］。但γδT细胞在肠纤维化中的作用少有报道。本研究致力于深入探讨在CD中，γδT细胞在肠纤维化进程中所发挥的作用及其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

28只4周龄雄性BALB/c小鼠（15~20 g）购自武汉贝赛模式生物科技有限公司，动物许可证号SCXK（鄂）2022‑0029，质量合格证号：422023500000704。小鼠饲养于温度24~26 ℃、湿度40%~60%的环境，自由饮水摄食，光照昼夜交替。本实验经武汉贝赛模式生物中心实验动物福利与伦理管理委员会审批，编号：BSMS20240813C。

1.1.2 主要实验试剂和仪器

2，4，6‑三硝基苯磺酸（sigma公司）；抗IL‑17A抗体（biolegend公司）；Purified anti‑mouse TCR γ/δ antibody（biolegend公司）；兔单抗α‑平滑肌肌动蛋白（α‑smooth muscle actin，α‑SMA，Abcam公司）；兔多抗结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF， Abclonal公司）；小鼠单抗Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ，武汉三鹰生物技术有限公司）；兔多抗collagen Ⅲ（武汉三鹰生物技术有限公司）；兔多抗转化生长因子TGFb1（武汉三鹰生物技术有限公司）；Masson染色试剂盒（珠海贝索生物技术有限公司）；HRP标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。

台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；Multiskan FC型酶标仪（Thermo Scientific公司）；多样品组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；电泳仪电源（北京龙方科技有限公司）；eBlot™ L1 快速湿转仪（金斯瑞生物科技股份有限公司）；化学发光成像系统（杭州申花科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、建模及判断标准

选取28只4周龄的BALB/C雄性小鼠，经过为期1周的适应性喂养后，从中随机抽取7只小鼠设定为对照组（Control，Con），每周给予生理盐水（100 μL/mouse）灌肠；7只小鼠作为模型组（Model， Mod），建立CD纤维化模型；7只小鼠作为抗IL‑17A抗体干预组（anti IL‑17A antibody， Anti IL‑17A），在模型组基础上，于第22、29、36天于灌肠前2 h给予小鼠尾静脉注射抗IL‑17A抗体（2 μg/只）；7只小鼠作为抗TCR γ/δ抗体干预组（anti TCR γ/δ antibody， Anti TCR γ/δ），在模型组基础上第22、29、36天于灌肠前2 h给予小鼠尾静脉注射抗TCR‑δ单克隆抗体（50 μg/只）。参照Wirtz等^［14］研究建立CD小鼠纤维化模型。每次灌肠前，小鼠均禁食、不禁水24 h，吸入易氟烷麻醉，3.5F导管从肛门插入肠道深约4 cm，每只小鼠灌注TNBS/50%酒精灌肠剂100 μL，之后将小鼠倒置60 s，灌肠后常规饲养。TNBS的质量分别为第1、2周1.5 mg，第3、4周2.0 mg，第5、6周2.5 mg。每周1次，连续6周。于第7周以颈椎脱臼法处死小鼠，取结肠组织，去除内容物后测量长度，取约1 cm置于4%多聚甲醛溶液中，剩余放入-80 ℃冰箱保存。

CD小鼠纤维化模型的判断标准：（1）临床表现的观察：记录小鼠体重变化和粪便性状，疾病活动度指数（disease activity index， DAI）评分，评估纤维化的进展。（2）组织病理学评估：H&E染色观察肠道组织的形态结构变化情况；Masson染色检测胶原纤维的沉积情况，判断纤维化程度。（3）生化指标检测：通过Western blot检测α‑SMA、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达水平，进一步验证纤维化模型。

1.2.2 疾病活动度评分

记录每周小鼠体重变化、粪便性状、便血情况进行用于各组小鼠DAI评分，见表1^［15］。

1.2.3 H&E染色观察结肠组织形态结构变化

将固定液中的结肠组织进行洗涤脱水后，进行石蜡包埋并制作成切片。采用H&E染色方法处理切片，然后在光学显微镜下细致观察组织的形态结构变化，并拍照记录特征。

1.2.4 Masson染色观察胶原蛋白

结肠组织切片采用Masson三色染色，光学显微镜下观察小鼠结肠组织胶原蛋白表达情况并拍照记录。

1.2.5 免疫组化检测小鼠结肠组织α‑SMA的表达

将约4 μm厚结肠组织切片经烤片、脱蜡、抗原修复、灭活、血清封闭、孵育一抗（1∶400）、二抗后显色、脱水封片后显微镜下观察结肠组织α‑SMA的表达情况并拍照记录。

1.2.6 ELISA检测小鼠结肠组织IL‑17、TGF‑β、IFN‑γ及IL‑10表达

取冷冻保存的结肠组织，以预冷的PBS冲洗，去除残留血液，称重后将组织剪碎研磨，3 000 r/min离心5 min后取上清液。按照说明书稀释标准品和样品，加入抗体、显色液后，测量光密度，绘制标准曲线，检测IL‑17、TGF‑β、IFN‑γ、IL‑10的含量。

1.2.7 Western blot检测结肠组织α‑SMA、CTGF、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF‑β1、Smad2/3、p‑Smad2/3的表达

取干净绿豆大小的结肠组织于2 mL EP管中，加入配好的PIPA裂解液（含2 μL蛋白酶抑制剂和2 μL磷酸酶抑制剂），加入钢珠研磨，在4 ℃下12 000 r/min离心5min，取上清分装于0.5 mL离心管中。使用BCA试剂盒和酶标仪测定样本蛋白浓度，将提取的蛋白上清与5×蛋白上样缓冲液混合，进行沸水浴10 min。将制备好的蛋白样品和MAKER加入上样孔，电泳后进行电转移。用封闭液封闭2 h后，一抗稀释后孵育过夜，稀释比见表2，二抗孵育1 h。使用ECL试剂对PVDF膜进行显色曝光，用凝胶成像分析系统观察结果。

1.3 统计学处理

使用SPSS 27.0软件进行数据分析，结果以\overline{x}\pm s表示。当资料呈现正态分布且满足方差齐性时，2组间比较运用独立样本t检验；对于多组间的比较，则采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 体重变化、DAI评分

与对照组相比，模型组、抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组小鼠体重下降，疾病活动指数明显升高（P<0.05）；与模型组相比，在给药后第4周起抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组小鼠体重明显升高，DAI评分明显降低（P<0.05）。见图1。

2.2 结肠组织大体形态

对照组小鼠结肠长度处于正常范围，肠腔大小适宜，无狭窄或扩张情况，肠壁光滑平整，分界清楚；模型组小鼠结肠长度较正常小鼠明显缩短，触摸时可感受到明显的硬度增加，肠壁质地变硬变脆，肠壁增厚明显，肠腔变狭窄；抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组小鼠结肠组织有了明显的改善，长度未出现明显的缩短，肠壁质地软，肠腔未见狭窄，与周围组织的分界也较为清晰。见图2。

2.3 H&E染色观察结肠组织形态结构变化

对照组结肠组织黏膜未受损，腺体排列整齐，无炎性细胞浸润。在模型组中，结肠组织展现出典型的病理改变：上皮细胞发生剥脱，腺体失去正常的规则排列，排列紊乱；隐窝基部结构不完整、部分组织缺失；黏膜下层被大量淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞广泛浸润；在抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组中，黏膜上皮细胞仅有少量脱落现象，腺体排列呈现规则状态，黏膜下层可见少量炎性细胞浸润。见图3。

2.4 Masson染色观察、计算结肠组织中胶原蛋白的分布及含量

对照组镜下可见少量的蓝色胶原纤维；模型组可见大量蓝色胶原纤维沉积，与对照组相比，胶原蛋白占比明显增加（P<0.05）；抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组可见少量蓝色胶原纤维沉积，与模型组相比，两抗体干预组胶原蛋白所占面积减少（P<0.05）。见图4、表3。

2.5 免疫组化检测小鼠结肠组织α‑SMA的表达

在对照组的镜下观察中，仅可见少量棕黄色或棕褐色颗粒，阳性细胞的占比处于较低水平。而模型组的镜下表现则大不相同，大量棕黄色颗粒清晰可见，与对照组相比阳性细胞占比明显升高，α‑SMA表达明显升高（P<0.05）。抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组，镜下观察可发现少量棕黄色或棕褐色颗粒，与模型组相比，细胞染色相对较浅，阳性细胞占比有所下降，α‑SMA表达明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5、表4。

2.6 ELISA检测IL‑17、TGF‑β、IFN‑γ及IL‑10的表达

与对照组相比，模型组的IL‑17、TGF‑β水平大幅升高，IFN‑γ及IL‑10水平明显下降（P<0.05）。同时，与模型组相比，抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组的IL‑17、TGF‑β水平明显降低，IFN‑γ及IL‑10水平明显升高（P<0.05），差异具有统计学意义。见表5。

2.7 Western blot检测结肠组织α‑SMA、CTGF、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF‑β1、Smad2/3、p‑Smad2/3的表达

与对照组相比，模型组α‑SMA、CTGF、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表达明显上升（P<0.05）；与模型组相比，抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组α‑SMA、CTGF、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表达下降（P<0.05）。见图6A、表6。

与对照组相比，模型组TGF‑β1、Smad2/3、p‑Smad2/3蛋白表达明显上升（P<0.05）；与模型组相比，抗IL‑17A抗体干预组和抗TCRγ/δ抗体干预组TGF‑β1、Smad2/3、p‑Smad2/3蛋白表达下降（P<0.05）。见图6B、表7。

3 讨 论

肠纤维化是CD的常见并发症，可导致肠道狭窄甚至梗阻。研究显示，约50%的患者在诊断CD后5年内出现，70%的患者在10年内出现，严重影响患者生活质量^［16］。尽管随着新型治疗药物的出现，CD的治疗管理有所改善，但目前缺乏治疗CD相关肠纤维化的有效方法。为了探究新的有效治疗措施，建立CD动物模型具有重要意义，故本研究采用TNBS/50%酒精化学诱导CD模型。结果显示模型组小鼠体重较对照组下降，严重时可出现软便或水样便，小鼠DAI评分增加；大体可见结肠长度较对照组变短，肠壁变硬、肠腔变窄；H&E染色镜下见上皮细胞脱落、腺体破坏、大量炎性细胞浸润；Masson染色可见大量胶原纤维沉积；Western blot提示肌成纤维细胞的标志物α‑SMA、ECM的主要成分CollagenⅠ、Collagen Ⅲ等蛋白表达增加。这些变化提示CD小鼠模型构建成功，可进行下一步研究。

IL‑17作为一种炎性细胞因子，主要来源于活化的Th17细胞，也可来源于CD8⁺ T细胞、γδT细胞和自然杀伤细胞^［17］，其受体通常表达于基质细胞、内皮细胞和成纤维细胞表面^［18］。目前研究表明，IL‑17可促进肝纤维化，通过激活STAT3信号通路诱导肝星状细胞中CollagenⅠ的产生，从而导致纤维化^［19］。Qu等^［20］使用IL‑17A抗体后可减轻博来霉素诱导的肺纤维化。此外，使用抗IL‑17抗体后也可以缓解肠纤维化，可能是通过下调促纤维化细胞因子的表达和扰乱基质金属蛋白酶/金属蛋白酶组织抑制剂的平衡来实现^［21］。在本研究中，通过尾静脉注射抗IL‑17A抗体后，小鼠DAI评分下降、体重增加、结肠大体较模型组长度增加，肠腔无狭窄；H&E染色结果显示结肠组织形态结构完整；保护因子IFN‑γ及IL‑10表达明显升高；炎性相关因子IL‑17、TGF‑β及评估纤维化进展及程度的相关蛋白α‑SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ等表达明显下降。这些结果提示拮抗IL‑17可减轻CD小鼠的肠道纤维化。

γδT细胞是一种特殊的T细胞，仅占外周血中T细胞的5%~15%^{［22，23］}。活化的效应γδT细胞具有细胞毒性，可表达Fas配体（FasL）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），通过细胞间直接接触、Fas‑FasL和TRAILR‑TRAIL死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡。也可以分泌穿孔素、颗粒酶、IFN‑γ、TNF‑α等促炎细胞因子溶解肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞^［24］。此外，研究表明，γδT细胞衍生的IL‑17A可通过IL‑1β依赖性机制介导高血压导致心脏纤维化^［12］。Segawa等^［13］报道称，产生IFN‑γ的γδT细胞通过抑制肺IL‑17A（+）CD4（+）T细胞来减弱肺纤维化。在本研究中，CD小鼠尾静脉注射抗TCR γ/δ抗体后，与模型组相比，小鼠DAI评分下降、体重增加、结肠长度增加；镜下结肠组织形态结构完整；IFN‑γ及IL‑10等因子表达水平升高；炎性因子IL‑17、TGF‑β及纤维化相关蛋白α‑SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ等表达也明显下降。下调了γδT细胞的表达，明显缓解了CD小鼠的肠纤维化，提示γδT细胞的表达可能促进了小鼠肠纤维化。此外，下调了γδT细胞后IL‑17的表达量也下降，与注射抗IL‑17抗体后的CD小鼠结果一致，提示γδT细胞可能提高分泌的IL‑17介导肠纤维化。

TGF‑β/Smad信号通路、Wnt/β‑catenin信号通路、上皮‑间质转化、内皮‑间质转化等参与肠纤维化的发生^［25］。其中，TGF‑β/Smad通路被认为是参与纤维化的核心通路。TGF‑β1直接激活Smad信号转导，触发促纤维化基因过表达，导致CollagenⅠ、纤连蛋白、α‑SMA等的上调导致纤维化^［26］。此外，CTGF作为TGF‑β/Smad通路的下游分子，参与组织纤维化形成，常作为纤维化的重要检测指标之一^［27］。Weng等^［28］研究表明，IL‑17可通过调节TGF‑β/Smad蛋白通路激活细胞外信号调节激酶信号通路导致纤连蛋白合成增多，介导肾间质纤维化。Yun等^［29］在探讨黄腐酚减轻肠道纤维化作用的机制时，发现黄腐酚可通过影响TGF‑β/Smad信号传导抑制肠道纤维化。在本实验中，通过Western blot检测可观察到模型组小鼠TGF‑β1、Smad2/3、p‑Smad2/3等蛋白表达明显升高，下游的CTGF蛋白表达也升高，提示TGF‑β/Smad信号通路被异常激活，进一步促进纤维化的进展。但下调γδT细胞和IL‑17后，TGF‑β/Smad信号通路相关蛋白表达也下调，明显缓解小鼠肠纤维化。提示γδT细胞可以通过IL‑17介导的TGF‑β/Smad信号通路干预肠道纤维化。

然而，本研究具有一定的局限性：不能明确IL‑17仅来源于γδT细胞，无法排除其它来源的IL‑17对实验的干预；未能完全敲除γδT细胞，不能完整揭示γδT细胞与肠纤维化之间的关系。将在今后的研究中进一步完善上述问题。综上所述，本研究表明γδT细胞对CD肠纤维化具有明显的促进作用，其机制可能与IL‑17调控TGF‑β/Smad信号通路有关，可为肠纤维化的治疗提供一种新的理论支持。

作者贡献度说明：

李永荣：实验设计与实施，论文撰写；陈名利、曾祖妮：数据收集与分析；陈超超、何周桃：文献查阅与整理；蓝程：提供研究思路、指导论文编辑与校对。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(81860102)

国家自然科学基金(82060102)

海南省自然科学基金高层次人才项目(821RC1116)