补肾复脉方治疗激素性股骨头坏死的作用机制研究

Mechanism of action of Bushen Fumai Formula in the treatment of steroid‑induced avascular necrosis of the femoral head

摘要

目的 基于成血管‑成骨耦联机制和动物实验，探讨补肾复脉方对激素性股骨头坏死（steroid‑induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）的作用机制。 方法 采用甲泼尼龙琥珀酸钠联合脂多糖建造SANFH大鼠模型。以正常大鼠作为空白对照，将SANFH大鼠分为模型组、阳性组及中药低、中、高剂量组。对各组大鼠股骨头进行Micro‑CT扫描观察其形态；H&E染色观察组织病理变化；免疫组化染色检测组织中CD31、Osterix、Runx2的表达；ELISA法检测血清中OPG、BALP、BGP、Runx2水平；Western blot及RT‑qPCR检测组织中HIF‑1α、VEGFA、VEGFR2、BMP2的蛋白及mRNA表达。 结果 模型组股骨头表面结构被破坏。与模型组相比，中药低、中、高剂量组与阳性药组股骨头结构较完整，空骨陷窝率减少，各项指标的表达均呈剂量依赖性升高。 结论 补肾复脉方能够通过促进骨与血管的形成来改善SANFH，其机制可能与上调HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号通路中相关因子的表达，从而增强成血管‑成骨耦联作用有关。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Bushen Fumai Formula on steroid‑induced avascular necrosis of the femoral head （SANFH） based on the vascularization⁃osteogenesis coupling mechanism and animal experiments. Methods Methylprednisolone sodium succinate combined with lipopolysaccharide was used to establish SANFH rat model. The normal rats were used as the blank control， and SANFH rats were randomly divided into the model group， the positive group， and the low， medium and high dose groups of traditional Chinese medicine. Micro‑CT scans were conducted to examine the structure of the femoral heads in each rat group， while H&E staining was utilized to detect histopathological alterations； Immunohistochemical staining was performed to detect the expression of CD31， Osterix， and Runx2 in the tissues； The levels of OPG， BALP， BGP， and Runx2 in serum were measured using ELISA， while Western blot and RT‑qPCR techniques were used to identify the protein and mRNA presence of HIF‑1α， VEGFA， VEGFR2， BMP2. Results In the model group， the femoral head's surface configuration was demolished. Compare to the model group， the femoral head was more intact， the rate of empty bone traps was reduced and the expression of all indices was increased in a dose‑dependent manner in the low， medium and high dose categories of traditional Chinese medicine and the positive medicine group. Conclusion Bushen Fumai Formula can improve the SANFH by promoting the formation of bone and blood vessels， and its mechanism may be related to the up‑regulation of HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2 signaling pathway， thereby enhancing the bone‑blood coupling mechanism.

Graphical abstract

关键词

激素性股骨头坏死 / 补肾复脉方 / 成骨 / 成血管

Key words

Steroid‑induced avascular necrosis of the femoral head / Bushen Fumai formula / Osteogenesis / Vascularization

激素性股骨头坏死（steroid‑induced avascular necrosis of the femoral head， SANFH）是由于长期或过量使用糖皮质激素而导致股骨头血液循环受阻、骨代谢失衡、脂质代谢紊乱，进一步触发股骨头内部微血管障碍、骨细胞坏死和缺血，最终导致股骨头损伤、坏死和塌陷的一种常见疾病^［1‑3］。然而，由于SANFH的发病机制尚未明确，缺少针对性的药物治疗手段，临床上只能采用人工髋关节置换术治疗中晚期患者，严重影响了患者的生活质量^［4］。

中药在治疗SANFH方面具有多靶点、多途径、副作用小等优势，能够明显改善患者症状，有助于股骨头坏死的修复^［5‑8］。王世轩教授是辽宁中医药大学附属第二医院骨伤科主任，全国第六批名老中医药专家，对中医药治疗SANFH有着丰富的临床经验和独到的学术见解。王教授基于元气与络病理论，认为肾元虚衰、络脉瘀滞乃本病病机，在复元补肾壮骨，活血通络止痛的治疗原则上，自创补肾复脉方，已获国家专利。全方遵“大凡络虚，通补最宜”，共奏复元补肾壮骨，活血通络止痛之功效，临床随证加减治疗中早期SANFH，有效改善患者髋关节功能及临床症状，并可延缓或逆转股骨头坏死影像学改变。

SANFH的早期发病机制可能是股骨头缺血、缺氧引起骨代谢失衡，因此改善缺血、缺氧，促进血管与骨形成具有重要治疗意义^［9］。本研究以缺氧诱导因子‑1α（HIF‑1α）/血管内皮生长因子（VEGFA）/血管内皮生长因子受体‑2（VEGFR2）信号通路激活后增强成血管‑成骨耦联作用为理论依据^{［10，11］}，基于动物实验探讨补肾复脉方改善SANFH的作用机制，为其进一步的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

11~12周龄雄性SD大鼠体质量（290±20） g，SPF级，购于辽宁长生生物技术有限公司［许可证号：SCXK（辽）2020‑0001］。所有实验操作和步骤按照《中华人民共和国实验动物管理条例》执行，并已经通过了辽宁中医药大学实验动物伦理委员会审核（审批号：21000042023192）。

1.2 实验药物

补肾复脉方：骨碎补、续断、淫羊藿、葛根、黄芪、丹参、莪术、板蓝根、紫石英（辽宁中医药大学附属医院）于过量的水中浸泡30~50 min，将水加热至105~110 ℃，煎煮25~30 min，即得汤剂，密闭分装，4 ℃冷藏保存。通络生骨胶囊（国药准字Z2004 0001，规格：0.5 g/粒，浙江赞生药业有限公司）。

1.3 主要试剂

注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（23110806，国药集团容生制药有限公司）；脂多糖（S11060，上海源叶生物科技有限公司）；注射用青霉素钠（0172303316，石药集团中诺药业有限公司）；4%多聚甲醛（BL539A，上海桥星贸易有限公司）；一抗（CD31）（GB113151）、一抗（Osterix）（GB111900）、一抗（Runx2）（GB115631）、兔抗‑HIF‑1α抗体（GB111339）、HRP‑山羊抗兔抗体（GB23303）、兔抗‑BMP2抗体（GB11252）、兔抗‑VEGFA抗体（GB111971）、兔抗‑VEGFR2抗体（GB11190）均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；骨特异性碱性磷酸酶（BALP）ELISA试剂盒（E‑EL‑R0113）、骨钙素（BGP）BGP ELISA试剂盒（E‑EL‑R0243）、破骨细胞抑制因子（OPG）ELISA试剂盒（E‑EL‑R3005）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；RUNX2 ELISA试剂盒（ELK8429，武汉科鹿生物科技有限责任公司）。

1.4 主要仪器

倒置荧光显微镜（E100，尼康仪器有限公司）；Quantum GX Micro‑CT（PerkinElmer）；低温高速离心机（MR1822，Jouan SA）；荧光定量PCR仪（CFX Connect，Bio‑rad）；病理切片机（RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；酶标仪（Epoch，BioTeK）；包埋机（JB‑P5，武汉俊杰电子有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 SANFH 大鼠模型的建立

在正常喂养69只大鼠1周之后，使用随机数字表的方法将它们分为空白对照组（12只）和造模组（57只）。于造模组大鼠的腹腔内，以1次/d的频率进行脂多糖（20 μg/kg）的注射，连续进行2次，每次的注射间隔为24 h，并在注射过程中观察大鼠的即时反应。最后一次注射24 h后，于大鼠右侧臀肌处注射甲泼尼龙琥珀酸钠（40 mg/kg），1次/d，连续进行3次，每次的注射间隔为24 h。为预防感染，在大鼠另一侧臀肌相同部位予以注射用青霉素钠（4万U/只）。空白对照组予以腹腔及臀肌等量生理盐水，以产生相同刺激。末次注射后6周，从空白组随机抽取1只大鼠，造模组随机抽取2只大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉（1 mL/kg），大鼠安乐死后取出双侧股骨头，进行Micro‑CT扫描，并制作病理切片检测病理形态学，验证造模是否成功。

1.5.2 分组及给药

使用随机数字表法将造模成功的SANFH大鼠分为5组：模型组、补肾复脉方低剂量组（中药低剂量组）、补肾复脉方中剂量组（中药中剂量组）、补肾复脉方高剂量组（中药高剂量组）、通络生骨胶囊组（阳性组），每组11只。阳性药组给予0.54 g/kg剂量的通络生骨胶囊混悬液灌胃，中药的低、中、高剂量组分别给予6.3、12.6和25.2 g/kg剂量的中药混悬液灌胃。空白组和模型组大鼠分别给予生理盐水灌胃，每天给药1次，持续12周。每周称重，按体重变化调整灌胃药量。

1.5.3 取材

治疗结束，大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，置于超净工作台上进行腹主动脉取血，取血清用于ELISA检测，-60 ℃备用。完整取出双侧股骨，将右侧股骨头浸泡于4%多聚甲醛中48 h，用于Micro‑CT扫描与组织切片的染色。左侧股骨头用于RT‑qPCR及Western blot检测，-80 ℃冻存备用。

1.5.4 Micro‑CT扫描

分离大鼠右侧股骨周围的肌肉、组织及韧带，运用小型动物Micro‑CT扫描系统观察股骨头形态、骨小梁结构和软骨下囊性变情况。

1.5.5 H&E染色

每组取3只大鼠的股骨头组织（约1 cm³大小），依次进行脱钙、脱水、组织包埋、切片、H&E染色和中性树胶封片步骤，最后通过显微镜观察骨组织的形态变化。

1.5.6 免疫组织化学染色

每组选取3只大鼠的骨组织切片，并按照以下步骤处理：脱蜡、抗原修复、消除内源性过氧化物酶、封闭、一抗及二抗孵育、DAB显色、复染细胞核、脱水封片。取3个不同视野截图，Imagepro Plus软件分析各组大鼠股骨头组织中H型血管标记物（CD31）、成骨相关转录因子Osterix与Runx2的表达情况。

1.5.7 酶联免疫吸附检测（ELISA）

根据ELISA试剂盒说明书步骤操作，计算各组大鼠血清中OPG、BALP、BGP及Runx2的表达水平。

1.5.8 免疫印迹蛋白检测（Western blot）

从各组大鼠的股骨头中取得100 mg的样本，然后加入1 mL的RIPA细胞裂解液，经过离心处理后进行蛋白提取。经过变性处理的蛋白，进行灌胶、电泳和转膜，加入5%脱脂奶粉置于摇床上封闭30 min；参照说明书的比例，将一抗稀释到合适的浓度，并在4 °C下孵化过夜；进行TBST洗膜3次后，按照说明书的比例，将二抗用TBST稀释到合适的浓度，然后在室温下孵育30 min；进行化学发光、显影和定影处理，测量各组大鼠股骨头组织中的HIF‑1α、VEGFA、VEGFR2以及骨形态蛋白‑2（BMP2）的表达水平。

1.5.9 实时荧光定量（RT‑qPCR）

将各组大鼠左侧股骨头组织剪碎，按照RNA试剂盒说明书步骤，提取总RNA，测定RNA浓度。进行反转录、实时荧光定量，以GAPDH为内参，2^-ΔΔCt法计算各组大鼠股骨头组织中HIF‑1α、VEGFA、VEGFR2、BMP2的mRNA表达水平。引物序列详见表1。

1.6 统计学处理

实验数据统计分析应用SPSS 26.0软件，组间比较使用t检验，多组间比较使用单因素方差分析，计量数据以\overline{x}\pm s表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Micro‑CT扫描

Micro‑CT扫描结果如图1所示，在空白组中，股骨头的表面光滑，结构完整，骨小梁清晰且有序排列。在模型组中，股骨头出现塌陷，骨小梁变得稀疏易断裂，同时软骨下出现囊性变。在阳性组和中药的低、中、高剂量组中，股骨头的形态稍有变化，骨小梁囊性变区域减少，而且随着给药剂量的增加，骨修复的程度呈现出增加的趋势。

2.2 H&E染色

与未给药的空白组相比，模型组的骨组织中软骨细胞和成骨细胞的数量都有所下降，骨细胞开始萎缩，细胞核皱缩，骨小梁变少且稀疏，部分骨小梁有空骨陷窝；阳性组和中药的低、中、高剂量组的软骨细胞和成骨细胞数目较模型组明显增多，且骨细胞的形态保持正常，空骨陷窝相对较少（图2）。中药低、中、高剂量组空骨陷窝率分别为（33.22±1.49）%，（26.97±5.01）%与（17.70±1.39）%，呈剂量依赖性降低，且均明显低于模型组（P<0.01）。此外，经高剂量中药与阳性药治疗的大鼠骨组织的空骨陷窝率没有明显差异，说明两者药效相当（P>0.05）（图3）。

2.3 免疫组织化学染色

模型组CD31、Osterix和Runx2表达量较空白组明显减少（P<0.000 1）。阳性组CD31、Osterix和Runx2表达量较模型组明显上调（P<0.01）。大鼠经高剂量的补肾复脉方干预后，股组织中各项指标的表达较模型组明显升高（P<0.05），且与阳性组各项指标升高效果相当（P>0.05）。见图4。

2.4 ELISA检测

与空白组相比，模型组OPG、BALP、BGP与Runx2水平均明显降低（P<0.000 1）。与模型组相比，阳性组OPG、BALP、BGP与Runx2水平明显升高（P<0.000 1）。而大鼠在经过高剂量的补肾复脉方治疗后，血清中以上指标的表达水平较模型组明显上升（P<0.05）。见图5。

2.5 Western blot检测

模型组的HIF‑1α、VEGFA、VEGFR2与BMP2的蛋白表达量较空白组明显降低（P<0.01）。在中药高剂量组与阳性组中，上述4种蛋白的表达量明显高于模型组（P<0.01），且升高效果相当（P>0.05）。见图6。

2.6 RT‑qPCR检测

与空白组相比，模型组VEGFR2、BMP2、VEGFA与HIF‑1α的mRNA表达量均明显降低（P<0.05）。中药高剂量组和阳性组的上述4种mRNA的表达量较模型组明显升高（P<0.05）。见图7。

3 讨论

SANFH在中医学中归属于“骨痹”“骨蚀”“骨痿”等范畴，其病机主要是血瘀与肾虚。中医理论认为，气血对骨骼的滋养是使骨骼形态与功能维持正常的关键因素，瘀血形成会导致气血运行不畅，致使股骨头因缺乏气血滋养而坏死^［12］。中医理论认为，肾主骨生髓，肾气亏虚，骨失所养，亦可引发股骨头坏死^［13］。因此，活血化瘀与补肾壮骨成为中医治疗SANFH的基本原则，在瘀血期，着重于破除瘀血、疏通经络；在修复期，则着重于补肾与活血。遵循“复元补肾壮骨，活血通络止痛”的治疗原则，补肾复脉方选用了多种药材进行合理配伍，包括骨碎补、续断、淫羊藿、葛根、黄芪、丹参、莪术、板蓝根以及紫石英；黄芪、骨碎补、续断、淫羊藿共为君药，黄芪补气壮阳，生津养血，行滞通痹；骨碎补、续断、淫羊藿具有补肝肾，强筋骨，止疼痛的功效；莪术、丹参活血祛瘀，行气破血，消积止痛；葛根升阳通经活络，共为臣药；板蓝根与紫石英在中药中发挥佐使作用，板蓝根，清热解毒；紫石英温肾暖宫，安心定神，养血，通奇脉，镇上冲之气^［14］。

目前SANFH的发病机制尚未被完全阐明，现代医学认为缺血缺氧是SANFH的主要成因，“成血管‑成骨耦联”作用是股骨头坏死修复的关键环节^{［15，16］}。H型血管是骨骼血管的一种亚型，它释放的细胞因子能够刺激骨祖细胞的增殖与分化过程，从而进一步诱导新生血管与骨的形成^{［17，18］}。以往研究表明，成骨发育及维持骨微环境平衡的过程、微血管内皮细胞产生血管因子调节血管新生的过程，可通过H型血管在时间与空间上紧密联系，这种相互耦联作用称为“成血管‑成骨耦联”作用^{［19，20］}。已知HIF‑1α信号通路在缺氧条件下对骨组织修复有重要作用，并可促进H型血管形成，促进成骨活动^{［21‑23］}。VEGF作为HIF‑1α的下游基因，可被HIF‑1α调节，从而促进H型血管生长与骨形成^{［24，25］}。此外，VEGFA‑VEGFR2 的激活可进一步促进血管内皮细胞的有丝分裂和通透性，促进血管的修复过程^{［26，27］}。因此，SANFH可能是由于HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号通路被抑制，导致成血管‑成骨耦联作用下降而产生，故改善早期SANFH内骨缺血、缺氧环境，促进血管和骨质的修复成为扭转病程的关键。

本研究选用HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号通路中相关因子，包括成血管相关因子HIF‑1α、VEGFA、VEGFR2、H型血管标志物CD31，成骨相关因子BMP2、Osterix、Runx2、OPG、BALP、BGP作为观察对象，旨在观察用药前后各指标水平的变化，以进一步探究补肾复脉方修复SANFH的作用机制。CD31标记的H型血管主要分布于骨骺端和骨内膜处，被Osterix和Runx2骨祖细胞紧密包围^{［17，28］}。Osterix被认为是至今为止唯一一个针对成骨细胞的特异性转录因子，它在干细胞分化为成骨细胞的过程中发挥了关键作用^［29］。Runx2作为成骨细胞转录激活因子，对成骨分化中基因表达调控具有重要作用^［30］。BMP2的过度表达有助于促进与成骨有关的细胞的生存与再生，从而进一步加速骨骼的形成过程^{［31‑33］}。此外，BALP、BGP与OPG也是骨形成的重要标志物^{［34‑36］}。

在本次研究中，由Micro‑CT及H&E染色结果可知，模型组骨小梁数目减少、变细及软骨下骨囊性变，表明血管生成减少后，股骨头内骨修复或骨形成减少；而补肾复脉方组和通络生骨胶囊组骨小梁增粗、数量增多，可以确定股骨头内骨坏死已被修复。由免疫组化染色结果可知，相较于模型组，各治疗组CD31、Osterix、Runx2阳性面积增加，在调节股骨头内H型血管形成和骨形成方面效果明显。ELISA检测结果发现，经补肾复脉方治疗后，大鼠血清中OPG、BALP、BGP、Runx2明显升高，成骨细胞生命力强，以骨形成为主，股骨区皮质骨的更新、转化迅速，股骨头坏死得到了有效改善。由RT‑qPCR及Western blot检测结果可知，造模后大鼠股骨头内HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号轴相关指标表达降低；而补肾复脉方各组及通络生骨胶囊组中HIF‑1α、VEGFA、VEGFR2、BMP2的mRNA、蛋白表达升高，表明两种药物均可能通过调节HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号轴相关指标，增强了成骨‑成血管耦联作用，从而发挥其治疗作用。

以上结果表明，补肾复脉方可通过促进骨与血管形成修复SANFH大鼠股骨头坏死，其机制可能是通过上调HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号通路中相关因子的表达，改善股骨头内部微循环，减轻缺血、缺氧状态，促进成血管‑成骨耦联作用，使股骨头内H型血管形成增多，同时促进新骨形成，从而发挥修复SANFH的作用。

补肾复脉方能够通过促进骨与血管的形成来改善SANFH，其机制可能与上调HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号通路中相关因子的表达，从而增强成血管‑成骨耦联作用有关。

实验虽然验证了补肾复脉方治疗早期SANFH时具有促进骨与血管形成的作用，其机制可能与上调HIF‑1α/VEGFA/VEGFR2信号通路中相关因子表达，进而加强成血管‑成骨耦联作用相关。但中药复方成分复杂，其中起治疗作用的具体分子成分尚未能明确，在未来的研究中可借助网络药理学拓宽研究方向，并结合基因敲除或信号通路抑制剂使实验进一步完善，明确补肾复脉方在信号通路中的具体调控靶点和直接分子作用机制，丰富中医治疗的科学内涵。此外，选用SD大鼠这一经典动物模型建立SANFH模型，造模成功率较高，经济性较好，在本次实验中能够模拟SANFH的发生机制，然而，由于四足动物不能完全模拟人体生物力学效应，故不能真实反映股骨头受压后的生理及病理状态，在后期研究中，可选取双足负重动物如鸵鸟，进一步模拟人体生物力学结构并阐述SANFH后期生理病理特点。最后，仍需进一步的客观指标阐明补肾复脉方的临床实际疗效，以推动研究成果真正转化到实际应用当中，更好地服务于患者。

作者贡献度说明：

邱静：实验设计及实施，指标检测，数据分析处理，论文撰写；王世轩：实验设计，文章校对；赵双利：文献检索，文章校对；刘彦彤：实验实施，指标检测；刘洪飞：实验实施，文献检索。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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