基于网络药理学和16S rRNA测序探讨黄连解毒汤治疗2型糖尿病的作用机制

The mechanism of action of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of type 2 diabetes mellitus was studied based on network pharmacology and 16S rRNA sequencing

摘要

目的 通过网络药理学和16S rRNA测序方法研究黄连解毒汤治疗2型糖尿病的作用机制。 方法 在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选黄连解毒汤的活性成分及靶点，将所获得靶点导入蛋白质数据库（UniProt）查找对应基因名；在人类基因组数据库（GeneCards）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、TTD数据库收集疾病靶点；通过韦恩图得到药物和疾病的交集靶点，并利用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物成分‑疾病靶点”网络以确定关键活性成分；通过STRING数据库进行蛋白与蛋白相互作用（PPI）分析，利用Cytoscape 3.7.2软件中插件功能筛选关键靶点；然后通过Metascape数据库进行KEGG富集分析并构建“药物成分‑疾病靶点‑信号通路”网络以确定关键信号通路；最后通过H&E染色和16S rRNA测序方法对网络药理学结果进行实验验证。 结果 通过网络药理学方法分析，得到黄连解毒汤共有85种活性成分及对应靶点236个，疾病靶点1 549个；两者交集靶点133个，所对应活性成分62个；黄连解毒汤的关键活性成分为槲皮素、汉黄芩素等，PPI网络分析主要包括蛋白激酶B1（AKT1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素‑6（IL‑6）等核心靶点且与磷酸肌醇3‑激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路密切相关。通过动物实验发现，与正常组相比，模型组大鼠结肠组织结构异常，腺体萎缩且排列紊乱，部分腺体间距增宽，杯状细胞明显减少；黄连解毒汤干预后结肠组织结构明显改善，腺体排列整齐，可见大量杯状细胞。并且黄连解毒汤能够影响肠道菌群丰富度和多样性，在门水平上增加厚壁菌门（Firmicutes）丰度，降低拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度，在属水平上增加乳酸杆菌属（Lactobacillus）、异芽孢杆菌属（Allobaculum）和布劳特氏菌属（Blautia）等有益菌丰度；LEfSe分析发现异芽孢杆菌属（Allobaculum）、乳酸球菌属（Lactococcus）和布劳特氏菌属（Blautia）是黄连解毒汤治疗2型糖尿病的差异性标志物。 结论 黄连解毒汤能够促进有益菌增殖，减轻肠道炎症反应，修复肠屏障来治疗2型糖尿病。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of action of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of type 2 diabetes mellitus by network pharmacology and 16S rRNA sequencing methods. Methods The active ingredients and targets of Huanglian Jiedu Decoction were screened in the TCM Systematic Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）， and the obtained targets were imported into the protein database （UniProt） to find the corresponding gene names. Disease targets were collected in the human genome database （GeneCards）， the online human Mendelian genetic database （OMIM）， and the TTD database. The intersection targets of drugs and diseases were obtained through the Venn diagram， and the "drug ingredient‑disease target" network was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software to determine the key active ingredients. Protein‑protein interaction （PPI） analysis was performed through the STRING database， and key targets were screened using the plug‑in function in Cytoscape 3.7.2 software. Then， the KEGG enrichment analysis was carried out through the Metascape database， and the "drug component‑disease target‑signaling pathway" network was constructed to identify the key signaling pathways. Finally， the network pharmacology results were verified by H&E staining and 16S rRNA sequencing. Results A total of 85 active ingredients and 236 corresponding targets were found in Huanglian Jiedu Decoction， and 1 549 disease targets were found by network pharmacology analysis. There were 133 intersecting targets and 62 corresponding active ingredients. The key active ingredients in Huanglian Jiedu Decoction are quercetin and wogonin， etc. The core targets of the PPI network analysis were protein kinase 1 （AKT1）， tumor necrosis factor （TNF）， interleukin‑6 （IL‑6）， and phosphoinositide 3‑kinase / protein kinase B （PI3K/ Akt） signaling pathways are closely related. Through animal experiments， it was found that compared to the normal group， the colon tissue structure of the rats in the model group was abnormal， the glands were atrophied and disordered， the spacing between some glands was widened， and the goblet cells were significantly reduced. After the intervention of Huanglian Jiedu Decoction， the tissue structure of the colon was significantly improved， the glands were arranged neatly， and a large number of goblet cells could be seen. In addition， Huanglian Jiedu Decoction could affect the richness and diversity of intestinal microbiota， increasing the abundance of Firmicutes at the phylum level， decreasing the abundance of Bacteroides， and increasing the abundance of beneficial bacteria such as Lactobacillus， Allobaculum and Blautia at the genus level. LEfSe analysis showed that Allobaculum， Lactococcus and Blautia were differential markers in the treatment of type 2 diabetes mellitus by Huanglian Jiedu Decoction. Conclusion Huanglian Jiedu Decoction can promote the proliferation of beneficial bacteria， reduce intestinal inflammation， and repair the intestinal barrier to treat type 2 diabetes.

Graphical abstract

关键词

黄连解毒汤 / 2型糖尿病 / 网络药理学 / 16S rRNA测序

Key words

Huanglian Jiedu Decoction / Type 2 diabetes mellitus / Network pharmacology / 16S rRNA

糖尿病已成为世界公共卫生问题，全球患病率逐年攀升，其中90%以上为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）。T2DM现行治疗方法包括口服药物和（或）补充胰岛素，绝大部分患者需要长期或终身服药，会出现各种消化道症状、注射胰岛素部位皮肤萎缩、皮下硬结等副作用，且患者依从性差。因此，亟待探索新的治疗方法。

随着多学科交叉的发展，采用肠道菌群16S rRNA测序与网络药理学探讨中医药治疗疾病机制的研究已经成为热点^［1］。研究表明肠道菌群与T2DM的发生、发展密切相关，当肠道菌群失调时导致细菌易位，破坏肠屏障完整性，细菌代谢成分脂多糖从肠道进入血循环，从而引发炎症反应，导致胰岛β细胞功能障碍，促进T2DM发生与发展^［2］。

T2DM属于中医“消渴”范畴，黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction，HLJDD）是治疗T2DM的经典方剂，具有清热解毒功效，现代药理学研究发现该方能够调节免疫功能、抗炎及改善肠道菌群结构^［3］。目前有关黄连解毒汤对T2DM肠道菌群影响的研究较少，不能很好地解释其治疗T2DM的作用机理。中医讲究整体观念，且中药具有“多成分、多靶点、多途径”等特性。故本文从网络药理学和肠道菌群角度出发，旨在研究黄连解毒汤治疗T2DM的潜在机制，为新药研发提供实验数据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠36只，体质量（180±20） g，购置于贵州中医药大学动物研究所，许可证号为SCXK（黔）2021‑0003；在标准条件下饲养（20~22 ℃，12 h光/暗循环），实验动物饲养和操作均符合中国实验动物伦理条款，所有实验动物操作经过贵州中医药大学动物伦理审查委员会批准（伦理批号：20230163）。

1.1.2 药物

黄连、栀子、黄柏、黄芩均购于北京同仁堂贵阳分店；按参考文献［4］方法将4味中药（黄连90 g，黄芩60 g，黄柏60 g，栀子90 g）放置于容器中，向其加入10倍量纯水，浸泡1 h后进行煮沸，煮沸后改予中火继续煎煮40 min，过滤后为第1次药液；向药渣中再次加入4倍量纯水，予中火持续煎煮30 min，过滤后得到第2次药液；将2次药液合并过滤后浓缩为含生药量1 g/mL，冷却后分装，留存于4 ℃冰箱备用。

1.1.3 试剂

盐酸二甲双胍片（江苏默克制药有限公司，批号：H20023370）；链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、苏木素‑伊红（H&E）高清恒染试剂盒（索莱宝科技有限公司，批号依次为522A021、G1076）；粪便DNA提取试剂盒［FastPure Stool DNA Isolation Kit（Magnetic bead），上海美吉逾华生物医药科技有限公司，批号T10‑100］。

1.1.4 仪器

三诺血糖仪（型号：安稳+，三诺生物有限公司）；血糖试纸（型号：安稳+Code，三诺生物有限公司）；超微量分光光度计（型号：NanoDrop2000，美国Thermo Fisher Scientific公司）；酶标仪（型号：synergy HTX，美国Biotek公司）；PCR仪（型号：T100 Thermal Cycler，美国BIO‑RAD公司）；测序仪（型号：Nexseq，美国Illumina公司）；

1.2 方法

1.2.1 药物及疾病信息收集

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库中按照口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18来筛选黄连解毒汤成分及靶点，将所得药物靶点导入蛋白质数据库（UniProt，https：//www.uniprot.org/）数据库获取基因名。以“type 2 diabetes mellitus”为关键词，在人类基因组数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org/）数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//www.omim.org/）、TTD数据库（https：//db.idrblab.net/ttd/）筛选疾病靶点，去除重复靶点后即为最终的疾病靶点。

1.2.2 蛋白质‑蛋白质相互作用（PPI）网络及生物学分析

将“1.2.1”所获得的药物及疾病靶点绘制韦恩图，得到两者交集靶点后构建成分‑靶点网络。将交集靶点输入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）进行PPI分析（最低要求互动分数≥0.9），最后利用Cytoscape 3.7.2软件可视化。随后将交集靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/gp/index.html），进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析及构建“药物成分‑靶点‑信号通路”网络。

1.2.3 分组给药及取材

所有实验动物适应性喂养1周，然后随机分为正常组（6只）、造模组（30只），正常组全程予普通饲料喂养。造模组予高脂饲料连续喂养6周，过夜禁食12 h称重后予STZ 30 mg/kg腹腔注射进行造模，于72 h后测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）>16.7 mmol/L判定造模成功^［5］。将造模成功的大鼠随机分为：模型组（DM）、黄连解毒汤高剂量组（HJD‑H）、黄连解毒汤中剂量组（HJD‑M）、黄连解毒汤低剂量组（HJD‑L）、二甲双胍组（MET），每组6只。并于造模成功后第2天进行灌胃处理，NC组和DM组予等体积生理盐水灌胃，黄连解毒汤高、中、低组给药剂量依次为6.3、3.15、1.58 g/kg（按照人与动物等效剂量公式换算，成人每日剂量为0.5 g/kg，中剂量=0.5 g/kg×70 kg×0.018/0.2 kg＝3.15 g/kg，中剂量2倍为高剂量，中剂量1/2倍为低剂量）；二甲双胍片说明书中成人每日最大剂量为2 g/70 kg（28.57 mg/kg），按等效倍数计算大鼠每日剂量为7×28.57 mg/kg=200 mg/kg^［7］，灌胃体积 10 mL/kg，连续给药21 d。末次给药后过夜禁食，采用应激排便法收集各组大鼠粪便，具体操作为用手提起大鼠尾部，使大鼠排便，并用无菌镊子夹取大鼠粪便至1.5 mL无菌EP管中，于-80 ℃留存。麻醉处死大鼠后，用组织剪剪取大鼠结肠组织，去除周边脂肪组织，反复用预冷过的PBS冲洗结肠，放置于滤纸上吸干液体后放入已加入4%多聚甲醛EP管中，常温保存备用。

1.2.4 结肠组织H&E染色

将4%多聚甲醛固定的结肠组织取出进行石蜡切片，经过以下染色步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ 20 min‑环保型脱蜡液Ⅱ 20 min‑无水乙醇Ⅰ 5 min‑无水乙醇Ⅱ 5 min‑75%酒精 5 min，自来水洗。（2）预处理：切片入高清恒染预处理液处理1 min。（3）苏木素染色：切片入苏木素染液染3~5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。（4）伊红染色：切片入95%的酒精脱水1 min，入伊红染液中染色15 s。（5）脱水封片：切片依次放入无水乙醇Ⅰ 2 min‑无水乙醇Ⅱ 2 min‑无水乙醇Ⅲ 2 min ‑正丁醇Ⅰ 2 min‑正丁醇Ⅱ 2 min‑二甲Ⅰ 2 min‑二甲苯Ⅱ 2 min透明，中性树胶封片。最后采用光学显微镜和图像采集软件，观察病理改变。

1.2.5 16S rRNA扩增、测序及分析

使用粪便总DNA试剂盒提取各组粪便样本总DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定合格后进行PCR扩增（20 μL扩增体系），扩增引物为27 F（5'‐AGAGT TTGATCCTGGCTCAG‑3'）338 R（5'‑TGCTGCCTCCCGTAGGAGT‑3'），扩增条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，72 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃最终延伸10 min，10 ℃停火，25~35 循环。文库构建和测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。将测序数据经质控和过滤、拼接、降噪等步骤处理后获得扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV），ASV是以100%相似性序列进行聚类，随后使用Qiime2生物信息学平台进行肠道微生物群多样性、群落组成及差异标志物等分析。

1.3 统计学处理

Graph Pad Prism 9.5.0软件对实验数据进行处理分析，计量数据以\overline{x}\pm s表示。2组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 药物及疾病信息筛选

按照筛选条件在TCMSP数据库中进行筛选，发现活性成分依次为黄连14种，黄芩36种，黄柏37种，栀子15种；所对应靶点依次为黄连186个，黄芩496个，黄柏213个，栀子203个；运用Uniprot数据库规范为相应的基因名进行整合去重，最终获得85种活性成分及236个对应靶点。在GeneCards数据库、TTD数据库、OMIM数据库中检索分别获得疾病靶点 107个、98个、1 475个，去重后得到1 549个疾病靶点。

2.2 PPI网络及生物学分析

将药物和疾病靶点绘制韦恩图（图1A），结果显示两者交集靶点为133个，所对应活性成分62个；“药物成分‑疾病靶点”网络结果表明度值排名前5的活性成分为槲皮素MOL000098、山柰酚MOL000422、汉黄芩素MOL000173、黄芩素MOL002714、金合欢素MOL001689，见图1B。将133个交集靶点输入STRING数据库进行PPI分析，得到133个节点，420条边，平均节点度为6.32。将PPI数据表代入Cytoscape 3.7.2软件进行可视化，结果显示肿瘤蛋白p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、蛋白激酶B1（serine/threonine protein kinase 1，AKT1）、Jun原癌基因（Jun proto‐oncogene，JUN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、白细胞介素‑6（interleukin‑6，IL‑6）等靶点作用突出（图1C）。使用Metascape数据库对133个靶点进行KEGG富集分析，并对前20条KEGG信号通路成图展示（图2A），包含了癌症通路、糖尿病并发症中的AGE‑RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、磷酸肌醇3‑激酶（phosphoinositide 3‑kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路、胰岛素抵抗等。为了更加明确成分、靶点及KEGG信号通路之间的关联性，通过构建“成分‑靶点‑通路”网络发现槲皮素MOL000098、汉黄芩素MOL000173是作用最突出的活性成分，AKT1靶点关联的信号通路最多，它还是PI3K/Akt信号通路的关键蛋白，并且TNF、IL‑6也与该通路密切相关，因此选取PI3K/Akt信号通路作为黄连解毒汤治疗T2DM的关键通路，见图2B。

2.3 血糖、体质量

正常组大鼠体毛顺滑，有光泽，进食正常，活动灵敏，精神佳；造模组大鼠毛发发黄、粗糙，失去光泽，精神萎靡，动作迟缓。正常组和造模组的FBG分别为（5.17±0.60）、（27.70±5.34） mmol/L，造模组大鼠FBG平均值比正常组高22.53 mmol/L（95%CI：25.71~29.70），差异有统计学意义（t=10.20，P<0.001）；正常组和造模组的体质量分别为（307.70±10.07）、（503.50±31.13） g，造模组大鼠体质量平均值比正常组高195.80 g（95%CI：491.9~515.1），差异有统计学意义（t=15.09，P<0.001）。见表1。

2.4 结肠组织H&E染色

结肠组织H&E染色结果见图3，正常组结肠组织结构未见明显异常，腺体排列有序且见大量杯状细胞；模型组大鼠结肠组织结构异常，腺体萎缩且排列紊乱，部分腺体间距增宽，杯状细胞明显减少；提示模型组大鼠肠屏障受损。与模型组相比，黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组结肠组织结构明显改善，腺体排列整齐，可见大量杯状细胞。

2.5 16S rRNA测序

2.5.1 肠道菌群多样性分析

Ace指数、Chao1指数、Sobs指数反映了细菌微生物群的丰富度，Shannon指数、Simpson指数则反映了细菌微生物群的多样性，Ace、Chao1、Sobs、Shannon等指数越高，代表物种丰富度和多样性越高，Simpson指数与之相反；Coverage指数反映物种覆盖度，数值越高，代表样本中未被检测出的序列越低。与正常组相比，模型组大鼠肠道菌群丰富度降低，多样性无明显变化；与模型组相比，黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组肠道菌群丰富度和多样性均降低；各组样本Coverage指数接近1，说明本次测序结果能够反映样本真实情况，可以用于后续分析。见表2。

为了更好地展示各组之间在ASV水平上的差异，绘制花瓣图，见图4A，发现6组共有65个ASV，正常组独有1 076个ASV，模型组独有866个ASV，黄连解毒汤低剂量组独有563个ASV，黄连解毒汤中剂量组独有653个ASV，黄连解毒汤高剂量组独有781个ASV，二甲双胍组独有733个ASV。说明各组物种组成差异大，黄连解毒汤治疗后降低了T2DM大鼠肠道菌群ASV数量。非度量多维尺度分析（non‑metric multidimensional scaling analysis，NMDS）可以通过胁强系数（Stress）来评估，Stress越小越具有代表性，结果见图4B，Stress<0.2，说明各组之间分组合理。

2.5.2 物种组成

门水平上，厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidota是各组的优势菌门，其中厚壁菌门Firmicutes在各组中所占比例依次为正常组81.54%，模型组87.90%，黄连解毒汤低剂量组98.81%，黄连解毒汤中剂量组98.52%，黄连解毒汤高剂量组98.69%，二甲双胍组98.07%；拟杆菌门Bacteroidota在各组中所占比例依次为正常组16.56%，模型组8.22%，黄连解毒汤低剂量组0.10%，黄连解毒汤中剂量组0.85%，黄连解毒汤高剂量组0.30%，二甲双胍组0.12%。见图5。

属水平上，乳酸杆菌属Lactobacillus：正常组12.60%，模型组8.16%，黄连解毒汤低剂量组23.97%，黄连解毒汤中剂量组30.69%，黄连解毒汤高剂量组13.83%，二甲双胍组23.00%；异芽孢杆菌属Allobaculum：正常组3.67%，模型组5.61%，黄连解毒汤低剂量组25.59%，黄连解毒汤中剂量组22.60%，黄连解毒汤高剂量组10.49%，二甲双胍组12.74%；布劳特氏菌属Blautia：正常组11.56%，模型组3.07%，黄连解毒汤低剂量组10.47%，黄连解毒汤中剂量组12.97%，黄连解毒汤高剂量组27.19%，二甲双胍组6.25%。见图6。

2.5.3 LEfSe分析

设定线性判别（linear discriminant analysis，LDA）值>3，进一步查找各组差异标志物种，见图7。门水平上，与正常组相比，模型组放线菌门Actinobacteriota相对丰度增加；与模型组相比，厚壁菌门Firmicutes在黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组中相对丰度增加；属水平上，与正常组相比，模型组厌氧支原体属Anaeroplasma、草酸杆菌属Oxalobacter、肠单胞球菌属Intestinimonas、NK4A214_group、阿德勒克罗伊茨菌属Adlercreutzia相对丰度增加；与模型组相比，黄连解毒汤低剂量组异芽孢杆菌属Allobaculum、乳酸球菌属Lactococcus相对丰度增加；黄连解毒汤中、高剂量组布劳特氏菌属Blautia相对丰度增加；二甲双胍组柯林斯菌属Collinsella相对丰度增加。

3 讨论

T2DM是世界上最普遍的代谢性疾病，其特征是骨骼肌、脂肪组织和肝脏中胰岛素分泌缺陷和外周胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）^［7］。IR是指机体在各种因素作用下，外周组织（脂肪、骨骼肌和肝脏等）对胰岛素敏感性降低，利用率下降，不能产生综合降糖反应^［8］。慢性低度炎症是T2DM的特征，并与IR发展有关。肥胖、遗传因素、环境因素、吸烟及某些药物等都可引发IR，其中肥胖诱发IR的根本原因是全身慢性低度炎症^［9］，它会导致生理和代谢调节受损、局部诱导的胰岛β细胞功能丧失、高血糖症的发作以及最终发生糖尿病^［10］。研究表明，肥胖或T2DM炎症浸润最常见的组织或器官包括脂肪组织、肝脏、肌肉和胰腺，巨噬细胞浸润在这些组织中会促进促炎因子的产生^［11］。慢性低度“代谢”炎症（局部和全身）也称为元炎症，它不同于经典炎症范式，是由代谢物质刺激机体产生的一种长期持续的无菌性炎症^［12］。其特征在于脂肪组织中免疫细胞积累，脂肪因子合成与释放失衡及促炎因子显著增加。在这种状态下，巨噬细胞的浸润及其代谢激活有助于复杂的旁分泌和自分泌信号传导，从而维持促炎微环境^{［13，14］}。介导巨噬细胞和脂肪细胞对过量营养物质微环境反应的关键信号通路是PI3K/Akt信号通路^［15］。

PI3K包含了Ⅰ类亚型、Ⅱ类亚型和Ⅲ类亚型，其中Ⅰ类亚型又分为ⅠA类（如p110α、p110β和p110δ）和ⅠB类^{［16］［17］}。Akt是PI3K下游主要效应分子，主要有Akt1、Akt2和Akt3这3种类型^［18］，胰岛素主要作用于肝脏、脂肪和骨骼肌，而Akt2也在这几种器官或组织中表达，当胰岛素受体与胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）结合后会激活PI3K/Akt信号通路以调节机体葡萄糖和脂肪代谢，维持葡萄糖稳态^［19］。具体来说，胰岛素与胰岛素受体相结合后导致酪氨酸残基自磷酸化，随后与IRS结合，磷酸化后的IRS与PI3K结合，导致p110催化亚基变构激活，PI2K2转化为PI3K3，募集并激活Akt，激活后的Akt通过磷酸化各种代谢酶或营养物质转运调节因子（如葡萄糖转运蛋白）直接调节葡萄糖代谢^［20］。巨噬细胞具有经典激活表型（M1）和可变激活表型（M2）两种形式，其中M1表现为促炎作用，而M2则与之相反，具有抗炎作用。M1型巨噬细胞通过诱导促炎因子释放来引发炎症级联反应^［21］。脂肪组织中的巨噬细胞在脂多糖、游离脂肪酸等因素作用下刺激Toll样受体4（toll‑like receptor 4，TLR4），随后激活kappa B抑制因子激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）促炎途径，IKK磷酸化IRS蛋白上的丝氨酸/苏氨酸残基，阻止了胰岛素受体与IRS相互作用，IKK的激活进一步磷酸化IκB蛋白激酶，导致其泛素化和蛋白酶体降解，并释放核因子κB（nuclear factor kappa‑B，NF‑κB）复合物，调节促炎基因的表达。同时阻断了包括PI3K/Akt通路在内的胰岛素信号转导，诱导IR同时减少细胞摄取葡萄糖，从而导致高血糖^{［22，23］}。TNF对炎症和自身免疫性疾病至关重要，它是由单核细胞和巨噬细胞产生的促炎因子，在肥胖和T2DM动物模型的脂肪组织中表达增加^［24］。TNF能够通过抑制胰岛素刺激的胰岛素受体和IRS在肌肉和脂肪组织中的酪氨酸磷酸化，从而促进IR^［25］。机体内1/3的IL‑6由脂肪组织产生，在T2DM和肥胖人群中IL‑6水平升高，其分泌增加会导致代谢功能障碍^［26］。减少脂肪组织中的IL‑6含量可以调节肝脏中细胞因子信号转导抑制分子的表达来防止IR的发展^［27］。

肠道菌群是一个复杂的生态系统，绝大部分由原核生物组成，一小部分由真菌、病毒、寄生虫、古细菌等组成，在人体新陈代谢中起着关键作用，部分肠道菌群可充当免疫调节剂^［28］。肠道菌群组成改变已被证实是肥胖和T2DM人群体内慢性低度炎症的驱动因素^［29］。肠道菌群、葡萄糖代谢和免疫系统3者间相互作用，肠道菌群通过产生各种代谢物质来影响宿主的葡萄糖代谢和激素产生；免疫系统塑造和控制肠道菌群，以保持宿主和微生物群之间的共生关系；葡萄糖代谢可以通过代谢和炎症途径的相互作用诱导免疫系统的促炎反应^［30］；持续高血糖会导致肠道通透性增加，导致细菌代谢成分脂多糖进入血循环，刺激TLR4，随后激活NF‑κB信号通路，增加促炎因子释放，引发炎症反应，导致胰岛β细胞功能障碍，包括胰岛素分泌不足和外周组织对胰岛素敏感性降低等^［2］。

通过网络药理学筛选发现槲皮素、汉黄芩素能够作用于AKT1、TNF、IL‑6等靶点，这些靶点与T2DM发病密切相关。槲皮素是中药黄连、黄柏、栀子所共有的活性成分，属于天然黄酮类化合物，具有抗炎、降血糖、免疫调节等作用^［31］。药代动力学研究表明槲皮素约93.3%在肠道中代谢^［32］，槲皮素能够作用于多种分子靶点来维持全身葡萄糖稳态，具有抗糖尿病潜力^［33］。有文献报道槲皮素能激活PI3K/Akt信号通路，减少促炎因子表达，有效减轻由脂多糖诱导的炎症^［34］。Lin等^［35］表明槲皮素能降低肠球菌、梭杆菌相对丰度，同时也提高了肠道有益菌（如双歧杆菌、乳酸杆菌等）的相对丰度。槲皮素还能通过增加乳酸球菌属相对丰度促进代谢产物短链脂肪酸生成，抑制TNF‑α、IL‑6等促炎因子产生，改善肠道菌群多样性和结构组成，同时修复肠屏障及减轻氧化应激反应^［36］。汉黄芩素是黄芩的活性成分，具有抗炎作用^［37］。汉黄芩素能够抑制促炎因子产生，修复肠道屏障，同时能抑制有害菌（变形菌门）定植和促进有益菌（如乳酸杆菌、双歧杆菌）增殖。此外，还能增加短链脂肪酸（如乙酸、丙酸和丁酸）生成^［38］。基于此，可以推测黄连解毒汤可能通过槲皮素、汉黄芩素作用于AKT1、TNF、IL‑6等靶点，抑制促炎因子表达，缓解T2DM慢性全身低度炎症，改善肠道菌群结构及修复肠道屏障。KEGG富集分析发现PI3K/Akt信号通路是黄连解毒汤治疗T2DM的关键通路，PI3K/Akt信号通路是胰岛素调节代谢的主要效应物^［39］，肝组织中PI3K/Akt信号通路的损伤会导致IR，从而导致T2DM。反过来，IR会加剧PI3K/Akt信号通路损伤，形成恶性循环^［40］。既往研究表明，NF‑κB的激活与糖尿病患者的血糖控制有关，抑制NF‑κB信号通路和减少炎症有利于维持血糖稳态，IKK是NF‑κB信号通路的关键蛋白，抑制IKK活性可促进AKT磷酸化，从而改善血糖代谢。炎性细胞因子也可抑制肝细胞中的胰岛素信号转导^［41］。提示，T2DM的发生可能通过PI3K/Akt信号通路影响下游炎症因子表达，引发肠道炎症，导致肠屏障受损，从而影响肠道菌群结构，加重T2DM病情。

基于网络药理学结果进行实验验证。结肠组织H&E结果表明T2DM与肠道屏障受损密切相关，而黄连解毒汤可以修复肠道屏障，同时影响了肠道菌群的多样性和丰富度。在物种组成分析中，门水平上，黄连解毒汤能够增加厚壁菌门相对丰度，降低拟杆菌门相对丰度；Porter等^［42］报道厚壁菌门可通过促进多糖发酵而维持肠道菌群平衡。革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分为脂多糖，也被称为内毒素，而拟杆菌门属于革兰氏阴性菌门，提示黄连解毒汤减轻肠道炎症可能是通过降低拟杆菌门丰度来实现的。属水平上，黄连解毒汤治疗后肠道菌群中异芽孢杆菌属、布劳特氏菌属、乳酸杆菌属相对丰度增加；这3种菌属都是产短链脂肪酸的有益菌，且均属于厚壁菌门。乙酸、丁酸、丙酸是最常见的短链脂肪酸，与机体炎症反应密切相关。异芽孢杆菌属可以影响葡萄糖代谢，从而产生丁酸和乳酸，其丰度高低与IR、肠道炎症呈负相关^［43］。布劳特氏菌是一种新型的潜在益生菌，能够促进短链脂肪酸（主要为乙酸、乳酸、琥珀酸）产生，同时能防止炎症发生，维持肠道稳态^［44］。丁酸能增强肠屏障功能，是维持结肠上皮的重要底物，也能减少脂多糖异位，抑制巨噬细胞中核因子NF‑κB活性，减少促炎因子产生^［45］。有文献报道，丁酸可以与免疫细胞上的G蛋白偶联受体相互作用来抑制促炎因子表达，从而达到抗炎作用^［46］。乙酸可以通过抑制NF‑κB信号通路减轻炎症反应，并改善肠上皮功能障碍^［47］。乳酸杆菌是人体肠道菌群中最常见也是最重要的益生菌，能够调节机体免疫功能、葡萄糖及脂质代谢，发挥屏障作用，抑制病原体侵袭。并且能产生乙酸和乳酸^［48］。Li等^［49］研究发现乳酸杆菌能够增加紧密连接蛋白表达来缓解db/db小鼠肠道损伤，并且可以改善PI3K/Akt信号通路和炎症因子分泌、增加短链脂肪酸水平，从而达到治疗T2DM的目的。通过LEfSe分析发现黄连解毒汤的差异性标志物为异芽孢杆菌属、布劳特氏菌属、乳酸球菌属，进一步证实了黄连解毒汤可能通过促进芽孢杆菌属、布劳特氏菌属、乳酸球菌属增殖，减轻肠道炎症反应，从而改善T2DM。

综上所述，本研究通过网络药理学和16S rRNA测序技术研究了黄连解毒汤治疗T2DM的潜在机制。结果表明黄连解毒汤能够促进有益菌增殖，减轻肠道炎症反应，修复肠屏障来治疗T2DM。为黄连解毒汤治疗T2DM的临床应用提供实验证据及参考。

作者贡献度说明：

韩雪：实验设计、实验操作、分析数据、论文撰写；唐秋梅、王巍：参与实验设计及实验操作；杨光勇：技术支持及指导；田维毅、何光志：指导实验设计、文章修改、内容审校。

所有作者不存在利益冲突关系。

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