miR‑126a‑3p靶向Bcl‑6介导凋亡途径调控脓毒症Th1/Th2细胞平衡

miR‑126a‑3p targets Bcl‑6 mediates apoptosis pathway to regulate Th1/Th2 cell balance in sepsis

摘要

目的 探讨miR‑126a‑3p与B细胞淋巴瘤6（Bcl‑6）的关系以及其对脓毒症小鼠T淋巴细胞凋亡及T细胞分化的影响和机制。 方法 利用miRWalk数据库预测miR‑126a‑3p的靶基因，进一步利用Cytoscape软件筛选出核心靶基因。然后通过腹腔注射0.9%氯化钠溶液（NS）和脂多糖（LPS；20 mg/kg）将小鼠随机分为正常对照组（sham组）、脓毒症组（LPS组）、LPS+miR‑126a‑3p mimic组（miR‑126 mimic组）、LPS+miR‑126a‑3p inhibitor组（miR‑126 inhibitor组）。48 h后从小鼠尾静脉采集外周血，通过密度梯度离心法提取T淋巴细胞，然后将miR‑126a‑3p模拟物（mimic）和抑制剂（inhibitor）转染至miR‑126 mimic组和miR‑126 inhibitor组脓毒症T淋巴细胞中。采用聚合酶链反应及蛋白质印记实验检测T细胞内Bcl‑6 mRNA和蛋白水平，Annexin V‑FITC/PI双染法检测T淋巴细胞凋亡，流式细胞术检测辅助性T细胞（Th）1、Th2比例，最后通过GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析。 结果 miRWalk数据库检索获得5 930个miR‑126a‑3p的预测靶点，其中Bcl‑6是miR‑126a‑3p的核心靶点之一。Bcl‑6的表达水平与miR‑126a‑3p的表达水平呈正相关，两者具有靶向调控关系。且与sham组相比，LPS组Bcl‑6 mRNA及蛋白表达减少，T淋巴细胞凋亡增多，T细胞向Th1分化增多，向Th2分化减少，Th1/Th2比值增加，差异均具有统计学意义（P<0.001）；与LPS组相比，增强（miR‑126 mimic组）或抑制（miR‑126 inhibitor组）miR‑126a‑3p表达后，Bcl‑6 mRNA和蛋白表达、T细胞凋亡及Th1和Th2细胞比例均表现出相应的增加或减少，差异均具有统计学意义（P<0.01）。 结论 脓毒症小鼠T淋巴细胞内抗凋亡蛋白Bcl‑6表达异常，其表达水平受miR‑126a‑3p的靶向调控，从而影响T淋巴细胞的凋亡及Th1/Th2细胞分化，进而调节脓毒症免疫状态，该研究可以为脓毒症患者的治疗提供新的治疗靶点和理论依据。

Abstract

Objective To explore the relationship between miR‑126a‑3p and B‑cell lymphoma 6 （Bcl‑6） as well as its effects and mechanisms on T‑lymphocyte apoptosis and T‑cell differentiation in mice with sepsis. Methods The miRWalk database was used to predict the target genes of miR‑126a‑3p， and the Cytoscape software was further used to screen the core target genes. Mice were then randomly divided into normal control group （the sham group）， sepsis group （the LPS group）， LPS+miR‑126a‑3p mimic group （the miR‑126 mimic group）， and LPS+miR‑126a‑3p inhibitor group （the miR‑126 inhibitor group） by intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride solution （NS） and lipopolysaccharide （LPS；20 mg/kg）. Peripheral blood was collected from the tail vein of mice after 48 hours. T lymphocytes were extracted by density gradient centrifugation， and then miR‑126a‑3p mimic and inhibitor were transfected into septic T lymphocytes of miR‑126 mimic group and miR‑126 inhibitor group. Reverse transcription‑quantitative polymerase chain reaction （RT‑qPCR） and Western blotting were used to detect Bcl‑6 mRNA and protein levels in T cells， Annexin V‑FITC/PI double staining method was used to detect apoptosis of T lymphocytes， flow cytometry was used to detect the helper T cell （Th）1， Th2 ratio， and finally the data were statistically analysed by GraphPad Prism 9.0 software. Results A total of 5 930 predicted targets of miR‑126a‑3p were retrieved from the miRWalk database， of which Bcl‑6 was one of the core targets of miR‑126a‑3p. The expression level of Bcl‑6 was positively correlated with the expression level of miR‑126a‑3p， and the two had a targeted regulatory relationship. And compared with the sham group， the LPS group showed a decrease in Bcl‑6 mRNA and protein expression， an increase in T‑lymphocyte apoptosis， an increase in T‑cell differentiation towards Th1， a decrease in differentiation towards Th2， and an increase in the Th1/Th2 ratio， with the difference being statistically significant in all cases （P<0.001）； Compared with the LPS group， after enhancing （miR‑126 mimic group） or inhibiting （miR‑126 inhibitor group） miR‑126a‑3p expression， Bcl‑6 mRNA and protein expression， T‑cell apoptosis， the ratio of Th1 and Th2 cells showed corresponding increases or decreases， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Conclusion The expression level of the anti‑apoptotic protein Bcl‑6 in T lymphocytes of sepsis mice is abnormal， and its expression level is regulated by miR‑126a‑3p， which affects the apoptosis of T lymphocytes and the differentiation of Th1/Th2 cells， thereby regulating the immune status of sepsis. This study can provide new therapeutic targets and theoretical basis for the treatment of patients with sepsis.

Graphical abstract

关键词

脓毒症 / miR‑126a‑3p / B细胞淋巴瘤6 / 细胞凋亡 / T淋巴细胞

Key words

Sepsis / miR‑126a‑3p / B‑cell lymphoma 6 / Apoptosis / T‑lymphocyte

脓毒症是机体对感染反应的失调，伴有多种细胞因子和炎症介质的诱导、合成与释放，通过诱发细胞因子风暴导致全身炎症反应综合征，是一种危及生命的多器官功能障碍综合征^［1］。据统计，全球每年约有超过3 000万人被确诊为脓毒症，虽然其发病率较前降低，但目前死亡率仍较高^［2］。大多数学者认为脓毒症是机体受到病原体包括细菌、真菌、寄生虫和病毒等感染时，病原体相关分子模式被免疫细胞表面的模式识别受体识别，宿主初始急性反应导致巨噬细胞及中性粒细胞等被激活并产生一系列促炎细胞因子，出现全身炎症反应，这是早期脓毒症的特征。然而，随着脓毒症病变的进展，抗炎细胞因子的释放增加、免疫细胞的凋亡增多以及T淋巴细胞的耗竭等会导致免疫抑制^［3］。因此，在抗炎补液的基础上了解脓毒症诱导免疫失衡的机制以及如何调节脓毒症免疫状态对于疾病的治疗和预防至关重要。

淋巴细胞是机体免疫应答功能的重要细胞成分和执行者，是免疫反应的核心。研究表明，脓毒症患者免疫细胞的异常死亡会导致免疫稳态被破坏，其中以淋巴细胞数量损失最为明显^［4］。T淋巴细胞通过识别抗原、分泌细胞因子以及直接杀伤靶细胞等方式参与免疫调节，其功能状态在维持脓毒症免疫耐受和免疫平衡方面发挥重要作用^［5］。脓毒症会破坏CD⁴⁺ T细胞亚群的表达和功能^［6‑8］。当T淋巴细胞数量减少、发生亚群改变或者功能缺陷时，就会发生脓毒症诱导的免疫麻痹。

微小RNA（microRNA， miRNA） 是一种长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA分子，通过调节真核生物中的基因表达，影响细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化及器官发育等多种病理生理过程。重要的是，它们已成为许多疾病的生物标志物。同样，脓毒症患者体内也存在特定的miRNA表达谱改变，其中miR‑1‑3p、miR‑15a、miR‑21及miR‑133a等在脓毒症患者外周血中表达增加，而miR‑142‑5p、miR‑146a及miR‑150等表达减少^［9］。而且，miRNA可以影响T淋巴细胞比例，发挥免疫调节作用，其可作为免疫功能的监测点^［10］。miR‑126a‑3p是miRNA家族的重要成员，可调节NF‑κB信号通路，与炎症反应和免疫反应有关，在调节细胞增殖及分化等方面也发挥重要作用。研究发现，miR‑126a‑3p在脓毒症小鼠中也存在差异性表达，且脓毒症发生时伴随多种免疫细胞的凋亡及亚群改变，但相关机制尚不清楚。Bcl‑6是抗细胞凋亡家族中的一员，可以与不同的阻遏物和组蛋白去乙酰化酶相互作用，抑制其下游靶基因的转录表达，进而抑制细胞凋亡^［11］。因此，本研究将探讨miR‑126a‑3p与抗凋亡蛋白Bcl‑6的关系以及其对脓毒症小鼠T淋巴细胞凋亡和T细胞亚群中Th1/Th2细胞平衡的影响，为脓毒症患者的治疗提供新的治疗靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及主要仪器

脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）、淋巴细胞分离液、miR‑126a‑3p模拟物、miR‑126a‑3p抑制剂、脂质体3000（Lip3000，Invitrogen 13000015）、Western Blotting检测试剂盒、Annexin V‑FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、羊抗小鼠IgG‑HRP、羊抗兔IgG‑HRP及Rabbit Anti‑GAPDH均购于中国江苏凯基生物有限公司，cDNA第一链合成试剂盒及One Step TB GreenTM PrimeScriptTMRT‑PCR Kit II（SYBR Green）购自日本 TaKaRa RR086B，6孔细胞培养板购自美国Corning Incorporate，INF‑γ抗体（英国 abcam）、IL‑4抗体（英国 abcam）、Bcl‑6抗体（英国 abcam）。电泳仪（美国 Bio‑rad Power Supplies Basic），脱色摇床（中国江苏金坛 HY‑4），涡旋振荡器（中国海门其林贝尔 XW‑80A），Trans‑Blot Turbo全能型蛋白转印系统（美国 Bio‑rad 170‑4150），凝胶成像系统（英国 SYNGENE G：BOXChemiXR5），多功能酶标仪（美国 MD Spectramac M3），紫外光谱仪（日本SHIMADZU UV‑2450），普通梯度PCR仪（美国ABI Veriti 96 well Thermal cycler），荧光定量PCR循环仪（美国ABI Step one plus Real time‑PCR system），流式细胞仪（Beckman‑Coulter Cytoflex S）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及实验分组

于杭州子源实验动物科技有限公司购买6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，重量20~25 g，并在蚌埠医科大学第一附属医院动物实验室特定无病原体且温度（20~24 ℃）、湿度（40%~60%）、光照适宜环境中喂养1周。以20 mg/kg剂量于小鼠腹腔注射LPS，建立脓毒症模型，对照组腹腔注射同等剂量的0.9% NS。48 h后通过尾静脉采集小鼠外周血，通过密度梯度离心法提取T淋巴细胞。将miR‑126a‑3p模拟物（mimic）和抑制剂（inhibitor）转染至脓毒症T淋巴细胞中，建立脓毒症T淋巴细胞干预模型，将实验分为sham组、LPS组、LPS+miR‑126a‑3p mimic组（miR‑126 mimic组）、LPS+miR‑126a‑3p inhibitor组（miR‑126 inhibitor组）。实验结束后，所有小鼠吸入2%异氟醚麻醉，待小鼠完全麻醉后以颈椎脱位法迅速且无痛处死小鼠。处死的小鼠置于塑料废物袋中于冰柜中冻存，最后由医疗废弃物处理单位统一处理。整个实验过程严格遵循动物伦理标准及原则进行。该研究所有实验动物均按照蚌埠医科大学第一附属医院伦理委员会批准的规则进行［伦动科批字（2023）第500号］。

1.2.2 miR‑126a‑3p靶基因的预测

利用miRWalk［Home‑miRWalk （uni‑heidelberg.de）］数据库进行小鼠miR‑126a‑3p靶基因预测，将获得的结果进行初步筛选后导入String数据库构建PPI网络图，再将得到的PPI网络导入至Cytoscape软件进行拓扑值分析，并依据Degree值筛选出核心靶基因。

1.2.3 T淋巴细胞的提取

取脓毒症小鼠和对照组小鼠外周血1 mL，离心抗凝血后吸去血浆，于剩余血细胞中加入生理盐水混匀，然后加入淋巴细胞分离液2 000 r/min离心5 min，吸取单个核细胞层转至另一试管，稀释洗涤后以1 800 r/min离心10 min，重复洗涤后以1 400 r/min再次离心10 min，最后弃去上清液用适量的培养基重悬细胞计数。清洗尼龙毛后，用预先加热的培养液稀释要分离的细胞液（浓度约为5.0×10⁷个细胞/mL），将细胞液倒入含有尼龙毛柱的注射器内，37 ℃温育1 h，然后打开阀门以1滴/min的速度缓慢放出细胞液，最后通过离心获得T淋巴细胞。

1.2.4 细胞转染

将T淋巴细胞至于6孔板中，使细胞融合度达到60%，分别用miR‑126a‑3p mimic和miR‑126a‑3p inhibitor转染T细胞。转染的脂质体为脂质体3000。在转染管中加入无血清培养基和转染试剂，于37 ℃ CO₂培养箱中培养48 h。

1.2.5 蛋白质印记实验（Western blotting）检测Bcl‑6蛋白表达

提取的T淋巴细胞洗涤、消化后转入离心管内再洗涤，然后向管内加入磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF和冷Lysis Buffer并离心（14 000 r/min，4 ℃，离心5 min），从上清液中提取全蛋白提取物。在酶标板内加入BCA工作液，在562 nm下做比色测定，绘出标准曲线得到蛋白含量。然后进行电泳、转膜、与抗体孵育过夜，最后采用ChemiDoc MP Imaging System进行成像，使用Gel‑Pro32软件对结果进行灰度分析。

1.2.6 聚合酶链反应（RT‑qPCR）检测Bcl‑6 mRNA表达

将获得的T淋巴细胞置于6孔板内，向内加入TRIzol后移入离心管中，像管内依次加入氯仿、异丙醇、70%乙醇进行离心，然后加入无RNase水溶解RNA沉淀于-70 ℃保存，最后进行RNA浓度和纯度的测定。接着，将提取的总RNA通过逆转录获得cDNA并稀释，加入引物后进行PCR程序测定。

1.2.7 Annexin V‑FITC/PI双染法检测细胞凋亡

将细胞培养液中处于对数生长期的T淋巴细胞接种到6孔板中，依次加入0.25%胰酶消化细胞、PBS洗涤细胞、Binding Buffer重悬细胞，然后采用Annexin V‑FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对T淋巴细胞进行染色，在室温黑暗环境中反应15 min，最后使用流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡情况。

1.2.8 流式细胞术检测T淋巴细胞表型

将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，然后收集细胞用PBS洗涤重悬，加入PMA诱导后在4 ℃冰箱内孵育12 h，离心后去上清，加入固定液后再次离心，然后添加IFN‑γ和IL‑4抗体，将T淋巴细胞与抗体37 ℃避光孵育30 min，加入破膜液后离心去上清，然后再次加入IFN‑γ和IL‑4抗体，37 ℃避光孵育30 min，最后加入PBS采用流式细胞仪检测T淋巴细胞表型。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0软件对所有数据进行统计分析，服从正态分布的计量资料均以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。不服从正态分布的计量资料，使用非参数检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR‑126a‑3p靶基因的预测

miRWalk数据库是一个集miRNA查询、靶基因预测的数据库，该数据库是收录物种信息最多的miRNA信息数据库。利用miRWalk数据库以miR‑126a‑3p为关键词，物种设置为“mouse”，检索获得5 930个预测靶点，以“bindingp≥0.9，seed=1，position=3UTR”为条件进行初步筛选后获得653个预测靶点。将653个预测靶点导入至String数据库进行PPI网络分析（图1），去除游离靶点后获得的网络导入至Cytoscape软件获得232个节点，470条边的网络。对该网络进行拓扑值分析，按照Degree值大小进行排列和赋色，节点越大、颜色越深代表关联度越高（图2A）。并进一步筛选出度值最高的前25位核心靶基因（图2B），其中Bcl‑6是miR‑126a‑3p的核心靶点之一，其度值为9。

2.2 miR‑126a‑3p与Bcl‑6之间存在靶向调控关系

本课题组在前期研究中发现，脓毒症时T淋巴细胞内miR‑126a‑3p表达下降^［12］，又通过生物信息技术发现与凋亡有关的Bcl‑6和miR‑126a‑3p具有相关性。然后通过转染技术、RT‑qPCR及Western blotting检测4组间Bcl‑6 mRNA和蛋白的表达，结果发现：与sham组相比，LPS组Bcl‑6表达显著下降（mRNA及蛋白表达分别为t=13.19，P<0.001；t=11.71，P<0.001）；转染miR‑126 mimic后，miR‑126 mimic组脓毒症T淋巴细胞中Bcl‑6的表达较LPS组显著增加（mRNA及蛋白表达分别为t=24.86，P<0.001；t=6.02，P<0.001），而转染miR‑126 inhibitor后，Bcl‑6表达较LPS组减少（mRNA及蛋白表达分别为t=10.72，P<0.001；t=4.13，P<0.01）（图3A、B），明确了两者之间存在靶向调控关系。

2.3 miR‑126a‑3p对脓毒症T淋巴细胞凋亡的影响

LPS组与sham组、miR‑126 mimic组以及miR‑126 inhibitor组T淋巴细胞凋亡率的表达比较，差异均有统计学意义（P<0.001）。LPS组T细胞凋亡率较sham组明显增加（t=30.84， P<0.001），且增加或抑制miR‑126a‑3p表达后，miR‑126 mimic组以及miR‑126 inhibitor组T淋巴细胞凋亡率较LPS组相比均表现出相应的降低或增加（分别为t=10.24， P<0.001； t=10.94， P<0.001）（图4A、B）。与结果1及结果2结合，结果显示脓毒症T细胞内miR‑126a‑3p可以靶向Bcl‑6影响其凋亡。

2.4 miR‑126a‑3p对脓毒症T淋巴细胞亚群（Th1和Th2）分化的影响

流式细胞术检测sham组、LPS组、miR‑126 mimic组以及miR‑126 inhibitor组Th1及Th2细胞比例，4组间Th1细胞及Th2细胞的表达差异均有统计学意义（P<0.001）。与sham组相比，LPS组Th1细胞比例明显增加（t=13.68， P<0.001），Th2细胞比例明显降低（t=15.60， P<0.001）。与LPS组相比，miR‑126 mimic组Th1细胞表达减少（t=24.65， P<0.001），Th2细胞表达增多（t=11.88， P<0.001），而抑制miR‑126a‑3p表达后，Th1和Th2细胞的比例与刺激组表现出相反的结果（Th1和Th2分别为t=9.40， P<0.001；t=6.89， P<0.001）（图5A、B）。而且，正常情况下Th1/Th2细胞比值处于相对平衡状态，脓毒症发生时Th1/Th2细胞平衡被打破，脓毒症小鼠处于免疫失衡状态，表现为过度的炎症反应。

3 讨论

重症监护病房患者由于免疫力低下、长期卧床、长期留置相关导管以及长期使用抗生素等多种原因易发生感染，当细菌及毒素侵入门脉系统及淋巴系统，诱发大量炎症介质释放，发生促炎反应与抗炎反应的失衡就会引发脓毒症，最终发展为多器官功能衰竭，该病预后差，死亡率极高^［13］。这可能与脓毒症发生时体内促炎因子与抗炎因子释放比例改变、免疫效应细胞异常死亡、T细胞耗竭、神经内分泌反馈等导致淋巴细胞数量减少、淋巴细胞亚群水平和细胞因子分泌改变有关^［14］。

淋巴细胞作为免疫反应的核心，在调控免疫平衡中发挥重要作用。在脓毒症患者中，循环血液中T淋巴细胞数量显著减少，引起T细胞缺陷最显著的原因之一就是细胞凋亡，而免疫细胞的减少导致多种免疫缺陷，引起炎症反应、免疫抑制和感染，与患者死亡率相关^［15］。早期研究表明，CD⁴⁺ T细胞及CD⁸⁺ T细胞数量在脓毒症打击后均出现显著下降，但CD⁸⁺ T细胞的凋亡程度明显低于CD⁴⁺ T细胞。所以逐渐有研究者提出，T淋巴细胞亚群，尤其是CD⁴⁺ T细胞有助于自身免疫和炎性疾病的进展，其在免疫调节方面发挥重要作用。大量研究表明，脓毒症事件导致T淋巴细胞亚群数量和质量改变，影响细胞凋亡、焦亡、自噬、增殖等过程，导致机体出现不同程度的免疫功能受损^{［16，17］}。王君生^［18］通过分析脓毒症存活患者与死亡患者的T淋巴细胞亚群比例，证明了T细胞亚群与脓毒症患者预后有关，死亡的脓毒症患者CD⁸⁺水平更高，而CD⁴⁺水平更低。也有研究指出脓毒症患者存在T细胞数量及Treg亚群紊乱，且与脓毒症免疫抑制有关^［19］。

本课题组在前期研究中已经发现脓毒症T淋巴细胞内miR‑126a‑3p表达减少，且会影响Th17细胞及Treg细胞的分化。CD⁴⁺ T细胞亚群中最先发现的Th1参与细胞免疫，Th2参与体液免疫，正常情况下二者处于动态平衡状态，维持机体免疫反应的平衡^［20］。CD⁴⁺ T细胞亚群的表达可能受内源性和外源性因素的调节，虽然本课题组没有进一步明确各种辅助性T细胞亚群比例，但基于流式细胞术发现，脓毒症发生时Th1细胞比例增加，而Th2细胞比例降低，提示脓毒症患者存在明显的CD⁴⁺ T淋巴细胞紊乱，这可能是因为感染导致T细胞活化，来自IL‑2家族的共刺激细胞因子通过累加效应驱动CD⁴⁺ T细胞分化为分泌IFN‑γ的Th1细胞。但是这和Gupta等^［21］的实验结果Th2增多相悖，可能是因为该研究获取的T淋巴细胞处于脓毒症早期，而Gupta等在脓毒症晚期收集患者淋巴细胞且患者有严重创伤史，也有可能是小鼠和人体的基因差异所致。通过转染促进miR‑126a‑3p表达后，Th1细胞分化减少，Th2细胞分化增多，抑制miR‑126a‑3p表达后，Th1细胞分化增多，Th2细胞分化减少，结合先前miR‑126a‑3p对Th17及Treg细胞分化的影响，证实了miR‑126a‑3p在调节CD⁴⁺ T细胞亚群分化中具有不可忽视的作用。

为了了解miR‑126a‑3p影响T细胞亚群分化的具体机制及作用靶点，笔者利用miRWalk数据库筛选到与miR‑126a‑3p关联度最高的前25位核心靶基因，发现与细胞凋亡有关的Bcl‑6也是miR‑126a‑3p的靶点之一，并证实了miR‑126a‑3p与Bcl‑6之间确实存在靶向调控关系。凋亡是细胞的程序性死亡，可以通过细胞刺激、DNA损伤以及发育信号等内源性途径，死亡受体信号转导的外源性途径，以及通过T细胞介导的细胞毒性和穿孔素/颗粒酶途径被激活^［22］，然后通过线粒体通路、死亡受体通路以及内质网通路介导细胞凋亡^［23］。国内外研究表明，细胞凋亡可以导致T淋巴细胞、B淋巴细胞以及NK细胞等免疫细胞损伤，还会影响疾病进展、导致淋巴细胞亚群改变以及机体的免疫功能紊乱^［24］。

现有研究表明，虽然多数脓毒症患者能够在最初的脓毒症事件引起的细胞因子风暴中幸存下来。然而，存活的患者与未发生脓毒症的患者相比，长期处于免疫功能障碍状态，表现出对继发性感染的易感性增加，病毒激活增加，5年生存率降低，这可能就是因为淋巴细胞凋亡增多，导致机体免疫稳态被破坏所致。与众多研究结果一致，通过腹腔注射LPS建立的脓毒症小鼠模型中也同样得到了脓毒症发生时T淋巴细胞凋亡增多的结果。这可能是因为脓毒症炎症反应中关键的炎症因子TNF‑α、IL‑6及IL‑1通过外源性途径和线粒体途径等激活Fas/FasL信号通路及JAK‑STAT信号通路，进而诱导淋巴细胞凋亡。此外，大量活性氧生成导致的氧化应激损伤、Fas/FasL系统平衡的破坏以及病原体及其产物对淋巴细胞的直接损害都是导致脓毒症淋巴细胞凋亡的关键原因。笔者还观察到miR‑126a‑3p的显著上调可以减少脓毒症诱发的T淋巴细胞凋亡，而当miR‑126a‑3p的表达进一步降低时，T淋巴细胞凋亡更为明显。脓毒症T淋巴细胞凋亡增多意义重大，因为它是导致脓毒症免疫失衡和死亡率增加的关键原因，预防淋巴细胞凋亡可以减轻脓毒症诱导的死亡，改善脓毒症患者预后。有通过研究证实了低剂量的艾司洛尔可以降低脓毒症T淋巴细胞的凋亡，影响Th1细胞和Th2细胞的比例以及Th2/Th1比值，调节免疫反应提高脓毒症患者的存活率^［25］。所以，笔者猜想miR‑126可以作为调节脓毒症淋巴细胞凋亡及亚群分化的靶点之一，其表达水平可以调节脓毒症发生时免疫状态。

Bcl‑2影响细胞凋亡的作用十分明确^［26］，其过表达可以减少脓毒症淋巴细胞凋亡也已得到证实^［27］。Bcl‑6与Bcl‑2一样，是抗细胞凋亡家族中的一员，其主要功能是抑制转录，通过与细胞死亡基因的启动子结合从而抑制参与细胞凋亡的基因表达进而发挥抑制细胞凋亡的作用，该过程主要通过控制线粒体膜的通透性来调控。虽然Bcl‑6主要在B淋巴细胞内表达，是生发中心B细胞的主要调节因子，在B细胞的生长和分化中起重要作用，与淋巴瘤的发生密切相关，但在T淋巴细胞内也可表达Bcl‑6，且与机体免疫力以及T细胞分化有关^{［28，29］}。脓毒症导致T细胞缺陷的原因之一就是细胞凋亡，这和本研究结果一致，笔者除了发现LPS刺激后T淋巴细胞亚群分化发生改变外，还观察到脓毒症小鼠T淋巴细胞内Bcl‑6表达减少，T淋巴细胞凋亡增多，总体活性降低的现象。这可能是因为脓毒症发生时，抗凋亡蛋白家族减少，不能充分结合并抑制促凋亡蛋白，而T淋巴细胞受到刺激导致具有BH3结构域的促凋亡蛋白BAD、BID以及BIM等被激活，进一步影响线粒体外膜通透性，从而导致细胞色素C释放后与凋亡小体Apaf‑1形成复合体，通过激活caspase‑9导致凋亡被激活。为了明确Bcl‑6参与细胞凋亡的具体机制，通过查阅KEGG信号通路数据库，明确了Bcl‑6参与细胞凋亡及免疫调节等多种生物学过程。这些功能的发挥与TGF‑β信号通路、胰岛素信号通路、PI3K‑Akt信号通路、Jak‑STAT信号通路以及MAPK信号通路有关，各个通路激活核心基因FOXO，然后转至细胞核内启动p15、Bcl‑6、BNIP3、DEPP1等下游靶基因参与细胞周期调控、细胞凋亡、细胞自噬、抗氧化应激以及免疫调节等过程，但Bcl‑6对下游靶基因及信号通路的影响目前知之甚少。有研究表明，Bcl‑6可以通过影响p53信号通路诱导细胞凋亡^［30］，还可以作用于CD69、CD44、细胞周期蛋白D2、Blimp‑1、B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1等影响B淋巴细胞的活化及分化^{［31‑33］}。所以，在T细胞上可能也存在某些靶基因可以通过与Bcl‑6的相互作用影响T淋巴细胞的凋亡、分化、活化、增生以及DNA损伤修复等过程。笔者在研究中发现Bcl‑6可以通过影响T淋巴细胞凋亡进而调控Th1细胞和Th2细胞的比例与上述猜想一致，并通过qRT‑PCR及Western blotting证明了该过程受miR‑126a‑3p调控。

综上所述，本研究结果表明脓毒症T淋巴细胞内Bcl‑6表达异常，其表达水平受miR‑126a‑3p的靶向调控，进而影响T细胞的凋亡及分化，此改变说明miR‑126a‑3p及Bcl‑6可能参与了脓毒症免疫失衡过程，且该过程受多种信号通路调控。该研究为脓毒症免疫失衡的机制研究提供了一个新的思路方向。但是本研究仍存在一些不足之处，首先动物实验样本量较小，其次缺乏临床研究数据，Bcl‑6影响T淋巴细胞凋亡的具体信号转导机制需要进一步明确，这也是下一步的研究重点。

作者贡献度声明：

刘成：构思研究思路及研究设计；李苗苗：撰写及修改手稿；王洁、齐雅囡：完成靶点筛选及相关动物实验；王婷、王德伟：分析整理数据。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

安徽省高等学校自然科学基金资助项目(2023AH051996)

蚌埠医学院自然科学基金资助项目(2022byzd039)