Gasdermin D基因敲除对慢加急性肝衰竭小鼠肝组织坏死性凋亡通路RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL表达的影响

摘要

目的：探讨Gasdermin D（GSDMD）基因敲除对慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）小鼠肝组织坏死性凋亡通路RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL表达的影响。方法：通过生物信息学分析焦亡、坏死性凋亡通路及相关基因在不同慢性肝病中的表达情况；对焦亡执行蛋白GSDMD与坏死性凋亡关键蛋白MLKL等构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络；对GSDMD与坏死性凋亡通路及其效应蛋白MLKL进行线性拟合相关性分析。通过四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl₄）联合肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae,K.P.）构建ACLF小鼠模型，设立野生型（wild type,WT）空白对照组、4 w/8 w CCl₄肝损伤及ACLF组，GSDMD基因敲除（knockout,KO）空白对照组及ACLF组，ELISA检测ALT/AST、IL-33/IL-1α水平；H&E染色观察小鼠肝组织病理学；实时荧光定量PCR、Western blot检测小鼠肝组织焦亡相关基因及蛋白Caspase-1/11、GSDMD-FL/N、IL-18/1β及坏死性凋亡关键蛋白RIPK1/3、MLKL、p-MLKL的表达；免疫荧光检测肝组织GSDMD、MLKL荧光强度。结果：生信分析示焦亡与坏死性凋亡通路相关基因在ACLF中表达明显上调，GSDMD与坏死性凋亡通路及MLKL在ACLF中呈正相关。体内实验显示，与空白对照相比，ACLF小鼠肝组织焦亡与坏死性凋亡相关蛋白表达均上调（P<0.01），免疫荧光示GSDMD荧光强度明显增加（P<0.001）。与野生型ACLF组相比，GSDMD基因敲除ACLF组小鼠生存时间延长；ALT、IL-33等水平降低（P<0.05）;H&E染色示增生纤维组织较野生型ACLF组减少，肝细胞少量坏死，部分有炎症细胞浸润；RIPK1/3、MLKL、p-MLKL表达均明显下调（P<0.05）；肝细胞MLKL免疫荧光强度明显减少（P<0.001）。结论：细胞焦亡与坏死性凋亡是ACLF重要的两种细胞死亡方式，敲除焦亡执行蛋白GSDMD通过抑制坏死性凋亡通路RIPK1/3、MLKL、p-MLKL的表达，减少IL-33、IL-1α炎性细胞因子的释放，减少肝细胞死亡并减轻肝组织炎症从而改善ACLF小鼠肝损伤程度，提高小鼠存活率。

关键词

慢加急性肝衰竭(ACLF) / 细胞焦亡 / 坏死性凋亡 / GSDMD基因敲除