Gasdermin D基因敲除对慢加急性肝衰竭小鼠肝组织坏死性凋亡通路RIPK1、RIPK3、MLKL、p⁃MLKL表达的影响

Effect of Gasdermin D gene knockout on the expression of necroptosis pathway RIPK1, RIPK3, MLKL and p⁃MLKL in liver tissue of mice with acute⁃on⁃chronic liver failure

摘要

目的 探讨Gasdermin D（GSDMD）基因敲除对慢加急性肝衰竭（acute⁃on⁃chronic liver failure，ACLF）小鼠肝组织坏死性凋亡通路RIPK1、RIPK3、MLKL、p⁃MLKL表达的影响。 方法 通过生物信息学分析焦亡、坏死性凋亡通路及相关基因在不同慢性肝病中的表达情况；对焦亡执行蛋白GSDMD与坏死性凋亡关键蛋白MLKL等构建蛋白质⁃蛋白质相互作用（PPI）网络；对GSDMD与坏死性凋亡通路及其效应蛋白MLKL进行线性拟合相关性分析。通过四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl₄）联合肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae，K.P.）构建ACLF小鼠模型，设立野生型（wild type，WT）空白对照组、4 w/8 w CCl₄肝损伤及ACLF组，GSDMD基因敲除（knockout，KO）空白对照组及ACLF组，ELISA检测ALT/AST、IL⁃33/IL⁃1α水平；H&E染色观察小鼠肝组织病理学；实时荧光定量PCR、Western blot检测小鼠肝组织焦亡相关基因及蛋白Caspase⁃1/11、GSDMD⁃FL/N、IL⁃18/1β及坏死性凋亡关键蛋白RIPK1/3、MLKL、p⁃MLKL的表达；免疫荧光检测肝组织GSDMD、MLKL荧光强度。 结果 生信分析示焦亡与坏死性凋亡通路相关基因在ACLF中表达明显上调，GSDMD与坏死性凋亡通路及MLKL在ACLF中呈正相关。体内实验显示，与空白对照相比，ACLF小鼠肝组织焦亡与坏死性凋亡相关蛋白表达均上调（P<0.01），免疫荧光示GSDMD荧光强度明显增加（P<0.001）。与野生型ACLF组相比，GSDMD基因敲除ACLF组小鼠生存时间延长；ALT、IL⁃33等水平降低（P<0.05）；H&E染色示增生纤维组织较野生型ACLF组减少，肝细胞少量坏死，部分有炎症细胞浸润；RIPK1/3、MLKL、p⁃MLKL表达均明显下调（P<0.05）；肝细胞MLKL免疫荧光强度明显减少（P<0.001）。 结论 细胞焦亡与坏死性凋亡是ACLF重要的两种细胞死亡方式，敲除焦亡执行蛋白GSDMD通过抑制坏死性凋亡通路RIPK1/3、MLKL、p⁃MLKL的表达，减少IL⁃33、IL⁃1α炎性细胞因子的释放，减少肝细胞死亡并减轻肝组织炎症从而改善ACLF小鼠肝损伤程度，提高小鼠存活率。

Abstract

Objective To investigate the effect of Gasdermin D（GSDMD） gene knockout on the expression of necroptosis pathway RIPK1， RIPK3， MLKL and p⁃MLKL in liver tissue of mice with acute⁃on⁃chronic liver failure（ACLF）. Methods Bioinformatics was used to analyze the expression of pyroptosis and necroptosis pathway and related genes in different chronic liver diseases. The protein‑protein interaction （PPI） network between the execution protein GSDMD of pyroptosis and necroptosis key protein MLKL was contructed.And the linear correlation between GSDMD and necroptosis pathway and its effector protein MLKL was analyzed. Carbon tetrachloride （CCl₄） combined with Klebsiella pneumoniae （K.P.） was used to establish ACLF mouse model. Wild type （wild type， WT） blank control group， 4 w and 8 w CCl₄ liver injury and ACLF group， GSDMD gene knockout （knockout， KO） blank control group and ACLF group were set up. The levels of ALT/AST and IL⁃33/IL⁃1α were detected by ELISA. The histopathology of liver tissue was observed by H&E staining. The expressions of pyroptosis related gene and proteins Caspase⁃1/11， GSDMD⁃FL/N， IL⁃18/1β and necroptosis key proteins RIPK1/3， MLKL， p⁃MLKL in liver tissue were detected by real⁃time fluorescence quantitative PCR and Western blot. And the fluorescence intensity of GSDMD and MLKL in liver tissue were detected by immunofluorescence. Results Bioinformatics analysis showed that the expression of genes related to pyroptosis and necroptosis pathway was significantly up⁃regulated in ACLF， and GSDMD was positively correlated with necroptosis pathway and MLKL in ACLF. The in vivo experiment showed that compared to the blank control， the expression of pyroptosis and nrcroptosis related proteins in liver tissue of ACLF mice was up⁃regulated （P<0.01）， and immunofluorescence showed that the fluorescence intensity of GSDMD was significantly increased （P<0.001）. Compared to the wild type ACLF group， the survival time of the GSDMD knockout ACLF group was prolonged， the levels of ALT and IL⁃33 were decreased （P<0.05）， the H&E staining showed that the hyperplastic fibrous tissue was less than the wild type ACLF group， the hepatocytes were necrotic， some of them had inflammatory cell infiltration， the expressions of RIPK1/3， MLKL and p⁃MLKL were significantly down⁃regulated（P<0.05）， and the immunofluorescence intensity of hepatocyte MLKL was significantly decreased （P<0.001）. Conclusion Hepatocyte pyroptosis and necroptosis are two important ways of cell death in ACLF. Knockout executive protein GSDMD can inhibits the expression of RIPK1/3， MLKL and p⁃MLKL in necroptosis pathway， reduce the release of inflammatory cytokines of IL⁃33 and IL⁃1α， reduce hepatocyte death and reduce liver inflammation， so as to improve the degree of liver injury and improve the survival rate of ACLF mice.

Graphical abstract

关键词

慢加急性肝衰竭（ACLF） / 细胞焦亡 / 坏死性凋亡 / GSDMD基因敲除

Key words

Acute⁃on⁃chronic liver failure（ACLF） / Pyroptosis / Necroptosis / GSDMD knockout

慢加急性肝衰竭（acute⁃on⁃chronic liver failure，ACLF）是指在慢性肝病基础上，由各种诱因引起的以急性黄疸加深、凝血功能障碍等肝衰竭表现的综合征，死亡率高达50%^［1，2］。肝细胞大量死亡及其促发的炎症反应是ACLF的关键病理生理事件，目前已知包括坏死、凋亡、焦亡、坏死性凋亡等多达10余种细胞死亡方式^［3，4］，其相互间的交互对话及其与炎症的关联尚未阐明。

细胞焦亡（pyroptosis）是一种促炎形式的程序性细胞死亡，其发生过程中伴有依赖于caspase⁃1介导的经典通路和caspase⁃11介导的非经典通路，最终激活焦亡底物Gasdermin D（GSDMD）使其切割为31 kD⁃N端（GSDMD⁃N）和22 kD⁃C端（GSDMD⁃C）片段^［5］，其中活性N末端片段在细胞膜表面聚集形成孔道，继而导致质膜的通透性增加、细胞肿胀和溶解，并释放大量促炎因子，如IL⁃18、IL⁃1β等，造成肝细胞溶解性死亡^［6］。坏死性凋亡（necroptosis）是近年新发现的一种程序性细胞坏死模式，由受体相互作用蛋白酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）、受体相互作用蛋白酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain⁃like protein，MLKL）介导^［7］，最终导致效应分子MLKL的磷酸化，进而诱导其构象变化，导致MLKL转移并破坏质膜的完整性，释放IL⁃33、IL⁃1α等促炎因子，造成细胞裂解^［8］。近年研究发现，细胞焦亡与坏死性凋亡均与炎症反应密切相关，在肝纤维化、酒精性脂肪肝、缺血再灌注肝损伤、肝癌等多种肝脏疾病的发生\发展中发挥重要作用^［9，10］。但两种细胞死亡方式在ACLF中作用机制及其相互间的联系尚不明确。因此，本研究在生物信息学分析基础上，采用四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl₄）联合肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae，K.P.）构建GSDMD基因敲除小鼠ACLF模型^［13］，探讨GSDMD基因敲除对ACLF小鼠肝组织坏死性凋亡通路RIPK1、RIPK3、MLKL、p⁃MLKL表达的影响。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）下载GSE139602数据集，该数据集包括健康对照（Healthy）、早期慢性肝病（eCLD）、肝硬化代偿期（Compensated cirrhosis）、肝硬化失代偿期（Decompensated cirrhosis）及慢加急性肝衰竭（ACLF）患者肝活检基因转录组数据，其ACLF患者符合欧洲肝病学会（EASL）诊断标准，可用于分析焦亡以及坏死性凋亡等通路的相关差异表达基因，使用RStudio（R4.4.1）对标准化后的基因表达矩阵进行数据分析，从GSEA数据库下载相关通路基因集并进行通路富集评分以及绘制小提琴图，从而显示不同肝病组别之间的通路富集差异，随后对焦亡以及坏死性凋亡通路相关基因绘制热图。通过STRING数据库对GSDMD、MLKL、RIPK1等相关差异基因构建蛋白质⁃蛋白质相互作用（PPI）网络，以及对GSE139602数据集的不同样本绘制散点图，展示GSDMD与坏死性凋亡及其效应蛋白MLKL在ACLF中的相关性，并进行线性拟合。

1.2 动物与菌株

40只雄性野生型C57BL/6J小鼠（SPF级），体质量20~25 g，6~8周龄，购买于斯贝福（北京）生物技术有限公司；GSDMD基因敲除小鼠由北京生命科学研究所邵峰实验室馈赠；所有小鼠在贵州医科大学实验动物中心进行饲养，实验动物生产与使用许可证号均为SYXK（贵）2023⁃0002。本研究方案经由贵州省人民医院伦理委员会审批，审查号：伦审（科研）2022⁃143号。K.P.购自北纳生物（菌种编号：BNCC360627）。

1.3 试剂

CCl₄（麦克林试剂有限公司，批号：C805325）；ALT、AST生化试剂盒（雅酶生物，批号：BC1555、BC1565）；逆转录试剂盒、TB Green^® Premix Ex Taq^™ Ⅱ （Tli RNaseH Plus）试剂（日本 TaKaRa，批号：RR047A、RR820A）；RIPA裂解液、BCA试剂盒、苏木素⁃伊红（H&E）染色试剂盒（北京索莱宝公司，批号：R0010、PC0020、G1120）； RIPK1、p⁃MLKL、NLRP3、Caspase⁃11、GSDMD、IL⁃18、IL⁃1β一抗（英国 Abcam，批号：ab263899、ab180673、 ab219800、ab191860、ab283818）；RIPK3、MLKL一抗（Proteintech，批号：17563⁃1⁃AP、66675⁃1⁃Ig）；Caspase⁃1一抗（华安生物，批号：ET1608⁃69）；ECL超敏发光液（大连美仑生物公司，批号：MA0186⁃1）。

1.4 仪器

电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY⁃7C）；电泳槽、转膜仪（北京东方瑞利，型号：2037443753、1002808065）；一体式化学发光成像仪（上海勤翔，型号：Chemiscope）；实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司，型号：CFX96Toch）。

1.5 菌株复苏及培养

肺炎克雷伯菌冻干粉管加入0.5 mL营养肉汁液体培养基，充分混匀后转接至固体培养基上，37 ℃倒置培养18 h；次日挑取典型单菌落转接至液体培养基试管中，37 ℃、180 r/min过夜培养；使用灭菌接种环蘸取菌液于固体培养基中呈“Z”字形涂布，置于37 ℃培养，待观察到有连成线的单个菌落时，用棉签蘸取细菌菌落收集入生理盐水中，梯度稀释后测定菌液浓度，用生理盐水稀释到5×10⁴ CFU/mL备用。菌株形态：菌落直径为1~2 mm，圆形，边缘整齐，不透明，正面黄色，颜色较浅，中间凸起，表面明亮，表面光滑，质地湿润，易挑起。

1.6 构建ACLF小鼠模型

40只野生型雄性C57BL/6J小鼠采用随机数字法分为正常（Control）组、4周 CCl₄（4 w CCl₄）组、8周 CCl₄（8 w CCl₄）组、ACLF模型（8 w CCl₄+Acute insult+K.P.，ACLF）组。正常组腹腔注射橄榄油作为对照；4 w CCl₄组小鼠腹腔注射5 mL/kg CCl₄（溶于橄榄油，CCl₄：橄榄油=1∶9，v/v），2次/周，连续4周；8 w CCl₄组小鼠腹腔注射5 mL/kg CCl₄，2次/周，连续8周；ACLF模型组：小鼠腹腔注射5 mL/kg CCl₄，2次/周，连续8周，第8周末腹腔注射双倍剂量CCl₄ 10 mL/kg，24 h后腹腔注射K.P. 1 000 CFU/只。12只GSDMD基因敲除C57BL/6J小鼠随机分为正常组及ACLF组，造模方式同野生型小鼠。造模结束后各组小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，眼球取血，脱颈处死，取肝组织样本进行后续实验。

1.7 肝组织病理学观察

在肝右叶同一位置留取部分组织，置入4%中性甲醛缓冲液中固定，用于H&E病理检测。

1.8 炎性细胞因子检测

酶联免疫吸附法检测小鼠血清中IL⁃33、IL⁃1α水平。

1.9 血清生化指标检测

各组小鼠眼球取血后，低温离心法收集上层血清样本，利用生化试剂盒检测小鼠血清内ALT、AST水平。

1.10 实时荧光定量PCR实验

RNA快速提取试剂盒提取总RNA并检测其浓度和纯度。使用逆转录试剂盒对RNA进行逆转录，合成cDNA。以cDNA为模板，采用TB Green法依次按照95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s， 40 Cycles反应条件下进行扩增。结果分析方法为相对定量法，计算方法为2^-△△CT。引物序列信息见表1。

1.11 Western blot实验

称取各组肝组织50 mg加入RIPA裂解液冰上裂解30 min后超声破碎，提取总蛋白，BCA试剂盒测定其浓度。将蛋白样品在10%SDS⁃PAGE凝胶上进行分离后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h。加入RIPK1、MLKL、NLRP3、Caspase⁃1、GSDMD、IL⁃18等一抗4 ℃孵育过夜；二抗室温孵育2 h。ECL发光液进行显影，使用ImageJ软件对各组条带灰度值进行分析，计算目标蛋白与内参蛋白灰度值比值作为该蛋白相对表达量。

1.12 免疫荧光实验

将石蜡切片置于60 ℃烘烤1.5 h，二甲苯透明2次，每次20 min；无水乙醇5 min 2次，95%乙醇10 min 1次， 85%乙醇10 min 1 次，75%乙醇10 min 1次，双蒸水5 min 1次；Tris⁃EDTA抗原修复；10%山羊血清封闭60 min；使用GSDMD、MLKL一抗4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次；荧光二抗避光室温孵育1 h，PBS洗涤3次；DAPI染核，避光8 min；PBS洗涤3次；抗荧光淬灭封片剂封片后荧光显微镜下观察拍照，ImageJ软件计算荧光强度。

1.13 统计学处理

采用 Graphpad prism9.0.0软件进行统计分析。计量资料以\overline{x}\pm s表示，Levene检验判断方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD⁃t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 焦亡、坏死性凋亡通路相关基因在不同慢性肝病中的表达

与健康对照组相比，早期慢性肝病、肝硬化代偿/失代偿期及ACLF患者焦亡与坏死性凋亡通路富集分数逐渐增加，ACLF最为明显（P<0.05）（图1A）；焦亡、坏死性凋亡相关基因在不同程度慢性肝病中具有差异性表达，其中ACLF患者中焦亡执行蛋白GSDMD与坏死性凋亡关键蛋白RIPK1、RIPK3、MLKL的表达较健康对照组上调最为明显（图1B）；焦亡执行蛋白GSDMD与坏死性凋亡通路及其效应分子MLKL在ACLF中呈正相关（P<0.05）（图1C）。

2.2 ACLF小鼠血清ALT、AST、IL⁃33、IL⁃1α表达水平及肝组织病理学变化

与正常组相比，4 w、8 w CCl₄及ACLF模型组小鼠ALT、AST水平均升高（P<0.01），以ACLF模型组最为明显；4 w、8 w CCl₄组小鼠血清IL⁃33、IL⁃1α水平差异均无统计学意义（P>0.05），ACLF模型组小鼠血清IL⁃33、IL⁃1α水平明显升高（P<0.001）（图2A）。肝脏病理H&E染色示，正常组小鼠肝细胞浆均匀红染，细胞核大小正常，肝窦清晰可见，肝索排列整齐，肝小叶结构完整；4 w CCl₄小鼠肝细胞见少许纤维组织增生，少量炎性细胞浸润；8 w CCl₄小鼠肝细胞大量纤维组织沉积，形成明显的纤维间隔；ACLF模型组小鼠肝细胞无序、大面积坏死，细胞核崩解，肝小叶支架结构塌陷，汇管区及周围广泛炎症细胞浸润（图2B）。免疫荧光示ACLF组小鼠肝细胞GSDMD、MLKL阳性染色面积比明显增加（P<0.001）（图2C）。

2.3 ACLF小鼠肝组织焦亡、坏死性凋亡相关蛋白表达水平

Western blot结果显示，与正常组相比，4 w CCl₄小鼠肝组织中NLRP3、Caspase⁃1、Caspase⁃11、GSDMD⁃FL蛋白表达均上调（P<0.05），GSDMD⁃N、IL⁃18和IL⁃1β蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；8 w CCl₄、ACLF模型组小鼠肝组织中NLRP3、Caspase⁃1、Caspase⁃11、IL⁃18和IL⁃1β蛋白表达水平较正常组均上调（P<0.01）、焦亡执行蛋白GSDMD的全长及N端（GSDMD⁃FL/N）蛋白表达水平均明显上调（P<0.001），以ACLF组上调更为明显（图3A）。4 w CCl₄、8 w CCl₄及ACLF模型组小鼠肝组织中RIPK1、RIPK3、MLKL、p⁃MLKL蛋白表达水平较正常组均上调（P<0.001），以ACLF组最为明显（图3B）。

2.4 GSDMD基因敲除对ACLF小鼠血清ALT、AST、IL⁃33、IL⁃1α水平和肝组织病理学及生存时间的影响

与野生型ACLF组相比，GSDMD基因敲除ACLF组小鼠血清ALT、AST、IL⁃33、IL⁃1α水平均明显降低（P<0.05）（图4A）；生存时间延长（图4B）；H&E染色示GSDMD基因敲除ACLF组增生纤维组织较野生型ACLF组减少，肝细胞少量坏死，部分有炎症细胞浸润（图4C）。

2.5 GSDMD基因敲除对ACLF小鼠肝组织中焦亡、坏死性凋亡关键基因mRNA及蛋白表达水平的影响

实时荧光定量PCR结果显示，与野生型ACLF组相比，GSDMD基因敲除ACLF组小鼠肝组织GSDMD mRNA表达水平明显下调，基本趋于0（P<0.000 1）；RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表达水平均明显下调（P<0.001）（图5A）。Western blot结果显示，与野生型ACLF组相比，GSDMD基因敲除ACLF组肝组织GSDMD⁃FL/N蛋白几乎无表达（P<0.000 1）；NLRP3、Caspase⁃1、Caspase⁃11、IL⁃18、IL⁃1β蛋白表达均明显下调（P<0.01）（图5B）；RIPK1、RIPK3、MLKL、p⁃MLKL蛋白表达均明显下调（P<0.05）（图5C）。

2.6 GSDMD基因敲除对ACLF小鼠肝细胞中MLKL免疫荧光表达的影响

免疫荧光示，与野生型ACLF组相比，GSDMD基因敲除ACLF组小鼠肝细胞GSDMD阳性染色面积明显减少，几乎趋于0（P<0.000 1）（图6A）； MLKL阳性染色面积明显减少（P<0.001）（图6B）。

3 讨论

ACLF是指在慢性肝病基础上，短期内出现肝功能急性失代偿的临床综合征，进展迅速，病情凶险，短期死亡率较高^［11］。ACLF发病机制复杂，目前针对其机制研究提示大量肝细胞死亡引发的全身严重炎症反应和细菌感染在ACLF病程进展中极为关键^［12］，坏死的肝细胞释放大量损伤相关模式分子（damage⁃associated molecular patterns，DAMP）进入全身循环，激活免疫系统，释放大量细胞因子，如TNF、IL⁃1β、IL⁃18等，产生“细胞因子风暴”，激发全身炎症反应，同时肝细胞损伤释放的DAMP又会加剧这种机体反应，造成过度的炎症反应，引发肝细胞损伤、坏死及肝外器官损伤^［2］。根据ACLF目前的发病机制特点可将大部分患者的临床病程分为3个核心阶段：（1）长期慢性肝损伤；（2）急性肝损伤；（3）细菌感染及全身炎症反应与肝外器官损伤。近年来有研究采用CCl₄联合K.P. 3阶段造模法诱导细菌感染成功构建了一种严重肝损伤的ACLF小鼠模型，更完整地模拟了ACLF的临床特征及病程中易出现的肝外脏器损伤，如肾功能损伤甚至多器官功能衰竭，为ACLF的相关机制研究提供了可靠的动物模型^{［13，14］}。

细胞焦亡是由Gasdermin家族蛋白介导的细胞程序性死亡形式，作为一种先天免疫反应，可由各种因素激活炎性小体，诱导Caspase⁃1或Caspase⁃4/5/11的成熟，裂解 Gasdermin D以释放其N末端结构域结合膜脂质并穿孔细胞膜，导致细胞渗透压发生变化并逐渐肿胀，直至细胞膜破裂^［15］，驱动炎症细胞因子（如IL⁃1β和IL⁃18）的成熟和释放^［16］。近年研究表明，肝纤维化、酒精性肝炎、药物性肝损伤及各种肝衰竭等多种肝脏疾病的发展与细胞焦亡有关^［17］。本课题组前期证明了GSDMD介导的肝细胞焦亡是急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）时肝细胞死亡及继发炎症风暴的重要机制之一，敲减或敲除GSDMD抑制焦亡可明显减少ALF肝细胞死亡、减轻肝脏炎症反应从而提高小鼠生存率^［18］。Bai等^［19］发现半乳糖凝集素⁃3（GAL3）通过抑制细胞焦亡信号传导对ACLF肝损伤发挥保护作用。Hou等^［20］研究表明，高水平的高迁移率族box1（HMGB1）可触发Caspase⁃1依赖性焦亡通路，加重ACLF的炎症反应和病理损伤，而抑制HMGB1和Caspase⁃1可改善ACLF，双重抑制作用更强。此外，在最近的欧洲肝脏研究学会（EASL）上彭亮教授团队揭示了在ACLF中肝细胞发生焦亡释放的IL⁃1β可激活IL1R1/MyD88/TBK1通路加剧ACLF肝脏损伤。因此，通过调控细胞焦亡信号通路可能是未来治疗ACLF潜在靶点之一。

坏死性凋亡是由受RIPK1/3及下游效应蛋白MLKL介导的新型程序性细胞死亡^［21］。在细胞应激等条件下，Caspase⁃8的活性被抑制，导致RIPK1和RIPK3之间一系列的自动和交叉磷酸化，RIPK3的磷酸化导致效应蛋白MLKL的募集和磷酸化，并转移到质膜形成孔复合物，细胞膜破裂后细胞内容物溢出进入器官，导致炎症表型的出现和损伤相关分子模式（DAMP）的释放，如IL⁃1α和IL⁃33等^［8］。坏死性凋亡是炎症的触发因素，对结直肠癌、乳腺癌等不同癌症的预后有一定的影响，在各种肝脏疾病的发生机制中也有一定的关联性^{［22，23］}。Kondo等^［24］发现RIPK3循环水平升高与ACLF患者的严重程度和短期死亡率密切相关；使用RIPK1特异性抑制剂NEC⁃1和RIPA56可通过抑制坏死性凋亡通路减轻ACLF的肝损伤。Wang等^［25］通过阻断ACLF大鼠模型中RIPK1/RIPK3复合物的形成抑制肝细胞坏死性凋亡，缓解线粒体功能障碍，减轻肝细胞死亡。说明坏死性凋亡与肝损伤、ACLF关系密切，但具体作用机制尚未完全阐明。

细胞焦亡类似于坏死性凋亡，因为这两种形式的PCD都会导致快速渗透和潜在免疫刺激性DAMP的释放，并与细胞因子信号的释放相结合，两者之间又具有相同的溶解性和潜在的炎症形态，导致两者之间既存在差异也存在机制交叉。本研究首先基于生物信息学分析发现焦亡与坏死性凋亡通路关键基因在ACLF中高表达，随后通过STRING网站分析了焦亡与坏死性凋亡关键蛋白可能存在互作关系，且焦亡执行蛋白GSDMD与坏死性凋亡及其效应蛋白MLKL在ACLF中呈正相关（P<0.05），说明焦亡与坏死性凋亡在ACLF的发生机制中可能存在交互作用。接下来采用CCl₄联合K.P.建立了野生型及GSDMD基因敲除ACLF小鼠模型，结果显示：野生型ACLF模型组小鼠肝细胞无序和大块/亚大块坏死，伴有大量浸润的炎症细胞、明显的肝窦扩张和出血；肝组织焦亡及坏死性凋亡相关蛋白GSDMD、MLKL、p⁃MLKL等表达较正常对照组均明显上调（P<0.01）。然而，与野生型ACLF组相比，GSDMD基因敲除ACLF组小鼠生存时间延长；血清ALT、AST、IL⁃33、IL⁃1α水平降低（P<0.05）；H&E染色示增生纤维组织较野生型ACLF组减少，肝细胞少量坏死，部分有炎症细胞浸润；肝组织焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase⁃1、Caspase⁃11、IL⁃18、IL⁃1β表达均明显下调（P<0.01）；坏死性凋亡相关蛋白RIPK1、RIPK3、MLKL、p⁃MLKL表达均明显下调（P<0.05）；肝细胞MLKL免疫荧光强度明显减少（P<0.001）。综上，本研究表明了细胞焦亡与坏死性凋亡是ACLF的两种重要细胞死亡方式且可能存在关联，通过敲除焦亡执行蛋白GSDMD可在基因及蛋白层面明显下调RIPK1、RIPK3、MLKL及p⁃MLKL的表达，抑制坏死性凋亡通路，减少IL⁃33、IL⁃1α等炎性因子的释放，减轻肝细胞炎症反应，减少ACLF小鼠模型的肝细胞死亡，但其进一步互作机制尚有待明晰，未来的研究可以在细胞层面更深入地验证GSDMD与坏死性凋亡在ACLF中的互相作用机制并进一步寻找新的干预靶点，以便更好地指导临床。

作者贡献度说明：

刘渝洪：负责完成实验并撰写文章；李成成、王路：负责资料分析；彭虹：参与修改论文；李宏：负责课题设计、指导撰写文章并最后定稿。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82060123)