姜黄素通过靶向FoxO3A在骨肉瘤中发挥抗癌作用

Curcumin targets FoxO3A for anti‑cancer effects in osteosarcoma

摘要

目的 探讨姜黄素是否可以通过靶向激活FoxO3A对骨肿瘤发挥抑癌作用。 方法 使用分子对接方法检测姜黄素与FoxO3A具有亲和的空间结合区域。采用10 μmol/L、15 μmol/L的姜黄素处理143B细胞48 h后收集细胞。首先，使用实时qPCR、Western blot检测姜黄素处理前后FoxO3A mRNA水平以及蛋白表达量。通过免疫荧光染色使用经典增殖标记物Ki67检测不同浓度姜黄素处理对143B细胞增殖能力的影响。同时通过实时qPCR检测GADD45A、CCNB1、CDK2、CDK1等细胞周期标志物的mRNA转录水平。使用细胞划痕实验以及Transwell检测姜黄素对143B细胞迁移和侵袭的影响，并使用TUNEL染色法以及Western blot检测143B细胞的凋亡情况。 结果 在143B细胞中，姜黄素可以以浓度依赖性的方式激活FoxO3A表达；与对照相比，姜黄素处理能够显著抑制143B细胞的增殖能力以及侵袭能力诱导肿瘤细胞凋亡，并且呈现剂量依赖性。实时qPCR和Western blot实验表明姜黄素可以通过靶向激活FoxO3A表达并且影响其关键下游因子表达水平如GADD45A、CCNB1、CDK2、CDK1、Caspase‑3、Bcl‑2来发挥抗骨肉瘤活性作用。 结论 姜黄素可能通过靶向激活FoxO3A表达抑制143B细胞的迁移和增殖能力并且促进其凋亡在骨肉瘤中发挥抗肿瘤作用。

Abstract

Objective To investigate whether curcumin can exert oncogenic effects on bone tumors by targeting and activating FoxO3A. Methods Curcumin was detected to have an affinity spatial binding region with FoxO3A using molecular docking method.143B cells were treated with 10 μmol/L and 15 μmol/L curcumin for 48 hours and then the cells were collected. First， FoxO3A mRNA levels as well as protein expression were detected before and after curcumin treatment using real‑time qPCR and Western blot. The effect of different concentrations of curcumin treatment on the proliferative ability of 143B cells was detected by immunofluorescence staining using the classical proliferation marker Ki67. The mRNA transcript levels of cell cycle markers such as GADD45A， CCNB1， CDK2 and CDK1 were also detected by real‑time qPCR. The effects of curcumin on migration and invasion of 143B cells were detected using cell scratch assay as well as Transwell， and apoptosis of 143B cells was detected using TUNEL staining assay as well as Western blot. Results In 143B cells， curcumin could activate FoxO3A expression in a concentration‑dependent manner； compared with the control， curcumin treatment significantly inhibited the proliferative and invasive ability of 143B cells to induce apoptosis in a dose‑dependent manner. Real‑time qPCR and Western blot experiments showed that curcumin could exert anti‑osteosarcoma activity by targeting and activating FoxO3A expression and affecting the expression levels of its key downstream factors， such as GADD45A， CCNB1， CDK2， CDK1， Caspase‑3 and Bcl‑2. Conclusion Curcumin may play an anti‑tumor role in osteosarcoma by targeting and activating the expression of FoxO3A， inhibiting the migration and proliferation of 143B cells， and promoting their apoptosis.

Graphical abstract

关键词

姜黄素 / 骨肉瘤 / FoxO3A / 凋亡 / 抗癌作用

Key words

Curcumin / Osteosarcoma / FoxO3A / Apoptosis / Anti‑cancer effect

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种高发的原发性恶性骨肿瘤，占所有骨肿瘤的约1/5，由于其肿瘤微环境的复杂性和化疗的耐药性，使其治疗面临许多瓶颈^［1］。虽然目前手术切除加多药联合化疗（如顺铂、甲氨蝶呤）的治疗策略显著改善了患者的生存期。但OS手术完全切除的复杂性和常规化疗药物容易引发骨髓抑制、心肾毒性等全身多系统毒副作用的问题仍困扰着OS的治疗发展。且由于OS特殊的发病年龄（多见于儿童及青少年，约占儿童肿瘤的5%），化疗往往会影响患者骨骼和身体的发育^［2］。因此，传统化疗药物的耐药性和毒性使得寻找新型治疗药物成为必要并且迫切需要探索新的药物靶点，以提高治疗方案的有效性并减少副作用。

姜黄素是一种具有广泛药理作用的姜黄主要生物活性成分。人们已广泛研究其抗炎、抗氧化和抗癌特性^［3］。姜黄素调节与细胞生长、存活和凋亡相关的各种信号通路，使其成为癌症治疗的有吸引力的候选药物^［4］。此外，姜黄素的毒性极小，这进一步增强了其作为骨肿瘤治疗剂的潜力。目前研究表明，姜黄素可以在体内和体外对多种恶性肿瘤具有强大的抗肿瘤活性，包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和OS等^［5‑8］。已知姜黄素靶向多种生化途径，包括NF‑κB、AKT、JAK/STAT、Wnt/β‑catenin途径和生长因子受体等^［9‑11］。但姜黄素如何发挥其对OS抗肿瘤活性的确切机制尚未确定。需要更好地表征姜黄素与骨肿瘤中其他分子信号网络之间的相互作用，以优化其治疗潜力。

FoxO3A具有肿瘤抑制功能，在正常情况下其参与诱导细胞凋亡，以应对细胞应激、DNA损伤和氧化应激。它还调节细胞周期检查点并抑制过度细胞增殖，这对于维持细胞稳态和防止癌变生长至关重要^［12］。在多种癌症类型中，FoxO3A通路常因翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化）或异常信号传导受阻，导致肿瘤细胞的存活、增殖增强，并对化疗产生抗性^{［13，14］}。因此，恢复或增强FoxO3A在癌细胞中的活性可能成为一种潜在的治疗手段。研究表明，姜黄素能够激活FoxO3A并诱导乳腺癌、前列腺癌、肺癌及神经胶质瘤等多种癌细胞发生凋亡^{［15‑20］}。然而，姜黄素在骨肿瘤中的抗癌机制，特别是其对FoxO3A活性的调控作用，仍有待进一步探讨。基于此，本研究采用不同浓度的姜黄素处理OS143B细胞系，以分析其对 FoxO3A 蛋白的激活作用及对肿瘤细胞的影响，从而为姜黄素在OS治疗中的应用提供新的思路

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞的培养与处理

本研究使用的143B OS细胞系购自中国科学院细胞库（位于中国上海）。143B OS细胞系在高葡萄糖DMEM培养基中培养，培养基中含10%胎牛血清（FBS）。培养条件在细胞培养箱内维持，以确保最佳的生长环境，包括恒定的37 ℃温度、5%CO₂浓度、pH值维持在7.2~7.4之间，以及95%的高相对湿度。姜黄素组处理过程如下：首先，将143B细胞以每孔1×10⁴个的密度接种于96孔板中，在5% CO₂、37 °C条件下孵育过夜以促进贴壁。随后，用DMSO溶解姜黄素（购自Sigma‑Aldrich，表1）。选择不同浓度的姜黄素与143B细胞共同孵育48 h。对照组使用含有DMSO的DMEM培养基培养。之后使用标准的WST‑8（CCK8）测定法评估不同浓度姜黄素对143B细胞增殖的抑制效果。

1.1.2 试剂材料

所用试剂及材料见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 分子对接

受体蛋白为FOXO3A（PDB ID：2UZK）蛋白，由PDB数据库下载得到蛋白3D结构文件。使用PyMOL 2.5.4软件检查蛋白质结构以备对接所用。配体小分子为Curcumin，其3D结构文件由InDraw分子结构建模工具绘制并使用OpenBabel3.1.1软件的MMFF94力场对小分子结构进行优化，最终获得能量最低状态的最优分子结构。使用 AutoDock Tools 1.5.6对蛋白质和小分子进行加氢处理，并运行AutoDock Vina 1.2.0进行分子对接，获得结合自由能及对接结果文件。

1.2.2 免疫荧光染色

首先，去除培养基后，使用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔清洗143B OS细胞3次，每次5 min。随后，在CLSM培养皿中加入4%多聚甲醛固定液，于室温固定10~20 min。接着，用含Triton X‑100的磷酸盐缓冲液（PBST）冲洗3次，每次5 min。固定后，采用5%FBS于室温封闭1 h。按照抗体说明书，将Ki67抗体（武汉三鹰，China）按推荐浓度稀释后，加入细胞样本，并在4 ℃过夜孵育。孵育完成后，再次用PBST清洗3次，每次5 min。随后，按说明书推荐比例稀释二抗，避光操作，并于室温孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次5 min。最后，加入含DAPI的抗荧光淬灭剂进行核染色，并使用激光扫描共聚焦显微镜（Nikon A1+R‑980）采集荧光图像。

1.2.3 划痕实验

将处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，并以每孔 1×10⁵个细胞的密度接种于6孔培养板中，培养24 h。次日，使用200 μL移液枪头垂直划痕于培养皿底部，并以PBS清洗3次，去除脱落细胞后更换新鲜培养基。在4倍显微镜下拍摄图像，确保划痕位于视野中央且垂直于观察方向。随后，加入待测样品，设定不同浓度梯度，并定期取样拍照记录。

1.2.4 TUNEL测定

将143B OS细胞接种于CLSM培养皿（3×10⁵个细胞/孔），并过夜贴壁，孵育及处理条件同上。PBS中洗涤后，根据制造商提供的方案，使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（YEASEN，China）对细胞进行染色，并使用Hochest进行核染色。最后使用激光扫描共聚焦显微镜（Nikon A1+R‑980）下对TUNEL阳性细胞进行拍照。

1.2.5 Transwell侵袭检测

将细胞接种于无血清的Matrigel上室中，以进行侵袭性评估。在上室的200 μL无血清DMEM中加入适量的预先饥饿处理的143B细胞，下室则加入含有10% FBS的DMEM完全培养基。在不同的处理条件下孵育48 h。取下上室并用4%多聚甲醛固定30 min，随后用0.1%结晶紫染色。之后，清除上层室中的细胞，在倒置显微镜（OLYMPUS，CKX53）下对底部的细胞进行观察、摄影和计数。

1.2.6 Western blot 分析

在冰上使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液处理细胞。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并将等量总蛋白上样至凝胶，通过SDS‑PAGE进行电泳分离。随后，完成蛋白转膜后，于室温条件下以5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白封闭。然后将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜，洗涤后与二抗（1∶5 000）孵育1 h。使用ECL试剂盒检测印迹，并使用成像系统（BIO‑RAD，ChemiDocMP）拍照。使用ImageJ软件分析、定量。FoxO3A抗体购自武汉三鹰（China），Cleaved caspase‑3抗体购自Affinity Biosciences（USA），Bcl‑2抗体购自Abcam（UK）。

1.2.7 实时荧光定量PCR（Quantitative Real‑time PCR， qPCR）

对经过多种条件处理的143B细胞，使用TRIzol试剂（Takara，Japan）进行总RNA提取，然后按照制造商的说明使用PrimeScript RT试剂盒（Takara）合成cDNA。使用SYBR PrimeScript qPCR试剂盒（Takara）进行定量分析。将表达结果标准化至Gapdh水平，并通过2^‑ΔΔCt方法计算mRNA的表达量。所有的qPCR扩增均进行了3次重复，并在3个独立的实验中进行了验证。本研究中所使用的引物详细信息见表2。

1.3 统计学处理

所有数据均作为从至少3项独立试验中获得的（\overline{x}\pm s）进行分析，并使用GraphPad Prism 8.0 版（GraphPad）绘图。通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验确定统计差异，并在适当的情况下使用多重比较进行双向方差分析和Tukey检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素靶向FoxO3A的分子预测

研究表明，姜黄素可通过靶向FoxO3A 介导癌细胞的抗增殖作用^［21］。为验证其对FoxO3A的靶向性，本研究首先进行了分子对接分析。通常，结合能低于0 kcal/mol表明受体与配体可自发结合，而低于-5 kcal/mol则意味着较强的结合亲和力。本次对接结果显示，姜黄素与FoxO3A的结合能为-6.2 kcal/mol，低于-5 kcal/mol，表明二者具有良好的结合亲和性，结合作用显著。最终，利用PyMOL 2.5.4对对接结果进行可视化分析，如下图所示。

图中可见，姜黄素与FoxO3A蛋白中的氨基酸残基ALA‑169和ARG‑177形成了两条氢键相互作用（绿色虚线），并与SER‑173、PRO‑174、LEU‑178形成了三条疏水相互作用（粉色虚线），且结合能低于-5 kcal/mol，说明姜黄素与FoxO3A蛋白之间的结合程度很好，很可能对FoxO3A蛋白的结构功能与生物活性产生影响。

2.2 姜黄素处理对143B细胞毒性测定

为了研究姜黄素靶向激活FoxO3A后对143B OS细胞的作用。在初始实验中，采用标准WST‑8（CCK8）测定法评估姜黄素对143B的细胞毒作用。结果表明，姜黄素以剂量依赖性方式对143B OS造成杀伤（图2A）。为了确定后续研究的最佳（有效但无过量细胞毒作用）剂量范围（图2B）。计算出在48 h能够抑制50%细胞增殖（IC₅₀）的药物的浓度为23.43±1.36。同时结合以往研究报道，最终选用10 μmol/L、15 μmol/L浓度的姜黄素进行后续研究^［22］。

2.3 姜黄素可以靶向激活FoxO3A表达

为了进一步研究143B细胞中，姜黄素治疗后FoxO3A表达的变化情况。使用实时qPCR分析评估FoxO3A在姜黄素浓度递增处理48 h的143B细胞中的表达。与对照组相比，姜黄素处理后FoxO3A mRNA水平显著增高（P<0.05），表明姜黄素靶向激活了OS细胞中FoxO3A的表达（图3A）。与实时qPCR数据一致（表2），Western blot显示，用姜黄素处理的143B细胞中FoxO3A蛋白水平同样以剂量依赖性方式上调（图3B）。实验得出结论，在143B细胞中姜黄素可以显著激活FoxO3A基因的转录和翻译。

2.4 姜黄素通过靶向FoxO3A抑制143B细胞增殖

据报道FOXO通路激活后通常表现为凋亡诱导和细胞周期抑制。为了确认姜黄素激活FoxO3A后对OS细胞的作用，首先通过免疫荧光检测增殖经典标志物Ki67在不同浓度姜黄素处理后的表达情况。结果显示，随着姜黄素浓度增高，143B细胞的增殖被显著抑制（图4）。

随后为了进一步验证分子水平中细胞周期的抑制情况。使用实时qPCR分析评估了FoxO3A激活后细胞周期相关基因的变化情况。与预期的结果一致，如图5所示，在姜黄素处理组细胞周期蛋白B1（CCNB1）、细胞周期依赖性激酶1（CDK1）和细胞周期依赖性激酶2（CDK2）的表达均有所下降，15 μmol/L浓度组尤为明显（P<0.05）（图5）。这表明姜黄素诱导FoxO3A激活后可以显著抑制细胞周期。

2.5 姜黄素通过靶向FoxO3A诱导143B细胞凋亡

为验证FoxO3A激活是否能诱导肿瘤细胞凋亡，本研究采用TUNEL（TdT‑mediated dUTP Nick‑End Labeling）实验检测姜黄素对143B细胞的影响。结果显示，与对照组相比，姜黄素处理显著促进了143B细胞凋亡。此外，15 μmol/L姜黄素组的凋亡率明显高于10 μmol/L组（P<0.05），表明姜黄素在促进细胞凋亡方面呈剂量依赖性（图6）。

前面的结果显示，姜黄素靶向激活FoxO3A后显著诱导了143B OS细胞的凋亡（P<0.05）。于是进一步在蛋白水平检测凋亡的发生情况。通过Western blot分析发现，在姜黄素处理后调节细胞凋亡的关键蛋白caspase‑3的蛋白表达水平明显升高，并且抗凋亡蛋白Bcl‑2的蛋白水平显著降低，证明姜黄素可以通过靶向FoxO3A通路发挥抗OS活性作用（图7）。

2.6 姜黄素通过靶向FoxO3A抑制143B细胞的侵袭和迁移能力

为了进一步确认FoxO3A激活是否能抑制肿瘤细胞的转移，本研究使用10 μmol/L和15 μmol/L姜黄素处理143B OS细胞48 h。结果表明，与对照组相比，姜黄素显著降低了143B细胞的迁移能力（P<0.05），且15 μmol/L组抑制效果更明显，呈现剂量依赖性（图8）。

此外，本研究还进行了体外侵袭试验（transwell），以评估姜黄素对细胞侵袭能力的影响。结果表明，经过10 μmol/L和15 μmol/L姜黄素处理48 h后，OS细胞的侵袭性同样有所降低（图9）。

3 讨论

FoxO3A作为细胞凋亡的上游调控因子其表达量的降低往往与肿瘤的耐药及发生、进展成正相关^［23］。姜黄素作为一种从姜黄根茎中提取的天然多酚类化合物，研究发现其可通过多种程序性细胞死亡途径发挥其类似抗癌剂的作用，途径包括细胞凋亡、自噬、焦亡和铁死亡等，对癌症治疗具有重要意义^［24］。本研究通过分子对接预测发现，姜黄素可能靶向激活FoxO3A的表达，故对其在细胞周期调控及细胞凋亡过程中所发挥的关键作用进行了探讨。首先证实了姜黄素能够以剂量依赖性的方式，通过靶向激活FoxO3A从而显著抑制143B OS细胞的增殖，并导致细胞周期停滞。该效应通过免疫荧光技术和实时qPCR分析得到了确认。随后进一步验证了姜黄素激活FoxO3A后143B OS细胞的死亡方式。通过免疫荧光、实时qPCR和Western blot技术，检测到TUNEL表达的增加以及caspase‑3的上调和Bcl‑2的抑制，这表明肿瘤细胞发生了凋亡。最终，通过体外侵袭实验证实姜黄素通过靶向作用于FoxO3A，能够有效抑制OS细胞的侵袭行为。

FoxO3A作为潜在的肿瘤抑制因子，在细胞存活、增殖、代谢、凋亡以及应激反应等多种生物学过程中发挥着关键作用。然而，在结直肠癌、乳腺癌和OS等疾病中，FoxO3A常常呈现出失活状态^［25］。进一步的研究揭示，FoxO3A的失活与癌症细胞对化疗药物的耐药性存在相关性^［26］。例如，在乳腺癌中，通过miR‑221‑3p下调FoxO3A表达，可导致乳腺癌细胞对阿霉素产生耐药性^［27］。在急性白血病的研究中，白血病细胞对强的松诱导的TRAIL和NOXA基因介导的凋亡耐药性，亦与FoxO3A的失活相关^［28］。FoxO3A的核易位被认为是其肿瘤抑制功能丧失的主要原因。据报道，当卵巢癌中NEK6通过磷酸化阻止FoxO3A转入细胞核时，卵巢癌的耐药性将增高^［29］。因此，靶向激活FoxO3A可能在治疗和预防OS耐药方面具有重要的临床应用价值^［30］。此外，研究表明，FoxO基因的失调通常涉及不同的下游靶点（如e‑钙黏蛋白、p21和p27）在肿瘤发生中的作用^［31］。FoxO3A的过表达可导致凋亡激活因子Bax和Bim的上调^［32］。Cha等^［33］的研究指出，敲除FoxO3A后，抗凋亡蛋白Bcl‑2的水平上升，而促凋亡蛋白caspase‑3的表达降低。进一步的研究显示，FoxO3A可直接调控caspase‑3的激活，通过上调促凋亡蛋白促进线粒体外膜通透化（MOMP）、释放细胞色素c并激活caspase级联反应^［34］。这表明FoxO3A的低表达可能导致肿瘤细胞凋亡逃逸并促进耐药性的发展。本研究发现，在姜黄素诱导OS 48 h后，FoxO3A水平显著上升，Bcl‑2蛋白水平以剂量依赖的方式降低，caspase‑3蛋白水平显著升高，这进一步证实了FoxO3A表达的增加在姜黄素介导的细胞凋亡中扮演着关键角色。

综上所述，本研究提供了姜黄素在OS中通过靶向激活FoxO3A发挥抗肿瘤作用的实验性证据。基于本研究结果，笔者提出了一项假设：姜黄素介导的细胞凋亡、增殖及侵袭抑制作用与FoxO3A的靶向激活密切相关。研究揭示，姜黄素能够靶向作用于OS细胞中的FoxO3A，从而发挥其抗肿瘤活性，这为开发新的辅助化疗策略提供了新的视角。鉴于FoxO3A表达降低与多种肿瘤的化疗耐药性相关联，利用姜黄素辅助靶向激活FoxO3A可能成为一种增强耐药性OS细胞对标准治疗敏感性的有效策略。为了进一步验证姜黄素激活的FoxO3A对耐药性OS的治疗效果，以及在FoxO3A完全失活状态下的治疗潜力，仍需进行深入研究。此外，通过动物模型进一步阐明其在体内的疗效也是必要的。

作者贡献度说明：

李济宇：参与课题设计、相关指标检测及论文写作；冯敏：参与课题设计、论文写作及文章审校；吴哲宇：参与论文写作及文章审校；朱昊澄：参与课题设计；孙梓威：参与文章修改；周振华：实验指导；赵剑：实验指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82073266)

国家自然科学基金资助项目(82273471)