DNAJC12介导组蛋白H4K5la调控神经母细胞瘤耐药的机制

Mechanism of DNAJC12‑mediated histone H4K5la in regulating drug resistance in neuroblastoma

摘要

目的 探讨DNAJC12对神经母细胞瘤耐药的影响及潜在的分子机制。 方法 构建神经母细胞瘤DNAJC12基因敲除的SH‑SY5Y细胞，分别用不同浓度的依托泊苷（VP‑16）药物处理野生型对照（ctrl）组和DNAJC12基因敲除（DNAJC12 KO）组的SH‑SY5Y细胞。采用CCK8法检测VP‑16对SH‑SY5Y细胞活力的抑制作用；通过RNA‑seq和ChIP‑seq的联合分析，鉴定DNAJC12敲除后受组蛋白H4K5la修饰调控的差异基因及富集通路。 结果 与对照组细胞相比，DNAJC12敲除后，VP‑16的IC₅₀值从（4.22±2.31） μmol/L上升为（9.42±0.71） μmol/L，组蛋白H4K5la的修饰水平升高。联合分析显示，受H4K5la调控的差异基因富集在氧感知信号通路，其中NOS2基因表达明显上调。NOS2的上调可降低神经母细胞瘤细胞对VP‑16的敏感性。 结论 DNAJC12可调控组蛋白H4K5la的修饰水平，进而通过调控NOS2基因的表达影响神经母细胞瘤对依托泊苷的耐药性。

Abstract

Objective To investigate the effect of DNAJC12 on drug resistance in neuroblastoma and its potential molecular mechanism. Methods DNAJC12 gene knockout SH‑SY5Y cells were constructed. Wild‑type control（ctrl）group and DNAJC12 knockout （DNAJC12 KO group） SH‑SY5Y cells were treated with different concentrations of etoposide （VP‑16）. The inhibitory effect of VP‑16 on the viability of SH‑SY5Y cells were detected by CCK8 assay. Through integrated analysis of RNA‑seq and ChIP‑seq， the differentiated genes regulated by histone H4K5la modification after DNAJC12 knockout were identified， along with their enriched pathways. Results Compared to control cells， after DNAJC12 knockout， the IC₅₀ value of VP‑16 increased from （4.22±2.31） μmol/L to （9.42±0.71） μmol/L， and the modification level of H4K5la was elevated. Integrated analysis showed that the differential genes regulated by H4K5la were enriched in the oxygen sensing pathway， among which the expression of NOS2 gene was significantly upregulated. Upregulation of NOS2 reduced the sensitivity of neuroblastoma cells to VP‑16. Conclusion DNAJC12 can regulate the modification level of histone H4K5la， and thereby affect the resistance of neuroblastoma to etoposide by regulating the expression of NOS2 gene.

Graphical abstract

关键词

神经母细胞瘤 / DNAJC12 / H4K5la / 依托泊苷（VP‑16） / 耐药

Key words

Neuroblastoma / DNAJC12 / H4K5la / Etoposide （VP‑16） / Drug resistance

神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤之一，约占儿童恶性肿瘤的7%，并导致约15%的儿童癌症相关死亡^［1，2］。该疾病具有复杂的发病机制和明显的临床异质性，导致患者的临床预后差异极大^［3］。近年来，随着多药联合化疗方案的广泛应用，部分高危神经母细胞瘤患儿的生存率得到了明显提高。然而，化疗耐药仍然是临床治疗中的主要难题之一，尤其是在复发或难治型病例中，耐药问题严重削弱了化疗药物的疗效并加速疾病的进展^［4，5］。

在神经母细胞瘤的治疗中，依托泊苷（VP‑16）是一种关键的一线化疗药物，通常在多药联合方案中使用^［6］。正如大部分的化疗药物都是通过诱导细胞凋亡来杀死肿瘤细胞一样，VP‑16也是通过抑制拓扑异构酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ）诱导细胞DNA双链断裂（double‑strand breaks，DSBs）引发细胞凋亡来治疗NB^［7］。肿瘤细胞可通过多种机制产生耐药性，包括DNA损伤修复能力的增强、药物外排、凋亡信号通路的抑制以及肿瘤微环境的调控^［8］。其中，缺氧通路被认为在化疗耐药中具有重要作用，通过调节糖酵解的通路介导细胞代谢重编程影响表观遗传修饰和代谢适应性，从而降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性^［5，9］。

DNAJC12蛋白是一种多功能分子伴侣，由DNAJC12基因编码，与热休克蛋白70（HSP70）和核苷酸交换因子一起调节蛋白质的折叠、降解，维持细胞内蛋白质稳定^［10］。最近的研究显示DNAJC12蛋白可以通过多种方式来参与化疗药物耐药，包括激活AKT信号通路来抑制细胞铁死亡和凋亡诱导乳腺癌患者的耐药^［11］，及激发糖酵解通路来引发非小细胞肺癌患者耐药^［12］。然而DNAJC12在神经母细胞瘤中的表达及功能尚未明确，是否通过表观遗传修饰调控缺氧相关的基因改变来参与化疗耐药仍处空白。本研究旨在探讨DNAJC12在神经母细胞瘤化疗耐药中的作用及潜在机制，特别是对VP‑16疗效的影响。通过揭示DNAJC12的功能及其在化疗耐药中的调控作用，本研究将为改善神经母细胞瘤的化疗策略提供新的理论依据和潜在干预靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞系及试剂仪器

人神经母细胞瘤SH‑SY5Y细胞和人胚胎肾上皮细胞HEK293T购自中国科学院上海细胞库， 慢病毒载体lentiCRISPR‑v2质粒（Addgene， #52961），胎牛血清（FBS，Ozfan，WS500T），EMEM（ATCC，30‑2003），F12（Gibco，11765‑054）、DMEM（Cytiva，SH30022.01），CCK8试剂盒（MCE，HY‑K0301），Etoposide（MCE，HY‑13629），Lipo 3000试剂盒（Invitrogen， L300001），Hifair Advance Fast One‑step RT‑gDNA Digestion SuperMix for qPCR试剂盒（Yeason，11151ES10），多功能酶标仪（BioTeK，Synergy HTX）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SH‑SY5Y细胞培养于含有15% FBS的EMEM和F12按体积比1∶1混合的培养基，HEK293T细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中。培养瓶置于37 ℃、含5%的CO₂培养箱中，细胞融合度达80%左右进行传代。

1.2.2 敲除DNAJC12基因（DNAJC12 KO）的细胞构建

为构建DNAJC12基因敲除细胞，首先设计靶向DNAJC12基因的特异性sgRNA序列（表1），将其克隆至改造后的慢病毒载体lentiCRISPR‑v2质粒中。该载体同时表达Cas9蛋白和sgRNA，可实现高效的基因编辑。随后，在HEK293T细胞中进行慢病毒包装。使用Lipo3000脂质体转染试剂盒，将3种质粒（包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G以及重组lentiCRISPR‑v2质粒）共转染至HEK293T细胞。转染后48 h，收集细胞上清液，经0.45 μm滤膜过滤，去除细胞碎片，获得含有靶向DNAJC12的慢病毒溶液。将待感染的靶细胞与上述病毒溶液按1∶1体积比混合，培养6 h后，更换为含15% FBS的完全培养基，继续培养48 h，使慢病毒有效整合至细胞基因组。为筛选成功整合编辑系统的细胞，加入Puromycin进行抗性筛选，重复处理至少3次，以获得稳定表达Cas9和sgRNA的细胞群。筛选后的细胞继续扩增培养，即可得到混合克隆的DNAJC12 KO细胞。为进一步验证敲除效果，采用Trizol法提取细胞总RNA，并使用Hifair Advance Fast One‑step RT‑gDNA Digestion SuperMix for qPCR试剂盒，在一步反应中完成基因组DNA去除和逆转录，获得cDNA。然后通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测DNAJC12基因的mRNA表达水平，以ACTB作为内参基因（引物序列见表2）。计算相对表达量，若与野生型（对照组细胞，ctrl）相比，DNAJC12的mRNA表达明显降低，则表明DNAJC12基因已被成功敲除。至此，获得经qPCR验证的DNAJC12敲除细胞，可用于后续功能研究。

1.2.3 CCK8测药物的IC₅₀

将SH‑SY5Y细胞以5 000个/孔的密度接种到96孔板中，并在培养箱中培养24 h，加入不同浓度（0、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L）的VP‑16药物，处理48 h后，每孔加入20 μL CCK8试剂，使用酶标仪（450 nm）检测吸收值，非线性回归法（nonlinear regression curve fit）计算药物的IC₅₀值。

1.2.4 RNA提取

利用Trizol方法提取细胞的总RNA，并测定RNA浓度。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达量

收集细胞，提取总蛋白后，用1.2×loading buffer煮沸蛋白，用Nanodrop法测定其浓度。取等量的总蛋白进行电泳操作，分离目的蛋白后，用PVDF膜进行转膜操作。5%的脱脂牛奶封闭后，PBST漂洗3次，分别以1∶500浓度加DNAJC12或1∶2 000加入H4K5la一抗，在4 ℃冷库中孵育过夜，常温下PBST清洗3次PVDF膜，相应的二抗室温摇床上缓慢摇动孵育1 h。用同样的方法洗涤3次，ECL化学发光法检测目的条带。

1.2.6 RNA sequencing（RNA‑seq）

文库构建和测序由上海明码生物科技有限公司完成；使用基因本体数据库（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）进行基因功能注释；并使用DESeq2软件分析差异基因的表达情况，其中阈值设定为P<0.05且∣log₂（FC）∣≥1。

1.2.7 immunoprecipitation sequencing（ChIP‑seq）测序技术

取（6~8）×10⁶细胞，使用终浓度为1%的甲醛（甲酸‑free）交联10 min后，加入1×Glycine溶液淬灭交联反应；SDS裂解液重悬细胞后，利用优化好的条件，在超声条件下将基因组打断为合适的DNA片段，取合适比率的DNA产物作为Input，余下的DNA产物用于后续免疫沉淀实验，分别加入IgG或者anti‑H4K5la，孵育过夜（4 ℃）；样本中加入protein A/G beads，继续混合孵育2 h；并使用Elute buffer洗脱；无水乙醇沉淀产物，使用EDTA、三羟甲基氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）及Proteinase K解交联；并纯化DNA。安诺优达基因科技有限公司完成文库构建和测序。在去除掉低质量reads和接头序列后，ChIP‑seq数据分析使用FastQC（版本0.11.9）进行质量控制，并用bowtie2（版本2.4.4）比对到人类基因组hg38。使用MACS2寻找H4K5la修饰在基因组上富集的情况。

1.3 统计学处理

每个实验进行生物学重复至少3次，采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计作图，计量数据以\overline{x}\pm s表示。组间比较t检验或单因素方差分析（ANOVA分析）。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 敲除DNAJC12基因对SH‑SY5Y细胞耐药的影响

SH‑SY5Y细胞转染慢病毒后，采用qPCR分别检测对照组和基因敲除组DNAJC12基因的转录情况。与对照组相比，敲除组中DNAJC12基因表达明显下调（图1A），该基因编码的DNAJC12蛋白水平下降，且差异具有统计学意义（图1B）。评估DNAJC12表达下调后VP‑16药物对SH‑SY5Y细胞的活力影响，CCK8实验结果显示VP‑16药物对细胞杀伤力随药物浓度升高而增强，并呈现剂量依赖（图2A），采用非线性回归方法可以计算出其IC₅₀值为（4.22±0.31） μmol/L。同样VP‑16药物处理DNAJC12基因敲除的细胞，结果显示对照组相比，其IC₅₀值明显上升为（9.42±0.71） μmol/L（图2A），说明敲除DNAJC12抑制了神经母细胞瘤细胞对VP‑16的敏感性，即DNAJC12表达量下降后诱导了神经母细胞瘤对VP‑16的耐药。由于0.25 μmol/L的VP‑16浓度较低但是已经呈现出杀伤效果，因此选用0.25 μmol/L的VP‑16分别处理对照组和DNAJC12敲除组神经母细胞瘤的细胞，并做时间梯度实验，探讨DNAJC12蛋白在神经母细胞瘤耐药中的作用。结果显示从第48小时开始，VP‑16处理的对照组细胞相较于DNAJC12敲除组细胞活力明显降低（图2B），说明敲除DNAJC12基因后，会诱导细胞产生对VP‑16的耐药性，即DNAJC12对神经母细胞瘤的耐药起重要作用。

2.2 DNAJC12抑制神经母细胞瘤细胞组蛋白H4K5乳酰化水平

DNAJC12作为一种单胺类合成酶的分子伴侣，同时可以调控细胞中的糖酵解水平^［13］。葡萄糖的终端代谢产物‑乳酸‑是糖酵解与有氧途径和线粒体呼吸之间的纽带。葡萄糖在细胞内分解代谢形成丙酮酸，丙酮酸进入线粒体后参与三羧酸循环 （TCA），维持细胞的正常能量代谢。当缺氧发生时，无氧糖酵解通路会被激活，限制丙酮酸进入TCA循环；丙酮酸转化为乳酸，增加细胞内乳酸水平的改变，进而可能会影响细胞内组蛋白的乳酸化修饰水平。之前的研究显示，组蛋白H4K8位点上的乳酰化修饰（H4K8la）可以通过上调SERPING1和TRPV4基因的水平来促进神经母细胞瘤的进展^［14］；组蛋白H4K5位点上的乳酰化修饰（H4K5la）水平明显上升^［15］，且可以通过上调COL1A1基因的表达促进细胞的侵袭。本研究证实DNAJC12基因敲除后，H4K5la修饰水平的上升（图3）可以诱导神经母细胞对VP‑16的耐药性。该结果提示DNAJC12可能通过调控神经母细胞瘤细胞内的组蛋白H4K5la调控基因转录水平来影响细胞对化疗药物VP‑16的响应。

2.3 DNAJC12通过调控H4K5la调控神经母细胞瘤耐药

为探索H4K5la调控的靶基因与耐药之间的关系，分别对对照组和敲除DNAJC12的细胞进行了ChIP‑seq检测。ChIP‑seq的数据显示，敲除DNAJC12基因后，H4K5la修饰的信号在转录起始位点（transcription start sites，TSS）区域明显增强（图4A）；而且修饰水平的改变引起了H4K5la在基因组上的分布改变，特别是富集在基因启动子区域的修饰信号占比增大（图4B），这表明H4K5la可以促进基因转录。将受H4K5la调控的基因（ChIP‑seq数据）与差异基因（RNA‑seq数据）进行交互分析，发现这些差异基因主要富集在神经母细胞瘤细胞对细胞中含氧量响应相关的信号通路上（图4C）。在这条信号通路上，作为介导亚硝基化修饰的重要调控者NOS2位列其中，它是H4K5la的调控基因。最近的研究显示NOS2可以参与多种肿瘤的耐药、迁移和进展^［16］。ChIP‑qPCR结果显示H4K5la修饰结合在NOS2基因的promoter区域，且DNAJC12敲除后，H4K5la结合的启动子区域的DNA含量增多，上调该基因的表达（图4D）。qPCR实验证实NOS2基因在DNAJC12敲除后，其转录水平的明显上调（图4E），这些结果证实，DNAJC12通过调控H4K5la水平，来上调NOS2的表达，诱导神经母细胞瘤细胞产生VP‑16的耐药性。

3 讨论

本研究发现DNAJC12表达量下降后，诱导乳酸生成，促进组蛋白H4K5la修饰水平上升，进而上调NOS2基因的表达，促进神经母细胞瘤细胞对化疗药物VP‑16产生耐药性，从而影响神经母细胞瘤对化疗药物VP‑16的敏感度。该结果证实DNAJC12的表达量在神经母细胞瘤耐药中发挥重要的调控作用。这一发现不仅进一步深化了对神经母细胞瘤化疗耐药机制的认识，也为精准治疗策略的优化提供了理论依据和潜在干预靶点。

组蛋白乳酰化修饰是一种新型表观遗传修饰，由乳酸代谢产物通过酶促或非酶促途径修饰组蛋白赖氨酸残基^{［17‑19］}。乳酸在肿瘤微环境中积累，上调的乳酰化修饰可以促进多种肿瘤的进展^［20］。研究显示，在非小细胞肺癌中，乳酸可增强APOC2在K70位点的乳酰化，进而提升了APOC2的稳定性，引起游离脂肪酸释放和调节性T细胞积累，导致肿瘤转移和免疫治疗抵抗^［21］。此外，在结直肠癌中，组蛋白乳酰化修饰可以调节肿瘤自噬增强蛋白RUBCNL表达，导致对贝伐单抗治疗的抵抗^［22］。本研究结果也进一步证实，组蛋白乳酰化修饰水平的上调可以诱导产生肿瘤耐药，作为潜在的治疗靶点，具有广泛的临床应用前景。

本研究揭示了NOS2介导的化疗耐药的一种全新的分子调控机制。作为组蛋白H4K5la调控的靶基因之一NOS2的表达受DNAJC12的调控。NOS2是合成一氧化氮的关键合成酶^［23］。它是一种诱导性一氧化氮合酶，在多种生理和病理过程、特别是在肿瘤耐药中发挥重要作用。NOS2的上调可以生成更多的NO。NO可以以多种方式参与信号调控，也可以通过S‑亚硝基化的形式修饰的底物蛋白质，参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、血管生成和免疫逃逸等^{［24‑26］}。本研究提示组蛋白乳酰化修饰在以NOS2为核心的肿瘤化疗耐药调控网络中也是重要的一环。目前DNAJC12是如何调控乳酸含量的变化，组蛋白H4K5la是否与NO参与S‑亚硝基化修饰有交互作用尚不明确，这将是未来亟待阐述重要的问题。

综上所述，本研究阐明了DNAJC12通过调控细胞缺氧通路乳酸的含量来影响H4K5la修饰水平，通过改变NOS2的基因表达来诱导神经母细胞瘤对化疗药物VP‑16产生耐药的分子机制。这一发现不仅进一步深化了对化疗耐药发生机制的理解，也为未来精准治疗的开发提供了重要的理论基础和新的研究方向。随着完善的耐药机制研究和临床验证的开展，DNAJC12‑H4K5la‑NOS2轴有望成为克服神经母细胞瘤化疗耐药的重要治疗靶点，为改善患儿的预后提供新的治疗途径。

作者贡献度说明

张银凤、沈楠：课题设计、文章撰写和审校；韦荣缘、闻洁君：完成实验。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

浦东新区科技发展基金事业单位民生科研专项项目(PKJ2022‑Y01)

浦东新区科技发展基金事业单位民生科研专项项目(PKJ2022‑Y03)

上海市自然科学基金面上项目(22ZR1440200)

上海市2023年度“科技创新行动计划”港澳台科技合作项目(23410760900)