缺氧相关基因FHDC1对肝癌细胞增殖、侵袭转移及糖酵解能力的影响

The effect of hypoxia‑related gene FHDC1 on progression, migration, invasion and glycolysis of hepatocellular carcinoma cells

摘要

目的 分析缺氧相关基因FH2 domain containing 1（FHDC1）对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖、迁移、侵袭及糖酵解能力的影响。 方法 Western blot检测缺氧诱导因子1α（HIF‑1α）敲除的人肝癌细胞HepG2中HIF‑1α与FHDC1的蛋白表达水平。采用慢病毒感染的方法分别构建稳定过表达和敲除FHDC1的肝癌细胞株HepG2和Hep3B，在常氧和缺氧条件下分别利用CCK‑8、平板克隆形成实验、Transwell迁移与侵袭实验检测FHDC1对HepG2和Hep3B细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响。Western blot检测常氧与缺氧条件下FHDC1对HepG2和Hep3B细胞糖酵解关键蛋白：葡萄糖转运体1（glucose transporter 1，GLUT1）、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDHA）表达的影响。 结果 常氧及缺氧条件下，FHDC1在HIF‑1α敲除的HepG2细胞中表达均下调。常氧及缺氧条件下，与相应对照组比较，FHDC1过表达均可增强肝癌细胞HepG2和Hep3B的增殖、迁移与侵袭能力；而敲除FHDC1后，2种肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力均降低（P<0.05）。常氧及缺氧条件下，FHDC1过表达的HepG2和Hep3B细胞中GLUT1、PKM2和LDHA的表达均上升；而在2种肝癌细胞中敲除FHDC1后，GLUT1、PKM2和LDHA的表达均降低（P<0.05）。 结论 在肝癌细胞中HIF‐1α可调控FHDC1的表达，FHDC1能够增强肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力，并促进肝癌细胞糖酵解相关蛋白的表达。

Abstract

Objective To investigate the effects of hypoxia‑related gene FH2 domain containing 1 （FHDC1） on progression， migration， invasion and glycolysis of hepatocellular carcinoma （HCC） cells. Methods Western blot was used to detect the protein expression of HIF‑1α and FHDC1 in HepG2 cells after hypoxia‑inducible factor 1‑α （HIF‑1α） knocked out. Hepatoma cell lines HepG2 and Hep3B with stable overexpression and knockout of FHDC1 were constructed by lentiviral transfection， respectively. CCK‑8， plate colony formation assay， Transwell migration and invasion assay were used to detect the effects of FHDC1 on the proliferation， migration， and invasion of HepG2 and Hep3B cells under normoxia and hypoxia. Western blot was used to investigate the effects of FHDC1 under normoxic and hypoxic conditions on the expression of key glycolytic proteins in HepG2 and Hep3B cells： glucose transporter 1 （GLUT1）， pyruvate kinase M2 （PKM2）， and lactate dehydrogenase （LDHA）. Results The expression of FHDC1 was downregulated in HepG2 cells with HIF‑1α‑knockout under normoxia and hypoxia. Whether normoxia or hypoxia， compared to the corresponding control groups， overexpression of FHDC1 could enhance the proliferation， migration， and invasion of HepG2 and Hep3B cells. Conversely， the proliferation， migration， and invasion of HepG2 and Hep3B cells were decreased after knockout of FHDC1. Under normoxia and hypoxia， the expressions of GLUT1， PKM2， and LDHA was increased in FHDC1‑overexpressed HepG2 and Hep3B cells； While after knockout of FHDC1， the expressions of GLUT1， PKM2， and LDHA was decreased in HepG2 and Hep3B cells（P<0.05）. Conclusion HIF‑1α regulates FHDC1 expression in HCC cells. FHDC1， in turn， enhances the proliferation， migration， and invasion of HCC cells， and promotes the expresion of glycolysis‑related proteins.

Graphical abstract

关键词

肝细胞癌 / FHDC1 / 缺氧 / 迁移 / 侵袭 / 糖酵解

Key words

Hepatocellular carcinoma / FHDC1 / Hypoxia / Migration / Invasion / Glycolysis

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一。2024年的一项全球癌症统计数据显示：该年我国肝癌新发病例36.7万例，肝癌死亡病例31.6万例，在癌症导致的死亡人群中，肝癌占比仅次于肺癌^［1］。由于肝细胞癌内存在缺氧现象，促进缺氧诱导因子1α（hypoxia‑inducible factor 1α， HIF‑1α）降解的酶的活性被抑制，使得HIF‑1α得以稳定存在并活化。HIF‑1α活化后能调控一些缺氧相关基因的表达，从而促进细胞增殖与转移等过程^［2］。有学者发现低氧时HIF‑1α通过调控甲基转移酶16（methyltransferase‑like protein 16，METTL16）的表达，最终促进肝细胞癌的转移^［3］。HIF‑1α可直接结合到第237号跨膜蛋白（transmembrane protein 237，TMEM237）这一肝细胞癌的新型缺氧应答基因的启动子上，活化其表达从而促进肝细胞癌的增殖、迁移和侵袭^［4］。然而，其他参与调控肝细胞癌发生、发展的缺氧相关基因仍需深入研究。

FH2 domain containing 1（FHDC1）是细胞骨骼重塑蛋白Formin家族中特有的微管结合成员，内源性FHDC1结合于纤毛基部的细胞质微管，在正常纤毛组装过程中发挥协调细胞骨架动力学的作用，因而在细胞运动、物质运输等方面发挥重要作用^［5］。有文献报道FHDC1与胰腺癌患者临床预后密切相关^［6］。本课题组前期研究发现FHDC1在肝细胞癌中高表达，且与肝细胞癌不良预后及免疫微环境相关，具有成为肝细胞癌预后分子标志物的潜力^［7］。本研究通过构建稳定过表达及敲除FHDC1的肝癌细胞株，分别在常氧及缺氧条件下检测FHDC1对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力以及细胞糖酵解关键蛋白表达的影响，以期了解FHDC1在肝细胞癌缺氧微环境中的作用，为揭示FHDC1在肝细胞癌中的作用与潜在的分子机制提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HepG2和Hep3B肝癌细胞购自中国医学科学院肿瘤研究所，HIF‑1α敲除细胞与其相应作为对照的HepG2细胞（LacZ）为课题组前期构建，六水合氯化钴购自德国默克公司。青链霉素混合液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，胎牛血清购自苏州依科赛生物科技股份有限公司，DMEM高糖培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司。兔抗FHDC1抗体购自英国biorbyt公司，兔抗HIF‑1α抗体购自美国Affinity Biosciences公司，兔抗PKM2、GLUT1、LDHA抗体购自武汉三鹰，兔抗β‑actin抗体、山羊抗兔IgG购自北京博奥森公司。嘌呤霉素购自大连美仑生物技术有限公司。CCK‑8溶液购自美国APExBIO公司，4%多聚甲醛固定液购自北京兰杰柯生物公司，Matrigel基质胶购自美国康宁。

1.2 细胞培养

HepG2细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高糖完全培养基；Hep3B细胞培养于含15%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高糖完全培养基，置于37 ℃、5%CO₂培养箱进行培养。细胞汇合度达到80%左右即可传代。配制缺氧诱导培养基时，取11.9 mg氯化钴充分溶解于100 mL完全培养基中，配制成500 μmol/L的母液。细胞缺氧模拟处理时，用5倍稀释并过滤的完全培养基（氯化钴浓度：100 μmol/L）培养细胞，细胞置入37 ℃、5%CO₂培养箱孵育24 h即可用于后续实验。

1.3 Western blot

HIF‑1α敲除（HIF‑1α‑KO）组与相应对照HepG2细胞（LacZ）组，FHDC1过表达（FHDC1‐OE）组与相应对照（Vector）组，FHDC1敲除（FHDC1‑KO‑2）组与相应对照（LacZ）组的HpeG2和（或）Hep3B细胞以9×10⁴个每孔接种于6孔板，培养24 h后分为常氧组和缺氧组，对应更换完全培养基，继续培养24 h，且状态良好时提取蛋白进行BCA定量，对应加入Loading Buffer，100 ℃煮10 min备用。依次配制分离胶、浓缩胶，配制电泳液。电泳槽中加入电泳液后按顺序上样，设置电压为80 V全程电泳。电泳快结束时配制转膜液，待电泳结束后开始转膜，400 mA恒流转膜30 min。转膜结束时，使用无蛋白快速封闭液封闭25 min，TBST洗膜3次，每次10 min。对应加入FHDC1（1∶200）、HIF‑1α（1∶2 000）、β‑actin（1∶10 000）、PKM2（1∶2 000）、GLUT1（1∶5 000）和LDHA（1∶5 000）一抗，冰箱4 ℃孵育12~16 h。次日摇床室温孵育30 min，TBST洗膜3次，每次10 min，弃去TBST。加入山羊抗兔二抗（1∶5 000），摇床室温孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL法曝光。条带使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.4 构建稳定过表达及敲除FHDC1的肝癌细胞株

FHDC1过表达及敲除质粒sgRNA引物由上海生工生物有限公司构建合成。FHDC1 sgRNA‑2 F：5´‑CACCGGGTCACGCCAGAACTCCGTG‑3´；FHDC1 sgRNA‑2 R：5´‐AAACCACGGAGTTCT GGCGTGACCC‑3´。通过在线设计网站（http：//chopchop.cbu.uib.no）选取最佳引物序列，并与FHDC1基因对应CDs序列核对，在载体酶切位点序列后设计sgRNA。借助基因编辑工具载体lentiCRISPRv2（52961）构建FHDC1基因敲除、过表达质粒。将FHDC1过表达质粒及其对照空载体质粒，FHDC1基因敲除质粒及LacZ空载体质粒转染到感受态细胞DH5α后提取并进行测序验证。利用HEK 293T细胞扩增并提取质粒，随后包装慢病毒并分别转染HepG2和Hep3B细胞，2 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，Western blot检测FHDC1的表达。

1.5 细胞活力检测

取生长状态良好的Vector组、FHDC1-OE组、LacZ组、FHDC1-KO-2组的HpeG2和Hep3B细胞以4×10³个每孔接种于96孔板，于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养贴壁后，再将各组细胞分为常氧与缺氧组，加入相应的培养基培养24或48 h。每孔加入10 μL CCK‑8试剂，于细胞培养箱内孵育2 h后，在酶标仪450 nm处检测吸光度。计算细胞活力，细胞活力（%）=［（试验孔-空白孔）÷（对照孔-空白孔）］×100%。

1.6 平板克隆形成实验

按6×10²个每孔将细胞均匀接种到6孔板，每3天更换1次完全培养基。待孔内长出肉眼可见的单细胞克隆时，使用浓度为4%的多聚甲醛室温固定细胞20 min，弃去固定液，用1%结晶紫溶液染色20 min，清水洗去结晶紫染液，室温干燥。计数每孔克隆数，克隆形成率（%）=克隆形成数÷接种细胞数×100%。

1.7 Transwell迁移与侵袭实验

Transwell迁移实验：在24孔板底部加入600 μL的DEME高糖完全培养基，将小室放入孔板，避免产生气泡。Transwell小室中加入200 μL制备好的细胞悬液，细胞数量为2×10⁴个每孔。于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后取出小室，弃去培养基，PBS润洗2次，使用纱布擦去小室中未迁移的细胞，加入浓度为4%的多聚甲醛800 μL，固定细胞20 min。弃去多聚甲醛固定液，PBS润洗2次，加入0.1%的结晶紫染色25 min，弃去结晶紫，PBS润洗2次。室温干燥后，显微镜下拍照并计数。

Transwell侵袭实验：在小室底部加入基质胶，向顶室中加入100 µL细胞悬液，细胞数约为1×10⁵个，将DEME高糖完全培养基加入基底腔室。37 ℃恒温培养箱孵育48 h后，用棉签擦拭Transwell小室的无创细胞，固定、染色、计数同Transwell迁移实验。

1.8 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件分析数据，计量数据以\overline{x}\pm s表示，两两比较时采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FHDC1在HIF‑1α敲除的肝癌细胞中表达下调

为明确HIF‑1α在肝细胞癌中对FHDC1表达的调控，在HepG2细胞中敲除HIF‑1α后检测FHDC1表达水平的变化。首先通过Western blot实验检测HIF‑1α的敲除效果，在常氧和缺氧条件下，与对照组（LacZ）比较，HepG2细胞中HIF‑1α几乎不表达（P<0.001），表明HIF‑1α在HepG2细胞中敲除成功（图1A）。在HIF‑1α敲除的HepG2细胞中，进一步检测FHDC1的蛋白表达情况。结果显示，无论在常氧还是缺氧条件下，与对照组（LacZ）比较，在HepG2细胞中敲除HIF‑1α后，FHDC1的蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）（图1B）。这提示在肝癌细胞中HIF‑1α可调控FHDC1的表达。

2.2 成功构建稳定过表达和敲除FHDC1的肝癌细胞株

分别构建过表达和敲除FHDC1的慢病毒表达载体，并转染HepG2和Hep3B细胞，筛选稳定过表达和敲除FHDC1的肝癌细胞株。随后，在蛋白水平分别对2种细胞进行验证。HepG2和Hep3B细胞中过表达FHDC1后，与相应空载体对照组（Vector）比较，FHDC1的蛋白水平明显升高（P<0.01）（图2A）。而在3个不同位点分别敲除FHDC1后，HepG2和Hep3B细胞中FHDC1的蛋白水平相比于敲除对照组（LacZ）均有不同程度的降低（P<0.05），其中FHDC1‑KO‑2组在2种细胞中敲除效果均较明显（P<0.01）（图2B）。因此，后续相关实验均使用该FHDC1‑KO‑2组的肝癌细胞进行。

2.3 FHDC1促进肝癌细胞的增殖

在过表达和敲除FHDC1的HepG2和Hep3B细胞中，利用CCK‑8和平板集落形成实验分别检测不同氧气条件下肝癌细胞的增殖水平。CCK‑8结果显示，在常氧和缺氧条件下，过表达FHDC1的2种肝癌细胞的细胞活力在24（图3A）及48 h（图3B）时，相比于对照组均有不同程度的增加（P<0.05）；而敲除FHDC1的2种肝癌细胞与相应对照组比较，细胞活力在2个时间点均有不同程度的降低（P<0.05）。平板克隆实验结果显示（图3C、D），在常氧和缺氧条件下，过表达FHDC1可增强2种肝癌细胞的克隆形成能力（P<0.01），而敲除FHDC1则抑制2种肝癌细胞的克隆形成能力（P<0.01）。

2.4 FHDC1促进肝癌细胞迁移和侵袭

进一步检测FHDC1对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响。Transwell迁移实验结果显示（图4A、B、E、F），无论在常氧还是缺氧条件下，过表达FHDC1后的HepG2和Hep3B细胞的迁移能力相较于Vector组均增强（P<0.05）；而敲除FHDC1后的2种肝癌细胞，其迁移能力相较于对应的LacZ组有不同程度的下降（P<0.001）。在常氧及缺氧条件下，Transwell侵袭实验结果显示（图4C、D、G、H），过表达FHDC1后的HepG2和Hep3B细胞的侵袭能力均有所增加（P<0.05）；而敲除FHDC1后，2种肝癌细胞的侵袭能力均明显降低（P<0.001）。

2.5 FHDC1促进肝癌细胞糖酵解相关蛋白的表达

肝癌组织通常出现糖消耗增加以及代谢方式向糖酵解倾斜的代谢变化^［8］。GLUT1作为葡萄糖转运蛋白，可以将葡萄糖转运至细胞内，为糖酵解提供初始底物。PKM2则可以催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸和ATP，并调控代谢速率以适应细胞需求。LDHA在缺氧条件下能将丙酮酸还原为乳酸，在清除糖酵解终产物的同时再生NAD⁺，确保糖酵解的持续进行。在常氧及缺氧条件下检测过表达及敲除FHDC1的HepG2和Hep3B细胞中糖酵解相关蛋白GLUT1、PKM2、LDHA的表达情况。结果显示，在常氧条件下（图5A~D），相比于空载体对照组，FHDC1过表达的2种肝癌细胞中GLUT1、PKM2和LDHA的表达均增加（P<0.01），而敲除FHDC1的2种肝癌细胞中，3种蛋白的表达均下降（P<0.05）。缺氧时（图5E~H），FHDC1过表达及敲除的HepG2和Hep3B细胞中GLUT1、PKM2、LDHA蛋白的表达趋势与常氧时相同（P<0.05）。

3 讨论

缺氧是肝细胞癌的一个明显特征，而HIF‑1α已被公认为是包括肝癌在内的多种肿瘤缺氧调控网络中的核心分子^［9］。本研究发现在肝癌细胞HepG2中敲除HIF‑1α后，FHDC1蛋白在常氧及缺氧时的表达均明显下降。这提示FHDC1在肝癌细胞中的表达可能受到HIF‑1α的正向调控。在肝癌细胞中，泛素连接酶E2K（ubiquitin‑ligase enzyme E2K，UBE2K）是一个潜在的缺氧相关基因，其表达水平在缺氧状态下受到HIF‑1α的正向调控。当UBE2K过表达时会促进肝癌细胞的增殖和迁移，而敲低该基因则会抑制HIF‑1α诱导的肝癌细胞的生长和迁移^［10］。有研究报道，缺氧条件下HIF‑1α在肝癌细胞中可直接结合肝配蛋白A3（ephrin A3，EFNA3）基因的启动子区并增强EFNA3的表达水平，而EFNA3在肝癌细胞中具有促进肝细胞癌细胞的自我更新、增殖和迁移的能力^［11］。这表明HIF‑1α与缺氧相关基因之间的调控机制较为复杂，存在着直接调控和间接调控等多种方式。后续实验将进一步探究HIF‑1α在肝细胞癌中与FHDC1之间的调控机制。深入研究HIF‑1α调控的缺氧相关基因，将为探究肝细胞癌的发病机制提供新的视角和线索。

FHDC1是一种肌动蛋白成核因子，从功能上来看与细胞分裂、细胞迁移、细胞形态维持等过程密切相关^［12］。为了探究其是否能促进肝细胞癌细胞的恶性增殖与迁移侵袭，本研究建立了FHDC1稳定过表达和敲除的肝癌HepG2和Hep3B细胞。在常氧及缺氧条件下，通过CCK‑8、平板克隆、Transwell实验对FHDC1稳定过表达和敲除的肝癌HepG2和Hep3B细胞进行检测，结果发现，在常氧和缺氧条件下，FHDC1都能促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这提示FHDC1在肝癌中发挥着类似癌基因的功能。一项利用微囊藻毒素诱导人正常肝上皮细胞LO2发生恶性转化的研究发现，该细胞中的关键基因FHDC1广泛参与了细胞癌变的形成、增殖、迁移、侵袭和代谢过程^［13］，另一项有关卵巢癌的研究指出，长链非编码RNA LINC00665可以通过靶向miR‑181a‑5p促进FHDC1上调从而增加卵巢癌细胞增殖和迁移能力^［14］。

糖代谢重编程发生在多种肿瘤组织中，以满足肿瘤细胞的恶性增殖、侵袭、上皮间质转化等过程的高能量需求，而HIF‑1α对多种肿瘤糖酵解相关蛋白的调控仍是当前的研究热点^［15］。有报道发现，在肝细胞癌缺氧类器官模型中，HIF‑1α能够通过上调己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase M，PKM）、血小板型磷酸果糖激酶（phosphofructokinase‑Platelet，PFKP）等多个糖酵解关键基因的表达从而促进肝癌细胞的糖酵解过程^［16］。缺氧条件下，HIF‑1α还能通过结合尿斑蛋白1A（uroplakin 1A，UPK1A）基因的启动子区域直接活化其表达从而促进肝细胞癌细胞的增殖，UPK1A亦可通过活化GLUT1、HK2、PKM2、LDHA等糖酵解相关蛋白的表达而促进肝癌细胞的糖酵解^［17］。本研究发现，无论常氧还是缺氧条件下，过表达FHDC1能够促进HepG2和Hep3B肝癌细胞糖酵解相关蛋白GLUT1、PKM2、LDHA的表达，而敲除FHDC1后，2种肿瘤细胞中糖酵解相关蛋白GLUT1、PKM2、LDHA的表达则被抑制。这表明FHDC1可以促进肝癌细胞的糖酵解，但该过程是否受到HIF‑1α的直接调控还有待后续实验进一步证实。

综上所述，本研究发现在肝癌细胞缺氧状态下，FHDC1的表达可能受到HIF‑1α的正向调控；缺氧时FHDC1能够增强肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力，并促进肝癌细胞糖酵解相关蛋白的表达。但本研究目前仅限于细胞水平，后续将进一步在动物实验中探究HIF‑1α调控FHDC1在肝细胞癌中的作用与分子机制，以期为揭示缺氧相关基因FHDC1在肝细胞癌中的功能提供更全面的实验依据。

作者贡献度说明：

夏会东：撰写与修改论文、整理数据并参与部分实验；梁念孩：实验与数据收集；杨伟：实验研究的监管与指导；摆茹：指导实验研究以及论文的撰写、修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

宁夏自然科学基金(2023AAC03721)