复发性流产患者阴道分泌物的代谢组学分析

Metabolomics analysis of vaginal secretions in patients with recurrent spontaneous abortion

摘要

目的 探讨与复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）患者阴道分泌物相关的差异代谢物和代谢途径。 方法 利用超高效液相色谱‑四级杆‑静电场轨道阱高分辨质谱联用（UPLC‑Q‑Exactive‑MS）技术，对63例RSA患者和47例健康女性的阴道分泌物进行非靶向代谢组学分析，将多元和单元统计分析相结合，筛选两者的差异代谢物，并对差异代谢物进行代谢通路分析，进而寻找代谢物与RSA的相对关系。同时通过受试者工作特征（ROC）曲线分析差异代谢物对RSA的鉴别能力。 结果 在健康非孕组和健康妊娠组中筛选出L‑脯氨酸、L‑亮氨酸等8种差异代谢物和精氨酸脯氨酸代谢等4条异常代谢通路。在RSA非孕组和健康非孕组中筛选出2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α、3‑（2‑萘基）‑L‑丙氨酸等13种差异代谢物和嘧啶代谢等2条异常代谢通路。在RSA妊娠组和健康妊娠组中筛选出甘氨熊脱氧胆酸、D‑（‑）‑核糖等7种差异代谢物和磷酸戊糖途径等2条异常代谢通路。通过ROC曲线分析确定了曲线下面积（AUC）>0.7的差异性代谢物3种，包括2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α、3‑（2‑萘基）‑L‑丙氨酸、甘氨熊脱氧胆酸。 结论 RSA患者与健康妇女的阴道分泌物代谢谱存在差异，2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α、3‑（2‑萘基）‑L‑丙氨酸、甘氨熊脱氧胆酸这3种代谢物对RSA表现了出色的判别效能，有望作为潜在的生物标志物。

Abstract

Objective To explore the differential metabolites and metabolic pathways associated with vaginal secretions in patients with recurrent spontaneous abortion（RSA）. Methods Using UPLC‑Q‑Exactive‑MS technology， we performed non‑targeted metabolomics analysis on vaginal secretion samples from 63 patients with RSA and 47 healthy women， screened for differential metabolites between the two groups with combining multivariate and unitary statistical analysis， and the metabolic pathway analysis of the differential metabolite's was performed， thus finding the relative relationship between the metabolite and RSA. The discriminatory ability of differential metabolites to RSA was also analyzed by subject work characteristic curve （ROC）. Results Eight differential metabolites， including L‑proline and L‑leucine， and four abnormal metabolic pathways， including arginine and proline metabolism， were screened in the healthy nonpregnant and healthy pregnant groups.Thirteen differential metabolites， including 2，3‑Dinor‑8‑epi‑prostaglandin F2α and 3‑（2‑Naphthyl）‑L‑alanine，and two abnormal metabolic pathways， including pyrimidine metabolism， were screened in the RSA nonpregnant and healthy nonpregnant groups. Seven differential metabolites， including glycoursodeoxycholic acid and D‑（‑）‑Ribose， and two abnormal metabolic pathways， including the pentose phosphate pathway， were screened in the RSA pregnancy group and the healthy pregnancy group. Three differential metabolites with area under the curve （AUC） > 0.7 were identified by ROC curve analysis，Including 2，3‑Dinor‑8‑epi‑prostaglandin F2α、3‑（2‑Naphthyl）‑L‑alanine and glycoursodeoxycholic acid. Conclusion There are differences in the metabolic profiles of vaginal secretions between RSA patients and healthy women. Three metabolites， 2，3‑Dinor‑8‑epi‑prostaglandin F2α， 3‑（2‑Naphthyl）‑L‑alanine and glycoursodeoxycholic acid showed excellent discriminatory efficacy for RSA and are expected to serve as potential biomarkers.

Graphical abstract

关键词

复发性流产 / 代谢组学 / 阴道分泌物 / 液相色谱‑质谱联用

Key words

Recurrent spontaneous abortion / Metabolomics / Vaginal secretions / Liquid Chromatography‑Mass Spectrometer

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）指在怀孕28周以前，与同一配偶发生两次及以上的妊娠丢失^［1］，对女性的身心造成伤害。RSA的病因较复杂，目前已知的因素有染色体异常、解剖结构异常、内分泌异常等^［2］，此外，仍有50%的病例原因未知，称为原因不明RSA（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）^［3］。因此，能否早期诊断RSA并识别RSA的潜在病因至关重要。代谢组学通过全面定性定量检测生物系统中基因表达和蛋白质功能的最终产物，了解生物体内某一时刻所有内源性代谢物的变化，从而筛选生物标志物，为疾病的早期诊断及探索发病机制提供新思路^［4］。

目前关于RSA的血浆代谢组学研究较多，刘倩等^［5］应用非靶标代谢组学技术筛选URSA患者的血浆代谢标志物，发现磷脂酰乙醇胺、L‑亮氨酸、西松烯、咖啡因等6种差异代谢物及其代谢通路可能参与URSA的发生。然而，阴道分泌物作为女性生殖系统特殊的代谢产物，更能反映生殖道微环境状况，在RSA的代谢组学领域却未受到重视。因此，本研究使用在敏感度、分辨率及精确度方面表现出色的超高效液相色谱‑四级杆‑静电场轨道阱高分辨质谱联用（ultra high performance liquid chromatography‑tandem Q‑Exactive‑mass spectrometry，UPLC‑Q‑Exactive‑MS）技术^［6］，探讨RSA患者阴道分泌物中的差异代谢物和差异代谢通路，旨在为临床RSA的早期诊断提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

选择2022年2月~2023年6月在海南省人民医院妇产科门诊就诊的共110例女性，其中，健康对照组47例，RSA组63例。分组命名及受检者例数分别为：健康非孕（non‑pregnancies，NP）组20例、健康妊娠（pregnancies，P）组27例、RSA非孕（RSA non‑pregnancies，RNP）组28例、RSA妊娠（RSA pregnancies，RP）组35例。纳入标准：健康对照组：（1）年龄25~43岁的健康未孕及正常妊娠女性；（2）肝肾功能正常，无传染性疾病；（3）近1周未使用抗生素类药物。RSA组：（1）年龄25~43岁；（2）符合RSA诊断标准；（3）肝肾功能正常，无传染性疾病；（4）近1周未使用抗生素类药物。排除标准（所有受检者的排除标准相同）：（1）年龄<25岁或>43岁；（2）患有传染性疾病如：肺结核、肝炎等；（3）经期/异常阴道出血；（4）生命体征不平稳；（5）放化疗、免疫等特殊治疗人群。

本研究应用代谢组学方法探讨NP组和P组，RNP组和NP组以及RP组和P组之间阴道分泌物代谢组分变化。经海南省人民医院医学伦理委员会审核通过并获得受检者知情同意。伦理学编号：医伦研［2023］239号。

1.2 仪器和试剂

UPLC‑Q‑Exactive‑MS系统：Waters UPLC I‑Class Plus（Waters，USA）、Q Exactive高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific，USA）、BEH C18 Columns （Waters，USA）、甲醇（THERMO，USA）、乙腈（FISHER SCIENTIFIC，USA）、甲酸（DIMKA，USA）、甲酸铵（Honeywell Fluka，USA）。

1.3 样本采集与预处理

使用一次性无菌拭子采集受检者阴道上三分之一处的分泌物，旋转数圈，然后将拭子放回无菌管中，每位受检者采集5管样本，并在2 h内放置-80 ℃冰箱保存。

分析前，将阴道分泌物置于4 ℃冰箱解冻，每个样本取100 μL加入EP管中，分别添加700 μL含有内标的萃取剂（甲醇：乙腈：水=4∶2∶1）用于沉淀蛋白提取代谢物，将管涡旋1 min后，-20 ℃孵育2 h，然后离心15 min（25 000 g，4 ℃）以去除沉淀的蛋白质。收集每个样本的上清液600 μL到新的EP管中，然后用抽干机抽干，加入180 µL甲醇：纯水（1∶1）复溶，涡旋10 min。上清液溶解于复溶液后，离心15 min（25 000 g，4 ℃），取所有上清液至新的EP管内待检测。

每个样本取20 µL混合作为质量控制（quality control，QC）样本，可用来评价设备的稳定性。

1.4 测定条件

液相色谱条件：（1）色谱柱：BEH C18 Columns（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）；（2）进样量：5 μL；（3）柱温：45 ℃；（4）流动相：正离子模式A液：0.1%甲酸‑水，B 液：0.1%甲酸‑甲醇；负离子模式A 液：10 mmol/L 甲酸铵‑水，B液：10 mmol/L甲酸铵‑95%甲醇；（5）洗脱条件：起始为 2%B 液维持时间1 min，至9 min时升高到98%B液，9~12 min时保持98%B液不变，而到第12.1 min时返回到 2%B 液并平衡到15 min；（6）流速：0.35 mL/min。

质谱条件：利用Q Exactive质谱仪进行一、二级质谱数据采集。具体参数见表1。

离子源（ESI）参数设定 ：离子传输管和辅助气加热的温度分别设置为 320 ℃和 350 ℃，而鞘气和辅助气的流速则分别设置为 40 和 10，喷雾电压在正离子模式下设定为 3.8 kV，负离子模式下设定为 3.2 kV。

1.5 QC验证

为了保证检测结果的准确性，在仪器测试期间，随机排列样本，从而降低系统误差，并在每10个样本中插入一个QC样本。而后对QC样本在正、负离子模式下的基峰离子流图（base peak chromatogram，BPC）进行重叠，所有QC样本的谱图重叠良好，见图1，说明仪器性能相对稳定，可靠性较高。

1.6 数据处理与分析

将代谢组学原始数据导入数据处理软件Compound Discoverer 3.3（Thermo Fisher Scientific， USA）中，对数据进行峰对齐和峰提取，获得含代谢物质荷比（mass‑to‑charge ratio，m/z）、保留时间（retention time，RT）和二级质谱图（MS/MS spectra）的三维数据文件，将三维数据文件与标准品数据库即华大自建标准库 BGI Met‑Lib、mzCloud和公共数据库ChemSpider中的代谢物进行匹配，从而对代谢物进行鉴定。随后，使用metaX软件（深圳华大基因股份有限公司）进行差异代谢物的筛选。应用单元统计分析包括差异倍数（fold change，FC）分析、t检验分析和多元统计分析包含主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法‑判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS‑DA），得到FC值、P值以及OPLS‑DA 模型的变量投影重要度（variable important for the projection，VIP）。差异代谢物须同时满足3个筛选条件：（1）FC值≥1.2或≤0.83；（2）P≤0.05；（3）VIP≥1。为检验 OPLS‑DA模型是否过拟合，采用200次置换检验考察分析模型的可靠性和适用性。最后基于京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）数据库对差异代谢物进行代谢途径的富集分析。

1.7 统计学处理

基础资料数据采用SPSS 25.0软件进行统计学处理。计量资料符合正态分布，用\overline{x}\pm s表示，应用应用独立样本t检验进行组间比较。使用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价差异代谢物的诊断效能，并计算曲线下面积（area under the curve，AUC）。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况比较

采用独立样本t检验对各组受检者的年龄、BMI进行比较，最终NP组和P组，RNP组和NP组以及RP组和P组年龄比较的t值分别为1.965、-0.866和1.500，P值分别为0.056、0.391、0.139，BMI比较的t值分别为-2.009、-0.593、和-1.022，P值分别为0.051、0.556和0.311，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.2 代谢物检测结果和分类

研究结果显示，所有阴道分泌物样本共检测到49 106个代谢物，其中10 252个可通过数据库进行鉴定。

利用KEGG数据库和人类代谢组数据库（Human Metabolome Database，HMDB）对鉴定出的代谢物进行分类，每种分类的代谢物数量见图2。结果表明，在鉴定的10 252个代谢物中，有5 137个代谢物被分为4类，包括具有生物作用的化合物（n=2 772）、脂质（n=716）、植物化学化合物（n=645）、其它（n=1 004）。同时，利用KEGG数据库对鉴定出的代谢物进行功能注释，确定代谢物所涉及的代谢途径，每种代谢途径中的代谢物数量见图3。结果共注释了13条包含668种代谢物的KEGG通路，其中排名前4的途径为：其它次生代谢物生物合成（n=141）、氨基酸代谢（n=125）、异种生物降解和代谢（n=76）、脂质代谢（n=74）。这4条途径中代谢物数量占所有途径中代谢物数量的62.28%。

2.3 代谢组学数据分析结果

对NP组和P组，RNP组和NP组以及RP组和P组样本进行PCA分析，观察样本的分布趋势，见图4，图中大部分样本点落在椭圆内，即95%的置信区间内，3个比较组样本代谢组学数据在PCA得分图中存在部分重叠，但区分度总体较理想，说明3个比较组的代谢物谱存在差异。

对NP组和P组，RNP组和NP组以及RP组和P组进一步进行OPLS‑DA分析，得分图见图5，图中大部分样本点在椭圆内，即95%的置信区间内，3个比较组之间明显分离，说明3个比较组的代谢物谱发生了明显改变。

为了判断模型质量，对OPLS‑DA模型参数R2和Q2进行200次置换检验，NP组和P组，RNP组和NP组以及RP组和P组的Q2回归线与Y轴的截距即Q值分别为-0.35、-0.33、-0.37，证明模型没有过拟合，数据分析合理，见图6。

2.4 差异代谢物的筛选

本研究在所有阴道分泌物样本中共鉴定出10 252种代谢物，根据差异代谢物的筛选条件，最终确定了28种差异代谢物。

NP组和P组筛选出8个差异代谢物，与P组相比，NP组中二十碳五烯酸甲酯等3种代谢物水平升高；L‑脯氨酸等5种代谢物水平降低。

RNP组和NP组筛选出13个差异代谢物，其中，在RSA组中水平升高的代谢物有3‑羟基丁酸、2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α等6种；水平下降的代谢物有4‑羟基苯基丙酮酸、N‑乙酰基‑L‑谷氨酰胺等7种。

RP组和P组筛选出7个差异代谢物，与P组相比，RP组中明显上调的代谢物有甘氨熊脱氧胆酸、3‑（2‑萘基）‑L‑丙氨酸等5种；明显下调的代谢物有油酸‑生物素、孕酮2种。以上3组筛选出的差异代谢物详细信息见表3~5。

2.5 差异代谢物的聚类热图

聚类热图能直观地显示差异代谢物在各组样本中含量差别，本研究中NP组和P组，RNP组和NP组以及RP组和P组样本的差异代谢物聚类热图见图7。从图中可看出，差异代谢物在各比较组之间的颜色都有明显区别，证明了这些差异代谢物的相对含量在各比较组中存在明显差异。

2.6 差异代谢物的代谢通路分析

基于KEGG数据库对以上鉴定出的差异代谢物进行代谢通路富集分析，以初步探讨与RSA有关的代谢通路机制。

NP组和P组、RNP组和NP组以及RP组和P组差异代谢物的代谢通路富集分析气泡图分别见图8A~C。最终，在NP组和P组中筛选出缬氨酸亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、磷酸戊糖途径、精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢共4条差异代谢通路；在RNP组和NP组中筛选出嘧啶代谢、泛醌和其他萜类醌生物合成共2条差异代谢通路；在RP组和P组中筛选出类固醇激素生物合成、磷酸戊糖途径共2条差异代谢通路。以上代谢通路的紊乱很可能与RSA的发生密切相关。

2.7 建立ROC诊断模型

采用ROC分析评估上述在RNP组和NP组，RP组和P组中筛选出的20种差异代谢物对RSA的辨别能力，具体通过计算差异代谢物的AUC来评估其作为生物标志物的判别效能，一般认为AUC>0.7的代谢物具有潜力成为疾病标志物。最终，共确定了2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α、3‑（2‑萘基）‑L‑丙氨酸、甘氨熊脱氧胆酸共3种对RSA有较好诊断效能的差异代谢物，这3种差异代谢物的AUC值分别为0.757、0.839、0.803，其ROC图见图9。

3 讨论

本研究应用UPLC‑Q‑Exactive‑MS的非靶标代谢组学技术，共筛选出预测RSA的20种差异代谢物，RSA患者阴道分泌物中糖、脂质、氨基酸及胆汁酸代谢均出现明显改变。采用ROC曲线评价差异代谢物对RSA的诊断价值，其中2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α、3‑（2‑萘基）‑L‑丙氨酸、甘氨熊脱氧胆酸这3种差异代谢物的AUC分别为0.757、0.839、0.803，对RSA有较良好的诊断效能。

前列腺素F2α在生殖道中可介导子宫内膜螺旋小动脉的收缩，使子宫肌层收缩，造成子宫局部血液供应不足。此外，前列腺素F2α在妊娠的子宫内膜上可增加基质金属蛋白酶的活性并降低其抑制剂的活性，增加催产素及其受体的表达，降低对孕酮的反应，从而导致流产^［7］。本研究发现，RNP组中阴道分泌物中的2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α含量增加，可能由于游离花生四烯酸的释放导致胎膜和蜕膜中前列腺素F2α、前列腺素E2‑前列环素和血栓素A2合成增加，从而刺激子宫收缩导致患者流产^［8］。

甘氨熊脱氧胆酸为结合型胆汁酸中的一种，在胎盘表面，胆汁酸的含量增加，能促进血管的收缩，严重损害胎盘的氧气和血液供应功能，从而导致胎儿窒息、缺氧和流产^［9］。本研究发现，在RP组中甘氨熊脱氧胆酸的水平升高，其可能使患者的胎盘供氧和供血都受到影响，进而导致流产。

丙氨酸作为一种重要的氨基酸，在人体内具有多种生物学功能和特性，在本研究中，RNP组和RP组都出现丙氨酸水平升高，与对照组之间的差异倍数都在2倍以上，然而，目前尚不明确其他文献报道丙氨酸在阴道中的作用，是未来去了解RSA未知机制的可能突破。

唾液酸苷酶由阴道加德纳杆菌和厌氧菌分泌^［10］，是诊断细菌性阴道炎的指标之一。而细菌性阴道炎与胎膜早破、流产等不良妊娠结局有关^{［11，12］}。有研究表明，阴道分泌物中唾液酸苷酶与3‑羟基丁酸呈正相关^［13］，本研究发现3‑羟基丁酸在RNP组中水平上调，与上述研究结果一致，推测3‑羟基丁酸的增加可能是由于唾液酸苷酶的增加，患者阴道的菌群生态平衡被破坏导致细菌性阴道炎的产生，从而可能引起流产。

丙酮酸参与三羧酸循环，既往研究报道，在孕期，三羧酸循环中间体如乳酸和丙酮酸的水平会增加，原因是为了给胎儿供应生长发育必需的底物，母体的基础代谢率会明显提高^［14］。本研究发现4‑羟基苯基丙酮酸在RNP组患者中减少，与之前在子痫前期孕鼠的胎盘代谢组学研究中显示出类似趋势^［15］，泛酸和辅酶A可通过参与丙酮酸、脂肪酸等的代谢，为胎儿供应丰富的能量，而丙酮酸含量下降会使能量合成受阻，最终导致宫内发育不良、流产等不良妊娠结局。

没食子酸是一类在食品和草药中普遍存在的多酚类物质。邹莞杰等^［16］为了减少母猪产道炎症的发生从而降低母猪流产概率，研制出一种具有抗菌保健功效的发酵复方中药饲料添加剂，可提高母猪繁殖性能。采用超高效液相色谱法检测该添加剂的主要活性成分，发现其发挥抑菌作用的活性物质包括没食子酸、山柰素和焦性没食子酸等。其中，没食子酸、山柰素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌具有良好的抗菌作用。本研究发现没食子酸在RNP组患者中含量减少，这可能间接导致患者产道的抑菌作用降低，从而促进流产的发生。

谷氨酰胺可为胚胎由细胞‑1阶段向囊胚的转变提供能源^［17］。有研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在动物胚胎发育过程有重要作用，而谷氨酰胺具有防御ROS的机制，从而保护DNA链不受破坏^［18］。其次，谷氨酰胺是精氨酸的前体，而精氨酸能够生成对胚胎发育有益的NO^［19］。在本研究中，RNP组的N‑乙酰‑L‑谷氨酰胺含量减低，这与之前对稽留流产患者血清代谢物的研究一致^［20］，这可能使胎儿不能避免氧化应激损伤，导致胎儿早期死亡中的DNA损伤和细胞凋亡。

综上所述，本研究筛选出的差异代谢物通过影响人体血管功能、免疫调控、内分泌调节、氧化应激、子宫内膜容受性等方面，对RSA的发生有着明显影响，未来可以着眼于与RSA相关的氧化应激通路，免疫作用相关等的机制研究。

本文利用UPLC‑Q‑Exactive‑MS技术分析RSA患者与健康妇女的阴道分泌物代谢谱，3个比较组共鉴定出28种差异代谢物，其中，3种差异代谢物包括：2，3‑Dinor‑8‑表‑前列腺素F2α、3‑（2‑萘基）‑L‑丙氨酸和甘氨熊脱氧胆酸在RSA筛查方面表现了出色的判别效能，有望作为RSA潜在生物标志物，这些发现对理解RSA的发病机制提供了新思路，同时对RSA的早期诊断具有较高的参考意义。

作者贡献度说明：

庄丽怡：样本和实验数据的收集、数据分析、撰写并修改论文；龚护民：样本收集、病史采集；张培，李诗佳：样本和实验数据的收集；黄涛：实验设计、基金获取、论文最后校审。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

海南省科技厅，海南省卫生健康科技创新联合项目(WSJK2024MS238)