当归补血汤调控TNF‑α/PI3K‑AKT/BMP信号通路改善糖尿病性骨质疏松的机制研究

Mechanism study on the regulation of TNF‑α/PI3K‑AKT/BMP signalling pathway by Danggui Buxue Decoction to improve diabetic osteoporosis

摘要

目的 基于网络药理学、分子对接和动物实验探究当归补血汤（Danggui Buxue Decoction， DGBXD）治疗糖尿病骨质疏松（diabetic osteoporosis， DOP）的潜在靶点和作用机制。 方法 通过网络药理学方法筛选DGBXD的活性化学成分，检索当归补血汤与糖尿病/骨质疏松相关的靶点。构建药物‑疾病靶点的蛋白质‑蛋白质相互作用（PPI）网络。通过分子对接验证主要靶点与活性化学成分之间的相互作用。使用db/db糖尿病小鼠模型，通过ELISA、Western blot和病理学等检测，验证DGBXD干预DOP的潜在靶点，并探究其作用机制。 结果 网络药理学共获得黄芪作用的靶点413个，当归作用的靶点共65个，检索出15 330个基因作为DOP相关的疾病靶点。DGBXD治疗DOP的靶点202个，其中黄芪190个，当归11个。网络药理学富集分析表明DGBXD可能通过调节TNF‑α表达和PI3K‑AKT信号通路调节炎症因子表达，改善DOP的成骨异常。动物实验结果显示，与对照组相比，模型组小鼠的血清IL‑6、IL‑8和TNF‑α水平明显提高（P<0.05）；DGBXD的干预可以抑制模型组过高的IL‑6、IL‑8和TNF‑α表达（P<0.05）。病理结果显示DGBXD可以纠正异常炎症反应引起的骨形成紊乱。Western blot结果进一步说明，与模型组相比，DGBXD的干预可以明显降低TNF‑α、AKT、磷酸化AKT的蛋白表达，纠正BMP2的蛋白表达异常（P<0.05）。 结论 DGBXD可能通过调控TNF‑α/PI3K‑AKT/BMP信号通路，抑制炎症反应并增强BMP2的表达，从而促进骨基质的合成与矿化，缓解高糖诱导的成骨抑制，改善骨代谢平衡，达到对DOP的治疗作用。

Abstract

Objective To investigate the potential targets and mechanisms of action of Danggui Buxue Decoction （DGBXD） for the treatment of diabetic osteoporosis （DOP） based on network pharmacology， molecular docking， and animal experiments. Methods The active chemical components of DGBXD were screened by a network pharmacology approach to retrieve the targets of DGBXD related to diabetes osteoporosis. Protein‑protein interaction （PPI） networks of drug‑disease targets were constructed. Validate the interactions between major targets and active chemical components by molecular docking. Using a db/db diabetic mouse model， the potential targets of DGBXD intervention in DOP were validated and the mechanism of action was explored by ELISA， Western blot and pathology. Results A total of 413 targets for the action of Astragalus and 65 targets for the action of Angelica sinensis were obtained by network pharmacology， and 15 330 genes were retrieved as DOP‑related disease targets. The total number of targets of DGBXD for DOP was 202， including 190 from Astragalus and 11 from Angelica sinensis. Network pharmacological enrichment analysis indicated that DGBXD may improve osteogenic abnormalities in DOP by regulating inflammatory factor expression through modulating TNF‑α expression and PI3K‑AKT signaling pathway. The results of animal experiments showed that compared to the control group， the serum IL‑6， IL‑8 and TNF‑α levels were significantly increased in the model group （P<0.05）； the intervention of DGBXD could inhibit the excessive IL‑6 （P<0.05），IL‑8 （P<0.05） and TNF‑α （P<0.05） expressions in the model group. Pathological results showed that DGBXD could correct the disorders of bone formation caused by abnormal inflammatory response. Western blot results further indicated that compared to the model group， the intervention of DGBXD could significantly reduce the protein expression of TNF‑α， AKT， phosphorylated AKT， and correct the abnormal protein expression of BMP2 （P<0.05）. Conclusion DGBXD may inhibit the inflammatory response and enhance the expression of BMP2 by regulating the TNF‑α/PI3K‑AKT/BMP signaling pathway， thus promoting the synthesis and mineralization of bone matrix， alleviating the high glucose‑induced osteogenic inhibition， improving the balance of bone metabolism， and achieving the therapeutic effect on DOP.

Graphical abstract

关键词

糖尿病骨质疏松 / 网络药理学 / 分子对接 / 当归补血汤

Key words

Diabetic osteoporosis / Network pharmacology / Molecular docking / Danggui Buxue Decoction

2型糖尿病骨质疏松症（diabetic osteoporosis， DOP）是糖尿病的一种慢性并发症，由于其剧烈的疼痛和极高的骨折风险，给糖尿病患者带来巨大痛苦。糖尿病是导致骨质疏松症患者骨质流失^［1］和骨折患者骨愈合障碍的重要因素。有研究表明，糖尿病患者骨质疏松症的发病率高达27.67%^［2］，对公众健康构成重大威胁^［3］。目前治疗DOP的方法主要包括改变生活方式和药物干预，改变生活方式主要表现在限制体力活动^［4］，而药物治疗包含使用非甾体抗炎镇痛药^［5］、二甲双胍^［6］、双磷酸盐和RANKL抑制剂（地舒单抗）^［7］等。虽然这些药物有助于控制血糖水平并缓解疼痛，但亦有研究表明，其对胃肠道产生不良影响，并增加肝脏和肾脏并发症^［8］的风险。此外，这些治疗可能会加重骨质疏松^［9］，并破坏糖脂代谢^{［10，11］}。因此，迫切需要开发一种更具个性化和针对性的治疗策略。

当归补血汤（Danggui Buxue Decoction，DGBXD）由黄芪和当归组成，出自金代医家李东垣的《内外伤辨惑论》，由当归和黄芪两味药组成，比例为1∶5（即当归10 g，黄芪50 g）。该方剂以补气生血为主要功效，常用于治疗血虚发热、面色萎黄、脉洪而虚等症状，在临床上，DGBXD被广泛用于治疗气虚血弱的相关病症，并在产后虚弱、皮肤病、心血管疾病、糖尿病和骨质疏松症方面取得了良好的疗效。现代药理研究进一步证明，DGBXD具有促进骨髓造血^［12］、调节中枢能量代谢^［13］、加速骨折愈合^［14］和调节胰岛素抵抗^［15］等效果。

本课题组先前研究表明，DGBXD可减轻骨质疏松症的进展，这可能是由于它具有抗氧化和类似雌激素的特性^［16］。然而，之前的研究主要集中于其对骨髓间充质干细胞的促进分化作用，忽视了其在糖代谢紊乱环境中的作用。针对这一空白，本研究旨在通过实验验证与网络药理学相结合的方法，评估DGBXD对于糖尿病骨质疏松的疗效，并研究其治疗DOP的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采购自广东集萃药康生物科技有限公司［许可证号：SCXK（粤）2020‑0054］，6周龄C57BLKS/J db/db（db/db）及其同窝野生型小鼠共28只，饲养于广州中医药大学第一附属医院动物中心［使用许可证编号SYXK（粤）2023‑0092］。所有屏障环境动物实验室进行饲养，适应性饲养7 d，并检疫完成后开展实验。定期更换垫料及食物，保证实验动物的正常生存以及饲养环境的整洁。动物尸体按照饲养中心规定统一处理。动物实验经广州中医药大学第一附属医院动物实验伦理伦理委员会批准（伦理号：GZTCMF1‑20230077）。

1.2 实验试剂

当归补血汤的组成为当归10 g，黄芪50 g。药物采购自广州中医药大学第一附属医院中药房，经广州中医药大学第一附属岭南骨伤研究所所长黄枫鉴定，均符合《中国药典》要求。阿仑膦酸钠采购于美国Sigma公司（#121268‑17‑5），GAPDH抗体（Abcam，Ab9485，1∶2 500），丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抗体（CST，#4695，1∶1 000），肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）抗体（Abcam，Ab1793，1∶500）；白细胞介素‑8（IL‑8）抗体（Abcam，Ab208565，1∶1 000）；BMP‑2抗体（Abcam，Ab14933，1∶1 000）；VEGF抗体（Abcam，46154，1∶1 000）；HRP标记的二抗（Abcam，6789，1∶1 500）；白细胞介素‑6（IL‑6）、IL‑8及TNF‑α ELISA试剂盒（酶联生物）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天），SDS‑PAGE凝胶快速配置试剂盒（碧云天），5×蛋白上样缓冲液（碧云天），异氟烷（RWD）。

1.3 耗材及仪器

成像系统（日本，尼康，Nikon DS‑U3），酶标仪（美国，赛默飞），电泳仪（Bio‑Rad），转膜仪（Bio‑Rad），摇床（上海玉研仪器有限公司，FMS3），化学发光成像系统（Bio‑Rd）。

1.4 实验方法

1.4.1 网络药理学及分子对接

1.4.1.1 获取当归补血汤药物成分及靶点

当归补血汤由黄芪、当归组成。在中药系统药理学技术与分析平台TCMSP（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）中搜索中药的全部化学成分，同时将口服吸收率（oral availability，OB）和类药性（drug likeness，DL）作为筛选指标，选取同时满足OB≥30%和DL≥0.18者作为其主要化学成分，OB是指药物被人体胃肠吸收量与口服量的比率，DL指化合物与已知药物的相似程度，二者均属于中药的药物动力学特性。并且在TCMSP数据库中查找所得化学成分的作用靶点，通过Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库将作用靶点转化为靶点基因。

1.4.1.2 获取糖尿病性骨质疏松相关疾病靶点

在比较毒理基因组学数据库（CTD）（https：//ctdbase.org/）中使用“Osteoporosis”检索骨质疏松相关基因、“Diabetes Mellitus， Type 2”检索2型糖尿病相关基因，并将两者的推理得分（Inference Score）大于10的结果取交集获得DOP的相关基因；在GeneCard（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：//www.omim.org）数据库中使用“Type 2 diabetic osteoporosis”为关键词检索DOP相关的基因，GeneCard的结果取相关分数（Relevance score）大于10分为结果。基因的并集结果使用R语言（4.2.1）中的“VennDiagram”包绘制韦恩图进行可视化。

1.4.1.3 药物‑活性成分‑靶点网络构建与分析

将当归补血汤作用的靶点基因与“1.4.1.2”中提到的3个数据库的检索结果取交集，交集靶点为当归补血汤治疗DOP的靶点。基因的交集结果使用R语言中的“VennDiagram”包绘制韦恩图进行可视化。使用Cytoscape3.8.0软件构建药物‑活性成分‑靶点网络。

1.4.1.4 靶点生物学功能分析

将当归补血汤治疗DOP的相关靶点输入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopediaof Gevnesand Genomes，KEGG）通路富集分析。设定物种为“Homo sapiens”（人类），以P<0.05为筛选条件，得到当归补血汤治疗DOP的GO功能注释和KEGG通路分析的结果，并对其结果进行可视化分析。

1.4.1.5 蛋白互作（PPI）网络分析

将当归补血汤治疗DOP的靶点基因导入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/），设置物种为人类（Homo spaiens），可信度为最高可信度（highest confidence=0.900），隐藏未连接的节点后得到PPI网络；再将其导入Cytoscape3.8.0（http：//www.cytoscape.org）软件中，构建PPI网络图，并得出每一个靶点的Degree值；随后使用cytoHubba插件的MCC算法找出网络中排名前10的靶点，使用MCODE插件设定degree cutoff=5，筛选出核心网络。选取核心靶点进行下一步分析。

1.4.1.6 分子对接

准备配体小分子和受体蛋白文件。根据“1.4.1.3”中的结果选取活性成分，在TCMSP中搜索作用于核心靶点的活性成分的Pubchem Cid，在PubChem数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索药物成分对应的Pubchem Cid，下载小分子配体3D结构（3D Conformer）的SDF格式，使用open babel2将小分子配体的SDF格式转化为mol2格式；根据筛选的核心靶点，分别在UniProt（https：//www.uniprot.org/）获取基因编号，通过基因编号在URCSBPDB数据库（http：//www1.rcsb.org）获得蛋白3D结构，限定条件为：人源蛋白，2.5A以内，结构复合体中有小分子配体信息。下载PDB格式，并通过Pymol2.4.0软件去除水分子和小分子配体并保存PDB格式作为受体蛋白。在Autodock 1.5.6软件中对蛋白受体和小分子配体进行加氢等处理，保存为pdbqt格式文件，设置合适的对接盒子及对接参数，使用Autodock Vina 1.1.2进行分子对接，保存结果并选取部分结果在pymol中进行可视化分析。

1.4.2 动物实验

1.4.2.1 当归补血汤冻干粉的制备

按照配伍比例将当归和黄芪用10倍量的纯净水浸泡1 h后煮沸，再加入8倍体积的水煎煮1 h，所得药液用纱布过滤。用旋转蒸发仪将上清液浓缩至1 L。完成浓缩后，将其在-80 ℃下冷冻过夜。用冷冻干燥机对冻干产品进行冷冻干燥（-76 ℃抽真空20 min，-76 ℃冻干48~72 h）。即得当归补血汤冻干粉。

1.4.2.2 动物实验及分组

根据随机数字法将动物分为4组：对照组（CON）、糖尿病模型（diabetes mellitus， DM）组、糖尿病当归补血汤（DM‑DGBXD）组、糖尿病阳性对照阿仑膦酸钠（Alendronate control，AC）组，每组7只。其中，当归补血汤组根据《实验动物学》根据成年人每日摄入当归补血汤的剂（60 g/70 kg）。参考本课题组的前期研究成果（2025A03J3892）显示，在小鼠骨折模型中当归补血汤高浓度（5.4 g/kg）愈合程度最佳，因此选择该剂量进行给药，根据冻干粉获得率换算后按照每日3.249 mg/g冻干粉溶于1.5 mL超纯水中，进行灌胃。阳性对照组予阿仑膦酸钠2.5 mg/kg进行灌胃。每日一次，连续4周，每周测量体重及血糖。对照组及模型组给予等剂量生理盐水灌胃。

1.4.2.3 生化指标检测

使用腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为50~60 mg/kg）对小鼠进行麻醉。确认完全麻醉后行眼眶静脉取血，收集流出的血液于无抗凝微量采血管中。将采血管置于4 ℃环境中静置2 h后，以3 000 g离心15 min分离血清。收集的血清立即转移至低温保存（如-20 ℃或-80 ℃）。使用ELISA试剂盒检测血清TNF‑α、IL‑6及IL‑8水平。

1.4.2.4 病理检测

收集小鼠股骨样本，经脱钙、包埋、切片后行H&E和Von Kossa染色，在40×及20×镜下观察骨组织成骨效能。Micro‑CT检测骨小梁厚度（trabecular thic kness，Tb.Th）、骨小梁分 离程度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁数量（trabecu lar nu mber，Tb.N）、骨体积分数（percent bone volume，BV/TV）、骨密度（bone mineral density，BMD）评估骨微观结构。

1.4.2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）

股骨样本匀浆后加入裂解液充分裂解，超声破碎后离心取上清，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样本与上样缓冲液混合，煮沸变性后进行SDS‑PAGE凝胶电泳分离蛋白。电泳完成后，将蛋白从凝胶转移至PVDF膜，使用5%脱脂奶粉或BSA封闭非特异性位点。随后加入一抗孵育，4 ℃过夜，洗涤后再加入HRP标记的二抗继续孵育1 h，并充分洗涤。通过ECL曝光液进行显色15 s后使用成像系统检测蛋白条带，以GAPDH为内参，使用ImageJ分析条带灰度值，计算相对蛋白表达水平，每组实验重复3次。

1.5 统计学处理

采用Graph Pad Prism 8.0软件作图，数据分析采用SPSS23.0软件，当数据分析符合正态分布时，均用\overline{x}\pm s表示，随后进行方差齐性分析，t检验用于方差齐时两组间的比较，校正t检验用于方差不齐时两组间的比较；单因素方差分析用于3组及以上数据的组间比较，事后分析采用Tukey法，若方差不齐，采用Dunnett’s T3法进行组间比较。若数据不符合正态分布，以M（P₂₅，P₇₅ ）表示，比较组间差异时采用秩和检验；P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析

2.1.1 “药物‑活性成分‑靶点”网络构建

在TCMSP 中查询到符合筛选条件的黄芪活性成分20个、当归2个，最终共筛选出22个化合物；获得黄芪作用的靶点共413个，当归作用的靶点共65个。在CTD数据库获得2型糖尿病（T2DM）相关基因共18 139个，骨质疏松相关基因共15 250个，两者取交集共获得13 696个DOP相关基因，见图1；在GeneCards数据库收集得到DOP相关基因共3 982个；OMIM数据库收集得到DOP相关基因共517个，见图2；合并3个数据库数据，剔除重复基因，共检索出15 330个基因作为DOP相关的疾病靶点。获得当归补血汤治疗DOP的靶点共202个，其中黄芪190个，当归11个。构建当归补血汤“药物‑活性成分‑靶点”网络。结果导入Cytoscape3.8.0软件并进行可视化，见图3。

2.1.2 PPI网络分析

将当归补血汤治疗DOP的靶点基因导入String数据库，得到蛋白相互作用网络的结果，将其导入Cytoscape3.8.0软件，制作出PPI网络图，见图4A。该网络共含有166个节点，692条相互作用的连线。根据每个靶点Degree值得出当归补血汤治疗DOP核心靶点条状图。CytoHubba插件的MCC算法找出网络中排名前10的靶点分别为肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL6）、白细胞介素1β（IL1B）、白细胞介素1α（IL1A）、趋化因子配体2（CCL2）、白细胞介素8（IL8）、转录因子AP1（JUN）、转录因子p65（RELA）、白细胞介素4（IL4）、白细胞介素10（IL10），见图4B。综上所述，TNF、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、IL8的Degree值较高、MCC算法排名较前，且在核心网络中出现，可作为当归补血汤治疗DOP的核心靶点。

2.1.3 靶点生物学功能分析

利用DAVID数据库检索获取的靶点并将其结果导出，按照P值升序分别获取生物过程、细胞组成、分子功能各排前20位的功能富集条目。其中纵坐标表示富集条目，横坐标表示富集基因数，条目的P值以图形颜色展示。由图5可知，生物过程注释包括了对缺氧的反映（response to hypoxia）、血管生成的积极调节（positive regulation of angiogenesis）、炎症反应（inflammatory response）、细胞对缺氧的反映（cellular response to hypoxia）、细胞迁移的正向调节（positive regulation of cell migration）等；细胞组成、分子功能结果见图5A~C；KEGG富集的通路主要包括脂质与动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的AGE‑RAGE信号通路（AGE‑RAGE signaling pathway in diabetic complications）等，见图5D。

2.1.4 分子对接结果验证关键靶点

将筛选出来的核心靶点TNF、MAPK1、IL8与当归补血汤的药物活性成分对接，分子对接结果一般以分子对接结合能进行评价，结合能小于-0 kcal/mol表明两者可在自然状态下结合，结合能小于-5 kcal/mol表明对接良好，结合能负值绝对值越大表明受体和配体分子结合越紧密。运用AutoDock软件进行分子对接结果显示，所有对接结果结合能小于-5 kcal/mol，表明受体蛋白与配体小分子对接良好。使用pymol对对接结果进行可视化分析。对接表见表1，对接图见图6。

2.2 动物实验验证

2.2.1 DGBXD对糖尿病小鼠的血糖和体重影响

与CON组相比，余小鼠血糖均有升高；表现出见典型的db/db小鼠的代谢特性。见图7。

2.2.2 DGBXD对糖尿病小鼠骨形成的影响

H&E 染色（40×）显示（图8A），与CON组相比，DM组小鼠的骨小梁连通性降低，骨小梁分离增加，显示出骨质疏松症特征，而DGBXD和阿仑膦酸钠的干预明显改善了这一特征。Von Kossa染色（20×）显示，与CON组相比，DM组表现出钙沉积减少、骨小梁变薄、骨密度降低，DM‑DGBXD组和AC组的骨钙盐沉积和骨小梁形成增加，钙化部位呈黑色或深棕色，表明存在更成熟的骨组织（图8B）。小鼠股骨在4周时的Micro‑CT结果（图8C~H）显示，与CON组相比，DM组小鼠的BMD无明显差异（P>0.05）；BV/TV；Tb. N；Tb. Th降低（P<0.05）；Tb.sp增加（P<0.05），以上结果说明松质骨小梁连通性降低、小梁分离度增加、骨量减少，DM组表现出典型的骨质疏松症特征。与DM组相比，DM‑DGBXD组小鼠的骨矿化情况良好，BMD无明显差异（P>0.05），BV/TV增加（P<0.05），Tb.Th厚度增强（P<0.05），Tb.N数量升高（P<0.05），Tb.Sp程度降低（P<0.05）。以上结果表明，db/db小鼠具有骨质疏松的表型。DGBXD的干预可以在一定程度上促进db/db小鼠的骨小梁生成。

2.2.3 DGBXD对糖尿病小鼠炎症因子的影响

E‐ LISA结果显示，与CON组相比，模型组小鼠的TNF‑α、IL‑6和IL‑8表达明显升高（P<0.05）。与DM组相比，DM‑DGBXD组小鼠的TNF‑α、IL‑6和IL‑8表达降低，且具有统计学差异（P<0.05）。见图9。

2.2.4 DGBXD对糖尿病小鼠TNF‑A/PI3K‑AKT/BMP信号通路的影响

Western blot结果显示，与CON组相比，在DM组小鼠中，TNF‑α和p‑AKT水平升高（P<0.05），BMP水平降低（P<0.05）。与DM组相比，当归补血汤干预后，TNF‑α和p‑AKT的表达水平明显减低（P<0.05），而BMP的表达升高（P<0.05）。见图10。综上所述，DGBXD可能通过抑制TNF‑α/AKT/BMP信号通路抑制炎症反应，促进BMP的表达，最终改善骨基质的合成和矿化。

3 讨论

中医传统理论认为糖尿病骨质疏松属于“骨痿”合并“消渴”范畴，其病因病机主要与肾虚、脾虚、气血不足及痰瘀互结有关。病理机制为气血亏虚导致骨骼失养，肝肾不足则骨髓空虚。中医治疗糖尿病骨质疏松的原则，强调整体观念和辨证论治。当归补血汤是中医经典方剂，出自《内外伤辨惑论》，由黄芪和当归组成。黄芪味甘性温，归脾肺经，具有补气升阳、固表止汗的功效。两者配伍，既能益气以生血，又能补血以养骨，从而达到治疗目的。

骨骼是一种动态的、代谢活跃的组织^［13］，它通过骨细胞和破骨细胞活动发出的机械信号进行重塑^［17］，因此，DOP的发病机制复杂。在正常情况下，成骨细胞的活动受到中枢神经的调控，并根据不断变化的机械应力，修复微损伤^［18］。由于骨重塑的持续进行，骨形成和骨吸收之间的平衡得以保持^［19］，并保持结构的完整性。然而，诸多因素可以破坏这种平衡，进而影响骨重塑和骨骼异常。随着糖尿病患病率的增加，该病特有的持续高血糖^［20］、高胰岛素血症和炎症环境会影响对骨重塑至关重要的几个调节因子（BMPs、TGF‑β、IGF‑1及FGFs）^［21］，干预骨转换。总的来说，糖尿病患者合并骨质疏松的治疗要点在于恢复骨代谢的平衡，改善由于高血糖而受到抑制的成骨细胞增殖减少及矿化异常。

在本研究中，首先使用网络药理学分析发现黄芪作用的靶点共413个，当归作用的靶点共65个，检索出15 330个基因作为DOP相关的疾病靶点。当归补血汤治疗DOP的靶点共202个，其中黄芪190个，当归11个。GO和KEGG表明DGBXD可能通过多靶点、多通路协同调节DOP。蛋白质互作网络筛选出关键靶点TNF、IL8及IL6。分子对接也显示了DGBXD的主要成分山奈酚、槲皮素与TNF，IL8及IL6的结合活性良好。在动物实验中，BMD反映骨矿物质含量，而骨小梁连通性、BV/TV比值等参数更敏感地反映骨微结构的三维拓扑特征^［22］。本研究发现，DGBXD药干预后骨密度无明显变化，骨小梁数量增多、分离度降低，提示骨形成活性增强与骨吸收抑制的协同作用，糖尿病小鼠表现出的典型骨质疏松特征，在DGBXD的干预下得以改善。其机制可能与BMP通路激活促进骨基质分泌，加速骨小梁新生与重构，促进了骨形成速率的提升。亦可能与炎症因子减少降低破骨细胞活性，减少骨小梁断裂，骨吸收受到抑制有关。

有研究表明在糖尿病骨质疏松中，高血糖环境通过激活免疫细胞（如巨噬细胞和单核细胞），促进促炎因子（IL‑8^［23］、IL‑6、TNF‑α）的分泌^［24］。其中TNF‑α在炎症中起重要作用，并通过多种途径抑制骨形成^［25］。因此，结合网络药理学结果，推测DGBXD可以通过调控TNF‑α、IL‑8和IL‑6等炎症因子，发挥抗炎作用。本研究使用ELISA检测结果验证了这一推理，在糖尿病组小鼠中，TNF‑α、IL‑8及IL‑6的高表达抑制了糖尿病小鼠的骨转换，而DGBXD的干预可以抵抗这一炎症反应，进而挽救因高糖引起的炎症因子增加而导致的骨转换异常，改善了骨小梁分离程度，促进了骨板的形成。TNF‑α可直接作用于破骨细胞前体的表面受体，激活NF‑κB、p50/p52、c‑Fos^［26］和NFATc1^［27］，诱导破骨细胞前体分化，最终导致骨质疏松。既往研究发现，TNF‑α/PI3K‑AKT通路的激活与骨质疏松的发病密切相关^［28］。因此基于以上研究和网络药理学KEGG富集分析，本研究进一步探讨了TNF‑α下游调节因子AKT的磷酸化程度及成骨标志物BMP2的表达情况。Western blot结果则说明了DGBXD可以抑制炎症因子的表达，抑制AKT的磷酸化，增加成骨因子BMP2的表达，促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞生成，从而达到改善高糖炎症微环境和缓解骨流失的作用。

综上所述，本研究对DGBXD治疗糖尿病骨质疏松的疗效进行了初步的探索，并在进一步的体内实验中发现了DGBXD通过调控TNF‑α/PI3K‑AKT/BMP信号通路，抑制炎症反应并增强成骨因子BMP2的表达，从而促进骨基质的合成与矿化，缓解高糖诱导的成骨抑制，改善骨代谢平衡的作用机制，为糖尿病骨质疏松的中医药治疗提供实验基础。

作者贡献度说明：

张芝桐：研究整体设计、实验实施、数据处理、撰写；卢泽声：网络药理学技术支持；陈景昕：实验实施；任悦怡：数据处理；姜自伟：指导文章撰写；董航：文章修改；黄枫：研究设计指导及文章质量控制。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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