外泌体荷载miR-122靶向ADAM10调控肝癌HepG-2细胞生物学活性的机制研究

摘要

目的：探究骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）源性外泌体（exosomes, Exo）传递的微小RNA(miR-122)对人肝癌HepG-2细胞生物学活性的调控作用及其分子机制。方法：采用超速梯度离心法从BMSC中分离Exo，并利用透射电镜和Western blot实验进行鉴定；通过电转染技术将miR-122模拟物（miR-122 mimics）及其阴性对照（NC mimics）分别负载至Exo，分别记为NC Exo和miR-122 Exo, RT-qPCR检测两种Exo中miR-122相对表达量；采用外泌体绿色荧光PKH67染料标记NC Exo和miR-122 Exo后再与HepG-2细胞共培养，观察Exo被HepG-2细胞摄取情况；HepG-2细胞分为对照（Control）组、NC Exo组（NC Exo处理细胞）、miR-122 Exo组（miR-122 Exo处理细胞），采用CCK-8法、Transwell小室实验、Western blot实验检测不同条件处理下HepG-2细胞增殖活性、迁移、侵袭能力及上皮间质转化相关蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达变化；通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验预测并验证miR-122与解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)的靶向调控关系。结果：从BMSC中分离的Exo呈球形状囊泡，直径30～150 nm,Exo特殊标记蛋白CD9、CD63、HSP70、TSG101均为阳性表达，且负载miR-122 mimics的miR-122 Exo中miR-122相对表达量明显高于负载mimics NC的NC Exo(P<0.05),NC Exo和miR-122 Exo均能够被HepG-2细胞摄取。与对照组比较，NC Exo组HepG-2细胞在培养24、48、72 h时增殖活性均明显升高（P<0.05），细胞迁移与侵袭数量均明显增加（P<0.05）,NC Exo组HepG-2细胞中上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平明显降低（P<0.05），而间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与对照组、NC Exo组相比，miR-122 Exo组HepG-2细胞在培养24、48、72 h时明显抑制HepG-2细胞增殖（P<0.05），细胞迁移与侵袭数量均明显减少（P<0.05）,miR-122 Exo HepG-2细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高（P<0.05），而间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。miR-122与ADAM10的3'-UTR存在结合位点，与miR-NC组比较，在HepG2细胞中转染miR-122可以明显抑制ADAM10 WT的相对荧光素酶活性（P<0.05）。结论：通过Exo传递miR-122至HepG-2细胞，能够抑制细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化等生物学行为，其机制可能与靶向抑制ADAM10表达有关。

关键词

肝癌 / 外泌体 / 微小RNA-122(miR-122) / 增殖 / 转移 / 解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)