基于网络药理学与分子对接技术探讨芪茵颗粒治疗非酒精性脂肪肝的机制研究

Exploring the mechanism of QiYin Keli in the treatment of non⁃alcoholic fatty liver disease based on network pharmacology and molecular docking technology

摘要

目的 应用网络药理学和分子对接技术预测靶点通路，通过动物实验研究探索芪茵颗粒（Qiyin Keli，QYKL）治疗非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）作用机制的潜在作用靶点。 方法 利用网络药理学和分子对接技术预测芪茵颗粒和NAFLD的相关靶点；将SD大鼠随机分为正常对照组（Control组）和通过喂养高脂饲料建立NAFLD模型。成功建立NAFLD大鼠模型后，将模型大鼠进一步分为5组，模型组（HF组）、低剂量芪茵颗粒治疗组（HF+L组）、中剂量芪茵颗粒治疗组（HF+M组）、高剂量芪茵颗粒治疗组（HF+H组）、二甲双胍和硫普罗宁处理的NAFLD组（HF+MT组）；连续饲养13周，各组分别灌胃30 d。H&E染色和透射电镜检测大鼠病理组织变化，检测甘油三酯水平，ELISA检测大鼠体内炎症水平，免疫组化检测大鼠肝组织炎症变化。 结果 从芪茵颗粒中筛选出107个有效成分，核心基因有AKT1、TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β等；与芪茵颗粒治疗NAFLD相关的通路有PI3K⁃AKT通路等；动物实验表明：HF组肝组织脂肪化严重，透射电镜可观察到HF组细胞核固缩，细胞内有大量脂滴；与HF组比，HF+M组肝组织脂化明显降低（P<0.01），甘油三酯水平恢复正常，ELISA显示HF+M组TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃1β等炎症指标明显下降（P<0.01），免疫组化实验中HF组TNF⁃α、IL⁃6表达明显升高（P<0.01），HF+M组TNF⁃α，IL⁃6表达明显下降（P<0.01）。 结论 芪茵颗粒可能通过PI3K⁃AKT通路调节炎症和胰岛素抵抗，从而改善大鼠脂肪肝的病理状态。

Abstract

Objective To predict potential targets and signaling pathways of Qiyin Keli （QYKL） against nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD） using network pharmacology and molecular docking， and to investigate its underlying mechanism in NAFLD rats. Methods Candidate targets and key pathways associated with QYKL in NAFLD treatment were predicted using network pharmacology and molecular docking. Sprague‑Dawley rats were randomly assigned to a normal control group and a model group， in which the NAFLD model was induced by high⁃fat diet feeding. After successful modeling， the NAFLD rats were further randomized into five subgroups： model （HF）group， low⁃dose QYKL （HF+L） group， medium⁃dose QYKL （HF+M） group， high⁃dose QYKL （HF+H） group， and metformin plus tiopronin treatment （HF+MT） group. All rats were fed for 13 consecutive weeks， and corresponding interventions were administered by intragastric gavage for 30 days. Hepatic pathological changes were examined by H&E staining and transmission electron microscopy. Serum triglyceride levels were determined to evaluate hepatic steatosis. Serum inflammatory cytokines were measured by ELISA， and hepatic inflammatory protein expression was detected by immunohistochemistry. Results A total of 107 active ingredients were identified from QYKL， with AKT1， TNF⁃α， IL⁃6 and IL⁃1β as core gene targets. The PI3K⁃AKT signaling pathway was recognized as a crucial pathway mediating the anti⁃NAFLD effects of QYKL. Animal experiments showed marked hepatic steatosis in the HF group， along with nuclear pyknosis and abundant intracellular lipid droplets under electron microscopy. Compared to the HF group， hepatic steatosis was significantly ameliorated in the HF+M group （P<0.01）， accompanied by normalized serum triglyceride levels. ELISA revealed that TNF⁃α， IL⁃6 and IL⁃1β levels were prominently reduced in the HF+M group （P<0.01）. Immunohistochemical results confirmed that the expression of TNF⁃α and IL⁃6 was significantly elevated in the HF group （P<0.01） but distinctly decreased in the HF+M group （P<0.01）. Conclusion Qiyin Keli may alleviate hepatic pathological injury in NAFLD rats by modulating inflammation and insulin resistance through the PI3K⁃AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 非酒精脂肪肝 / 分子对接 / 芪茵颗粒 / 炎症

Key words

Network pharmacology / Non⁃alcoholic fatty liver / Molecular docking / Qiyin Keli / Inflammation

非酒精性脂肪肝（non⁃alcoholic fatty liver disease，NAFLD）作为一种的代谢综合征，其特征在于肝细胞中脂质的异常沉积，这种沉积并非由酒精或其他已知的肝损伤因素引起，而是与肥胖、高脂血症和2型糖尿病等多种代谢性疾病密切相关^［1，2］。NAFLD是全球范围内最常见的慢性肝脏疾病之一，其发病率近年来呈现出明显的上升趋势。根据世界卫生组织（WHO）的报告，NAFLD的全球患病率已超过30%，且这一数字在肥胖和糖尿病患者中更为突出^［3］。随着全球肥胖症和2型糖尿病的流行，NAFLD已成为最常见的肝脏疾病，甚至逐渐取代了病毒性肝炎成为慢性肝病的主要原因之一^［4］。特别是在一些发展中国家，随着城市化进程的加速及不健康生活方式的普及，NAFLD的患病率呈现逐年上升的趋势，已成为公共健康领域的严重挑战^［5，6］。数据表明，NAFLD与心血管疾病、糖尿病、代谢综合征等多种代谢性疾病密切相关^［7，8］，形成了严重的多重健康负担。

NAFLD的发生主要与肝脏的脂肪代谢异常、胰岛素抵抗、氧化应激、慢性炎症等因素密切相关^［9］。随着疾病的发展，肝脏可能出现炎症反应（非酒精性脂肪性肝炎，NASH）、纤维化，甚至最终进展为肝硬化或肝癌^［10］。目前，非酒精性脂肪肝的治疗尚无特效药物，治疗方案主要包括生活方式干预（如减重、合理饮食、增加运动）^［11］。然而，现有的药物治疗选项有限^［12］，因此，开发针对NAFLD的特效药物仍是当前研究的热点之一。而中医药在慢性代谢性疾病的治疗中展现出了明显优势。现代药理学的研究也进一步证实了众多天然药物对NAFLD具有良好的治疗效果^［13］。芪茵颗粒（Qiyin Keli，QYKL）为曾斌芳教授的经验方，临床疗效确切有效，又是新疆自治区中医院的院内制剂。全方体现了“虚湿瘀滞并治，肝脾肾同调，从虚论治”的特点^［14］。运用脏腑虚损理论，着重调节肾之气化、脾之运化、肝之疏化，形成虚实兼治，是适合非酒精性脂肪肝主要证型的有效方剂。鉴于此，本研究依托中医理论，运用网络药理学技术，旨在深入筛选QYKL对NAFLD的作用机制及其潜在靶点。同时，还将对QYKL干预NAFLD的效果进行详细分析，以期为NAFLD的治疗提供新的思路和策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 数据库及分析平台

本研究所使用主要数据库及分析平台见表1。

1.1.2 药物

芪茵颗粒（生黄芪30 g，茵陈10 g，生山楂15 g，补骨脂6 g，泽泻10 g，决明子10 g，生大黄3 g，三七粉3 g，苦丁茶10 g）组成，购于新疆维吾尔自治区中医医院（江阴天江药业有限公司生产）；盐酸二甲双胍片（默克制药有限公司，H20023370）；硫普罗宁肠溶片（上海凯宝新谊药业有限公司，H41020799）。

1.1.3 动物

实验动物为6~8周龄健康雄性SPF级SD大鼠，均购买和饲养于新疆医科大学动物实验中心［动物许可证号：SYXK（新）2021⁃003］。在相对湿度45%~65%、温度（25±1）℃、通风良好和氧气充足条件下饲养。动物的喂养和实验均严格按照国家健康指南研究所的指导方针，且遵从《国家动物管理办法》，研究方案获得了新疆医科大学动物伦理委员会的批准（伦理审批号：IACUC⁃202400711⁃63）。

1.1.4 试剂

甘油三酯（TG）试剂盒（南京建成生物工程研究所，20241217）；苏木素⁃伊红（H&E）染色试剂盒（北京兰杰柯科技有限公司，24214563）；莱卡石蜡（莱卡，2301081CN）；封闭用羊血清（中杉金桥，242260730）；通用型试剂盒（小鼠/兔聚合物法检测系统）（中杉金桥，2414D0622）；DAB显色试剂盒（中杉金桥，234030104）；TNF⁃α和IL‑6一抗（万类生物，批号为：T10091896，T10122841）；TNF‑α、IL‑6、IL‑1β ELISA试剂盒（上海优选公司，202412）；环保透明脱蜡液（无锡市江原实业技贸有限公司，240115）；无水乙醇（天津市鑫铂特化工有限公司，20240506）；0.9%氯化钠（新疆华世丹药业股份有限公司，24040815）；组织细胞固定液（北京雷根生物技术有限公司，0305A24）；电镜固定液（Servicebio，G1102）；柠檬酸三钠，丙酮（国药集团化学试剂有限公司，10019408，10000418）；812包埋剂，醋酸铀（SPI，90529⁃77⁃4，02624⁃AB）；锇酸（Ted Pella Inc，18456）；硝酸铅（Sigma，203580）

1.1.5 仪器

石蜡包埋机，石蜡切片机（徕卡显微系统有限公司）；全波长酶标仪（美国Thermo Fisher公司，型号：Multiskan GO）；超薄切片机（Leica，LeicaUC7）；透射电子显微镜（HITACHI，HT7800）。正置荧光生物显微镜（型号Eclipse Ni⁃U，日本Nikon公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 网络药理学

1.2.1.1 芪茵颗粒活性成分和成分靶点的筛选

在TCMSP数据库获得QYKL基本药物（黄芪、茵陈、生山楂、补骨脂、泽泻、决明子、生大黄、三七）的成分，并根据口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、类药性（drug⁃likeness，DL）≥0.18为筛选条件进行筛选^［15］。因苦丁茶在TCMSP数据库未检索到，故用本草组鉴数据库检索苦丁茶活性成分和成分靶点^［16］。借助Swiss ADM平台以胃肠道吸收（GI absorption）得分为“high”，类药性（druglike⁃ness）至少通过2个“Yes”为标准作为TCMSP平台未找到的化学成分的补充^［17］，通过Uniprot数据库获取靶点的标准名称。

1.2.1.2 NAFLD疾病靶点的获取

以“Nonalcoholic fatty liver disease”和“Metabolic associated fatty liver disease”为检索词^［18］，在OMIM、GeneCards、NCBI和国家基因科学数据库中寻找疾病靶点。

1.2.1.3 韦恩图和蛋白质⁃蛋白质相互作用网络（PPI）构建

在Venny图网址中输入药物靶点和疾病靶点，制作韦恩图，并获得靶点的交集，导入STRING 数据库进行蛋白质相互作用网络的构建，得到蛋白质相互作用网络图。应用Cytoscape软件选择“Degree值”、“介度中心性Betweenness”、“接近中心性Closeness”^［19］，筛选3值大于中间值的靶点，取度值前10的靶点作为待选核心靶点。

1.2.1.4 GO和KEGG分析

使用DAVID在线平台和metascape在线平台对上述获得的相关核心靶点进行GO及KEGG 富集分析，将结果按P值由小到大排序，每项分析选取前15条作为核心通路^［20］。运用在线绘图平台微生信绘制GO及KEGG富集分析的气泡图。

1.2.1.5 分子对接

根据生信分析结果，在待选核心靶点中选择炎症、免疫相关通路靶点作为核心靶点与核心成分进行分子对接。从TCMSP数据库获得核心成分的mol2文件，从RCSB⁃PDB数据库中获得靶点的pdb文件，利用AutoDock Tool软件进行对接模拟，验证对应关系。最后通过PyMOL软件分析观察对接结果。

1.2.2 动物实验

1.2.2.1 造模与分组

选取36只6~8周龄雄性SD大鼠，体重（180±20） g，适应性饲养1周后，随机选取6只作为正常对照组（Control组），其余30只，通过喂养高脂饲料建立NAFLD模型。成功建立NAFLD大鼠模型后，将模型进一步分为5组，每组6只，模型组（HF组）、低剂量QYKL治疗组（HF+L组）、中剂量QYKL治疗组（HF+M组）、高剂量QYKL治疗组（HF+H组）、二甲双胍和硫普罗宁治疗组（HF+MT组）；QYKL灌胃HF+L组2.5 g/kg、HF+M组5 g/kg、HF+H组10 g/kg，HF+MT组二甲双胍20 mg/kg和硫普罗宁100 mg/kg。Control组和HF组每日等量生理盐水灌胃1次，每组大鼠连续灌胃30 d。

1.2.2.2 石蜡切片的制备

麻醉处死大鼠后，快速取出肝组织，一部分用4%多聚甲醛固定，一部分液氮冻存。多聚甲醛中4 ℃固定3 d。固定后的肝组织经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸泡，包埋。石蜡切片机切成3 μm厚的切片，贴附在载玻片上，60 ℃烘箱烘干2 h。

1.2.2.3 H&E染色

切片60 ℃烘箱烘1 h后经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水后，切片先用苏木精染液染色3 min，自来水冲洗返蓝5 min，1%盐酸乙醇分化3 s，自来水冲洗5 min，再用0.5%伊红染液染色3 min。染色完成后的切片经梯度酒精快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。

1.2.2.4 透射电镜

将肝组织切成1 mm³大小，迅速投入电镜固定液4 ℃固定，弃去固定液。0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗。1%的锇酸室温固定，组织梯度酒精脱水。丙酮∶812包埋剂=1∶1混合液渗透过夜，纯812包埋剂渗透过夜，60 ℃聚合。切片80 nm超薄。铀铅双染色（2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15 min）。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

1.2.2.5 TG

血清TG水平按照TG试剂盒说明书检测。

1.2.2.6 免疫组化

肝组织切片60 ℃烘箱烘1 h后经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，枸橼酸钠抗原修复液，过氧化物酶阻断剂，封闭山羊血清避光孵育，一抗孵育4 ℃过夜。次日室温复温，37 ℃下二抗孵育后DAB染液显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，自来水反蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封闭晾干后，电子显微镜观察拍照，Image Pro Plus 软件分析各组炎症指标的阳性表达率。

1.2.2.7 ELISA检测

按照ELISA试剂盒说明书检测血清TNF⁃α、IL⁃1β和IL⁃6的表达。

1.3 统计学处理

使用IBM SPSS Statistics软件27.0.1版本进行数据统计。所有计量数据采用\overline{x}\pm s表示。多组间比较采用单因素方差分析（One⁃way ANOVA），两两比较采用LSD⁃t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学及分子对接

2.1.1 芪茵颗粒活性成分和成分靶点

QYKL通过TCMSP和HERB数据库检索，共得到主要活性成分107种（黄芪20种、茵陈13种、生山楂6种、补骨脂11种、泽泻10种、决明子14种、生大黄16种、三七8种、苦丁茶9种），去重后得到332个潜在作用靶点。

2.1.2 NAFLD疾病靶点和交集靶点获取

在OMIM、Gene Cards、NCBI和国家基因科学数据库中分别检索疾病靶点。因Gene Cards检索靶点过多，取得分大于平均值的靶点；去重后获得3 942种靶点。使用Venny 2.1输入QYKL的332个靶点与NAFLD的3 974个靶点取交集，韦恩图所示获得210个交集靶点，见图1。

2.1.3 PPI网络图

将QYKL与NAFLD疾病交集的210个靶点导入到String数据库中，物种设置为Hoom SaPiens，获得蛋白互作网络图，靶点之间相互关联。用CytoscaPe 3.9.2软件进行可视化处理，将数据导入软件，对QYKL的有效成分构建“药物⁃有效成分⁃交集靶点”网络图得到图2，其中圆形表示活性成分，三角形表示药物，矩形表示交集靶点。去除关联性差的靶点得到184个关联性强的有效靶点，并进行拓扑分析计算出各节点的度值（degree），再按照度值对关键靶点进行排序，构建PPI网络图，见图3，颜色越深表示度值越大，取前10与治疗关系最密切的靶点，得到的图3中心的核心靶点，其中颜色最深度值越大，依次为IL⁃6、AKTI、TNF⁃α、IL‑1β、TP53、CASP3、ESR1、EGFR、JUN和BCL2等核心靶点。

2.1.4 GO和KEGG富集分析

利用Metascape数据库对上述获得的184个靶点进行GO富集分析。以P≤0.01的标准进行富集，共富集到2 066条生物学过程（biological Process，BP），246条分子功能（molecular function，MF）以及116条细胞组分（cellular comPonent，CC）。将排名前10的细胞组成、分子功能、生物过程利用在线绘图网站绘制柱状图^［21］。根据图4中气泡图可知生物学过程可能与细胞对氮化合物脂质的反应、对脂质多糖的反应、细胞对氮化合物的反应、细胞对有机环化合物的反应、细胞程序性死亡的正向调节等有关；细胞组分分析可能与囊泡腔、细胞质囊腔、转录调节复合物、分泌颗粒腔、受体复合体和质膜蛋白复合物等途径有关；分子功能可能与激酶结合、蛋白激酶结合、转录因子结合、丝氨酸水解酶活性、丝氨酸型内肽酶活性相关。

对以P≤0.01的标准进行富集进行KEGG富集分析，结果显示，共富集到212条信号通路。根据P值选取排名前15的通路，利用微生信在线平台绘制柱状图^［22］得到图5，根据图5 KEGG富集结果表明QYKL治疗NAFLD的机制可能与癌症的发病途径、乙型肝炎、人类巨细胞病毒感染、丙型肝炎、癌症中的蛋白聚糖、PI3K⁃AKT通路和炎症等途径密切相关。

2.1.5 分子对接

选取degree值排名前10并且与疾病相关性最大的3个关键靶点（AKT1、TNF⁃α、IL⁃6），分别与QYKL中度值最高的4个成分进行分子对接，对接结合能见表2。QYKL 3个活性成分与3个关键靶点的分子结合能全部小于-5 kcal/mol，说明分子间结合活性良好。可视化结果结合稳定，见图6。通过PyMOL进行分析。受体蛋白AKT与QYKL活性成分配体小分子相互结合，氨基酸残基LYS⁃268、SER⁃205、ILE⁃290、THR⁃211、SER⁃05、ASN⁃204、GLN⁃203与QYKL活性成分配体小分子形成氢键相互作用，维持和AKT之间的稳定构像。

2.2 动物实验

2.2.1 各组大鼠肝组织病理损伤及炎症浸润观察

Control组细胞结构正常无脂肪变性等情况；HF组呈现细胞大泡性脂肪变性，细胞胞浆内出现单个脂滴或少数圆形脂滴或孤立的大脂滴，这些脂滴将细胞核挤向细胞边缘使细胞结构改变，细胞内微泡性脂肪变性，细胞胞浆内挤满了微小脂泡，脂泡大小较均一，细胞核仍位于细胞中央，并且有大量的中性粒细胞浸润并且中性粒细胞聚集；HF+M组和HF+MT组炎性浸润较少，大泡性脂肪变性很少，有少量微泡性脂肪变性；HF+L组和HF+H组组织结构改变，呈现大量微泡性脂肪病变和大泡性脂肪病变，炎性浸润严重，见图7。

2.2.2 透射电镜

Control组结构正常有很少的小脂滴沉积，线粒体，内质网结构正常；HF组细胞核固缩细胞内充满大小脂滴，内质网结构异化，线粒体肿大；HF+M组和HF+MT组脂滴沉积较少，细胞结构正常，出现了脂滴自噬和线粒体自噬的现象；HF+L组和HF+H组同样脂滴沉积严重，细胞核固缩，细胞器结构变化。见图8。

2.2.3 甘油三酯和免疫组化

在Control组中，血清甘油三酯水平最低，而HF组则呈现明显升高，2组间差异具有统计学意义（P<0.01）。相较于HF组，HF+M组和HF+MT组的甘油三酯水平均有大幅度下降，且这种差异具有统计学意义（P<0.01）。免疫组化分析结果进一步揭示，HF组的IL⁃6阳性表达水平相较于Control组有明显提升（P<0.01）；HF+M组和HF+MT组的IL⁃6阳性表达水平相较于HF组则明显降低（P<0.01）。HF组的TNF⁃α阳性表达水平明显高于Control组（P<0.01）。HF+M组的TNF⁃α阳性表达水平相较于HF组明显降低（P<0.01），并且其表达水平低于HF+MT组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3、图9。

2.2.4 ELISA

与Control组相比，HF组的TNF⁃α表达水平明显上升（P<0.01）。HF+M组和HF+MT组与HF组对比，TNF⁃α的表达水平明显降低（P<0.01），这2个组与Control组的TNF⁃α表达水平则无明显差异（P>0.05）。HF组的IL⁃6表达水平明显高于Control组（P<0.01），而HF+M组和HF+MT组的IL⁃6表达水平相较于HF组有明显下降（P<0.01）。此外，Control组的IL⁃1β表达水平明显低于HF组（P<0.01），HF+M组和HF+MT组的IL⁃1β表达水平相较于HF组则明显降低（P<0.01）。见表4。

3 讨论

本研究通过PPI网络分析，预测了QYKL作用于NAFLD的核心靶点如AKT1、TNF⁃α、IL⁃6等。通过GO和KEGG富集分析结果得出其可能与PI3K⁃AKT、脂质代谢、乙型肝炎、丙型肝炎、肝细胞癌等信号通路相关。这些通路在维护肝脏功能中起着不容忽视的作用。其中PI3K⁃AKT通路是胰岛素信号传导的核心，调控肝细胞的葡萄糖摄取、脂质合成与分解。PI3K⁃AKT信号通路被抑制会导致脂肪堆积和脂代谢异常^［23］。

分子对接研究表明，QYKL的主要成分与AKT1、TNF⁃α、IL⁃6结合力强，结合能均小于-5 kcal/mol。其中，槲皮素、山奈酚和β⁃谷甾醇与AKT1的结合能力尤为突出。AKT1作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K通路的核心介质，在葡萄糖代谢、细胞凋亡、增殖、转录、迁移和炎症等众多细胞过程中发挥关键作用，且能响应胰岛素生长因子和表皮生长因子^{［25，26］}。当AKT1活性不足时，脂肪酸氧化受抑制，甘油三酯合成增加，加重肝细胞脂肪变性^［27］。IL⁃6是由免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞）和脂肪细胞分泌的多效性细胞因子，可上调固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP⁃1c）表达，促使脂肪酸和甘油三酯合成增加^［28］。TNF⁃α则是主要由巨噬细胞和脂肪细胞分泌的促炎细胞因子，它通过抑制胰岛素受体底物（IRS）的酪氨酸磷酸化，干扰胰岛素信号（如PI3K⁃AKT通路）^［29］，加重胰岛素抵抗和脂代谢紊乱。AKT1功能降低不仅导致胰岛素抵抗和脂质堆积，还会激活Kupffer细胞释放TNF⁃α和IL⁃6。而TNF⁃α和IL⁃6又会进一步抑制AKT1活性（通过IRS磷酸化阻断），形成“代谢失调→炎症→代谢恶化”的正反馈环路。此外，TNF⁃α和IL⁃6还能通过线粒体途径（如ROS生成）和内质网应激（如CHOP激活）诱导肝细胞凋亡^{［30，31］}。AKT1活性不足时抗凋亡信号减弱，加剧肝细胞死亡和纤维化。分子对接研究显示，AKT1、TNF⁃α、IL⁃6很可能是QYKL治疗NALD的主要靶点。

动物实验研究表明，QYKL能明显降低NAFLD大鼠的炎症水平。甘油三酯检测结果说明NAFLD甘油三酯水平明显升高，QYKL可以降低甘油三酯水平。观察动物病理切片发现，HF+M组QYKL明显改善了脂肪对肝细胞的破坏，减少了炎性浸润。透射电镜结果进一步表明，NAFLD致使肝细胞结构明显受损，细胞内被脂滴大量占据，线粒体和内质网结构遭破坏，细胞核固缩；而经QYKL干预后，肝细胞结构恢复正常，脂滴明显减少，细胞器结构也相对恢复正常。基于透射电镜研究发现，NAFLD对机体的影响是多方面的。脂肪堆积并非简单的初步现象，它会进一步破坏机体正常代谢功能，损害肝细胞的结构与功能，严重影响线粒体、内质网等细胞器的结构和功能。值得注意的是，QYKL不仅能够减少脂滴沉积，降低脂肪堆积，还可以恢复线粒体、内质网等细胞器的超微结构，逆转代谢功能障碍。这一结果提示QYKL在NAFLD治疗中具有“标本兼治”的潜力。免疫组化和ELISA结果也证明QYKL可以降低TNF、IL⁃6和IL⁃1β等炎症因子的表达水平，表明其具有明确的抗炎效应。

综上所述，QYKL通过多靶点、多通路协同，有效改善NAFLD大鼠的脂质代谢紊乱、炎症反应以及肝细胞超微结构损伤。其核心机制可能涉及PI3K⁃AKT介导的脂解增强、抑制炎症因子缓解炎症，还有线粒体⁃内质网功能恢复驱动的代谢稳态重建。这些发现为调控NAFLD提供了重要理论依据，为QYKL应用于NAFLD治疗奠定科学基础；基于这些研究与发现，课题组提出QYKL能否通过改善线粒体和内质网结构和功能降低脂肪堆积这一问题，也为后续深入探究其作用机制开辟道路。

作者贡献度说明：

胡锋杰、王彦顺：参与整个实验过程，对研究数据进行分析，并进行了文章初稿的撰写及文章修改；周英、曹峰铭、姚秋月：实验整体把控，指导文章撰写及文章修改等。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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