基于HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3通路探讨顾步汤治疗糖尿病足溃疡的作用机制

Exploring the mechanism of Gubu Decoction in treating diabetes foot ulcer based on HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3 pathway

摘要

目的 探讨顾步汤通过调控HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3通路改善糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）愈合的作用机制。 方法 构建C57BL/6J小鼠DFU模型，随机分为模型组和顾步汤低、中、高剂量组，每组10只，另取10只小鼠设为空白组，连续给药14 d。给药结束后，采用H&E染色和Masson染色观察溃疡组织病理形态和胶原沉积，EdU标记免疫荧光检测溃疡组织成纤维细胞增殖，TUNEL检测溃疡组织成纤维细胞凋亡，ELISA检测溃疡组织中炎症因子（TNF‑α、IL‑6、IL‑10）及氧化应激（MDA、SOD、GSH‑PX）水平，Western blot检测HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3通路相关蛋白表达。 结果 与模型组相比，顾步汤可明显降低溃疡组织中炎性细胞浸润，增加溃疡组织中胶原纤维、肉芽组织及新生毛细血管的数量，减少成纤维细胞增殖率，降低ROS阳性细胞率，成纤维细胞凋亡数量，IL‑6、TNF‑α水平，MDA含量，HIF‑1α、TGF‑β1、TβR1及p‑Smad3蛋白表达，升高IL‑10水平，SOD、GSH‑PX含量（P<0.01）。 结论 顾步汤可降低DFU炎症及氧化应激水平，激活HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3通路，促进成纤维细胞生成，改善溃疡组织愈合。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Gubu Decoction （GBD） in improving the healing of diabetes foot ulcer （DFU） by regulating HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3 pathway. Methods The C57BL/6J mouse DFU model was constructed and randomly divided into a model group and GBD low， medium， and high dose groups， with 10 mice in each group. Another 10 mice were selected as the blank group， and all mice were treated continuously for 14 days. After administration， H&E staining and Masson staining were used to observe the pathological morphology and collagen deposition of ulcer tissue. EdU labeled immunofluorescence was used to detect fibroblast proliferation in ulcer tissue， TUNEL was used to detect fibroblast apoptosis in ulcer tissue， ELISA was used to detect the levels of inflammatory factors （TNF‑α， IL‑6， IL‑10） and oxidative stress （MDA， SOD， GSH‑PX） in ulcer tissue， and Western blot was used to detect the expression of HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3 pathway related proteins. Results Compared to the model group， GBD significantly reduced inflammatory cell infiltration in ulcer tissue， increased the number of collagen fibers， granulation tissue， and newly formed capillaries in ulcer tissue， reduced fibroblast proliferation rate， decreased ROS positive cell rate， fibroblast apoptosis， IL‑6， TNF‑α levels， MDA content， HIF‑1α， TGF‑β1， TβR1， and p‑Smad3 protein expression， increased IL‑10 levels， SOD， and GSH‑PX content （P<0.01）. Conclusion GBD can reduce DFU inflammation and oxidative stress levels， activate the HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3 pathway， promote fibroblast generation， and improve ulcer tissue healing.

Graphical abstract

关键词

顾步汤 / 糖尿病足溃疡 / HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3信号通路 / 创面愈合

Key words

Gubu Decoction / Diabetic foot ulcers / HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3 signaling pathway / Wound healing

糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是一种常见且严重的糖尿病并发症，主要表现为足部的溃疡及感染，最终导致截肢甚至死亡。根据世界卫生组织的一组研究数据显示，大约15%~25%的糖尿病患者在其一生中会发展为足部溃疡，其中14%~24%的患者存在截肢的风险^［1］。DFU发病机制复杂，涉及神经病变、血液循环障碍及感染等多种病理因素，且愈合过程常常受阻，临床治疗难度较大^［2］，严重影响患者的生活质量^［3］，给患者和医疗系统造成沉重的经济负担^［4］。

成纤维细胞作为一种基质细胞，其主要作用是参与炎症调控，在溃疡组织修复的增殖阶段，成纤维细胞会迁移至溃疡局部，形成新生肉芽组织^［5］。同时，成纤维细胞还能够分泌多种生长因子，增强胶原合成，加速溃疡愈合。此外，缺氧诱导因子1‑α（hypoxia inducible factor‑1α，HIF‑1α）在DFU的发生、发展中扮演着重要角色。糖尿病患者的足部溃疡常伴随缺氧和炎症反应，HIF‑1α的缺失会导致血管生成受限、细胞代谢紊乱和细胞凋亡增加，加重溃疡的病理过程^［6］。课题组前期研究证实，顾步汤能够刺激巨噬细胞M2极化，促进成纤维细胞的增殖和迁移，但其具体机制尚待深入探讨^［7］。本研究将通过链脲佐菌素的腹腔注射建立C57BL/6J小鼠的糖尿病模型，并在此基础上建立小鼠的DFU模型，通过观察顾步汤对HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3信号通路的调控作用，以揭示顾步汤促进DFU愈合的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

本研究选用50只C57BL/6J小鼠，所有实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证编号为SCXK（京）2019‑0033。饲养条件方面，实验环境的室温维持在21~25 ℃，湿度则控制在36%~46%之间。小鼠可自由获取食物和饮水，并按照昼夜交替的方式提供光照。所有实验操作严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》^［8］。实验研究伦理审批号：2023033104。

1.1.2 药物与试剂

顾步汤的组成：黄芪30 g、石斛30 g、当归30 g、金银花30 g、牛膝30 g、紫花地丁30 g、菊花15 g、人参9 g和甘草9 g，由河南中医药大学第一附属医院的制剂室进行制备。在制备过程中，首先采用武火煮沸30 min以提取200 mL药液；添加水进行二次煮沸，采用文火煮30 min，再次提取200 mL药液。经过最后浓缩处理，最终获得100 mL药液，并在4 ℃的环境中进行保存。

苏木素‑伊红（H&E）染色试剂盒（北京索莱宝科技，批号：G1120）、Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技，批号：G1340）；DMEM培养基（Thermo，批号：11995073）；FBS（Gibco，批号：10099141）、白细胞介素‑6（interLeukin‑6，IL‑6）、白细胞介素‑10（interLeukin‑10，IL‑10）和肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）ELISA检测试剂盒购于江苏酶免实业有限公司（货号分别为MM‑0190R2、MM‑0195R2和MM‑0132M1）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（上海碧云天生物，批号S0131S）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（上海碧云天生物，批号：S0087）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH‑PX）检测试剂盒（上海碧云天生物，批号：S0073）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物，批号：C1091）；EdU细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物，批号：C0071S）；活性氧（reactive oxygen species， ROS）试剂盒（南京建成生物，批号：E004‑1‑1），HIF‑1α一抗、转化生长因子‑β1（TGF‑β1）一抗、TβR1一抗、p‑Smad3一抗、Smad3一抗、GAPDH一抗、HRP标记的二抗、ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、荧光素标记山羊抗兔二抗和山羊抗兔IgG购于美国Abcam公司（货号分别为ab51608、ab215715、ab71985、ab52903、ab40854、ab8245、ab6728、ab65623、ab309514、ab6858和ab172730）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与模型制备

C57BL/6J小鼠顺应性喂养1周后，并随机分为空白组、模型组及顾步汤低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组各10只小鼠。除空白组，其余组别均通过腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素来建立糖尿病模型。经过3周的观察，血糖值超过16.7 mmol/L被视为模型成功的标志。在此基础上，使用1%戊巴比妥钠（剂量为100 mg/kg）进行腹腔麻醉，并制作1.5 cm×1.5 cm的全层皮肤缺损创面，随后采用生理盐水纱布进行止血。在模型成功建立后，构建C57BL/6J小鼠DFU模型，顾步汤低、中、高剂量组分别予0.89、1.78、3.55 g/kg顾步汤浓缩液灌胃治疗，空白组与模型组均以3.55 g/kg蒸馏水灌胃^［7］。每日灌胃1次。持续7 d，治疗周期为两周。

1.2.2 成纤维细胞的分离与培养

当溃疡组织周围的细胞增殖达到0.5~1 cm时，应用0.125%胰蛋白酶进行8 min消化处理，随后收集细胞并进行离心分离。接着，向细胞中添加含10%胎牛血清的DMEM培养基，并将其置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中进行培养。对于原培养瓶中的细胞，先用D‑Hank's液进行洗涤，然后加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化时间设定为3~4 min，随后再次收集细胞并进行离心处理。最后，添加无血清培养基，并在37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱中继续进行培养。培养后第2天进行1次液体更换，之后每隔2 d更换1次培养液。

1.2.3 H&E染色

取小鼠溃疡组织样本，并将其在4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。随后，依据标准化程序进行组织脱水、包埋及切片处理。利用二甲苯对样本进行透明化，并实施梯度乙醇脱水。接着，进行伊红染色，并用双蒸水进行清洗。随后，进行苏木精染色，之后再次用双蒸水进行清洗，最后使用中性树胶进行封片处理。操作完成后，将样本置于显微镜下进行观察与分析。

1.2.4 Masson染色

将固定于4%多聚甲醛中的溃疡组织处理后，嵌入石蜡中，并切割成厚度为5 μm切片。使用Masson三色试剂盒进行染色，以观察纤维化在溃疡组织中的积累情况。最后，采用荧光显微镜进行拍摄，并进行纤维化分析。

1.2.5 TUNEL法检测

各组成纤维细胞在培养48 h后进行离心，重悬至1×10⁶个/mL。随后，向细胞悬液中添加5 μL膜联蛋白V‑异硫氰酸荧光素和5 μL碘化丙啶，并在暗室中孵育15 min。将成纤维细胞接种于24孔板内，放置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中继续孵育24 h，以确保细胞完全贴壁。细胞贴壁后，按照实验组别对其进行药物处理。使用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）进行标记，各样本逐一添加标记缓冲液以保持湿润，在18 μL的标记缓冲液中充分摇匀。吸除DAPI染色废液，并用PBS缓冲液反复洗涤3次，每次5 min。最后，通过荧光显微镜观察荧光标记细胞的数量，以评估TUNEL阳性细胞的凋亡情况。

1.2.6 EdU法检测

将成纤维细胞以每孔1×10⁵个的密度均匀接种于24孔培养板中。待细胞完全贴壁后，向培养基中加入50 μmol/L的EdU，并孵育2 h。随后，使用Apollo和Hoechst 33342进行染色，并通过荧光显微镜观察成纤维细胞的变化。采用ImageJ软件对染色结果进行定量分析。

1.2.7 活性氧（ROS）检测

将成纤维细胞以每孔1×10⁵个的密度均匀接种于24孔培养板中，0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min，离心5 min，弃上清；加1 mL PBS缓冲液将细胞沉淀，洗涤1次。以1 500 r/min，再次进行离心5 min，弃上清；用50 mg DCFH‑DA加入DMSO 0.1 mL，充分溶解，配制成1 mol/mL的储存液；将DCFH‑DA储存液加入成纤维细胞培养基，稀释为终浓度10 μmol/L的DMSO工作液，摇匀被离心的成纤维细胞；将离心好的成纤维细胞，置于37 ℃培养箱中，孵育20 min。设置阳性对照组，加入阳性对照试剂并刺激成纤维细胞，采用激光共聚焦倒置显微镜（激发波长488 nm，发射波长525 nm）进行观察并拍摄照片。显微镜下，蓝色荧光代表细胞核，而核内的红色荧光则表示ROS阳性表达。使用ImageJ软件对平均光密度值进行计算。

1.2.8 ELISA法检测

取小鼠溃疡组织样本，使用冷冻研磨仪对组织进行充分匀浆处理，随后以3 000 r/min的速度离心20 min，收集上清液。利用ELISA试剂盒测定各组溃疡组织中IL‑6、IL‑10、TNF‑α、MDA、SOD、GSH‑PX的水平，具体实验操作步骤应严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.9 Western blot 检测

将100 mg溃疡组织置于冰上使用RIPA裂解液进行匀浆处理，随后在4 ℃下以12 000 r/min，离心10 min，收集上清。对上清液进行Nanodrop定量分析后，按照30 μg的标准准备样品，并进行煮沸处理以备后用。采用BCA法测定提取的蛋白质浓度。在对提取的蛋白质进行100 ℃、5 min的变性处理后，进行电泳、转膜以及封闭步骤。加入HIF‑1α（1∶1 000）、TGF‑β1（1∶1 000）、TβR1 （1∶1 000）、p‑Smad3（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）及GAPDH（1∶1 000）一抗，孵育过夜。第2天加入二抗孵育2 h，ECL显影。TBST洗膜后加入ECL显影，化学发光检测系统拍照后分析HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3信号通路相关蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学处理

本研究所涉及的所有统计学数据通过SPSS 26.0软件进行分析。其中，多组组间比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠溃疡组织病理情况观察

各组小鼠溃疡组织的病理学变化比较，空白组溃疡组织中观察到大量的胶原纤维，同时伴随着新形成的肉芽组织和毛细血管的出现，且炎性细胞浸润仅呈现少量存在。模型组中溃疡组织则表现出明显的炎性细胞浸润，胶原纤维、肉芽组织及新生毛细血管的数量明显减少。而顾步汤各剂量组的溃疡组织中炎性细胞浸润较模型组明显降低，胶原纤维、肉芽组织及新生毛细血管的数量则明显增加。其中，以顾步汤高剂量组的变化最为明显，见图1。

2.2 顾步汤对成纤维细胞凋亡的影响

与空白组相比，模型组成纤维细胞凋亡细胞数增加（P<0.01）；与模型组相比，顾步汤各剂量组成纤维细胞凋亡数量降低，且顾步汤高剂量组细胞凋亡数量最低（P<0.01）。见图2A、B。

2.3 顾步汤对成纤维细胞增殖的影响

与空白组相比，模型组EdU阳性细胞率升高（P<0.01）；与模型组相比，顾步汤各剂量组EdU阳性细胞率下降，且顾步汤高剂量组EdU阳性细胞率下降最为明显（P<0.01）。见图3A、B。

2.3 成纤维细胞ROS检测结果

与空白组相比，模型组ROS阳性细胞率升高（P<0.01）；与模型组相比，顾步汤各剂量组ROS阳性细胞率下降，且顾步汤高剂量组ROS阳性细胞率下降最为明显（P<0.01）。见图4A、B。

2.4 顾步汤对溃疡组织炎症因子的影响

与空白组相比，模型组溃疡组织中IL‑6和TNF‑α的含量明显升高，IL‑10的含量明显下降（P<0.01）。与模型组相比，顾步汤各剂量组中IL‑6和TNF‑α的含量明显下降，IL‑10的含量明显升高（P<0.01）。见图5A‑C。

2.5 顾步汤对氧化应激指标的影响

与空白组相比，模型组溃疡组织中MDA含量明显升高，SOD、GSH‑PX含量明显下降。与模型组相比，顾步汤各剂量组中MDA的含量明显下降，SOD、GSH‑PX的含量明显升高（P<0.01）。见图6A‑C。

2.6 顾步汤对HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3信号通路相关蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组HIF‑1α、TGF‑β1、TβR1及p‑Smad3表达升高，差异具有统计学意义（P<0.01），而t‑Smad3表达未见明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组相比，顾步汤各剂量组HIF‑1α、TGF‑β1、TβR1及p‑Smad3表达降低（P<0.01），而t‑Smad3表达未见明显变化，差异无统计学意义（P>0.01）。见图7A‑E、8。

3 讨论

氧化应激是指体内活性氧与抗氧化剂之间的不平衡，导致细胞及组织出现损伤的病理过程。DFU作为糖尿病患者常见且严重的并发症，其发生、发展与氧化应激密切相关，氧化应激会导致足部血流不畅、神经病变和免疫功能下降，加重溃疡的形成^［9］。此外，氧化应激还能导致成纤维细胞凋亡、炎症反应及足部微循环障碍，不仅直接影响DFU愈合，还可能通过影响血管生成、胶原合成和成纤维细胞增殖等过程，间接导致创面愈合不良^［10］。现已证实，细胞内存在多种抗氧化防御机制，以保护细胞免受氧化应激的损害。这些机制主要包括酶类、抗氧化剂和小分子抗氧化剂。抗氧化剂通过清除体内的ROS，减轻氧化损伤，维持细胞的正常功能，增强抗氧化防御机制，改善DFU的愈合^［11］。而糖尿病患者的高血糖状态会导致体内ROS的过量产生，这些ROS会对细胞造成氧化损伤，引起细胞外基质的降解，影响新生血管的形成，从而导致局部缺血和缺氧，影响溃疡组织的结构和功能，进一步加重溃疡的形成和发展^［12］。因此，控制氧化应激的水平，可能是改善DFU愈合的重要策略。

HIF‑1α作为一种关键的转录因子，可通过调节一系列基因的表达来帮助细胞适应低氧环境，从而促进细胞存活、增殖和代谢。在糖尿病患者中，由于长期处于高血糖和缺氧状态，HIF‑1α的功能受到抑制，导致组织修复能力下降，从而加重DFU病理过程^［13］。TGF‑β1的表达在DFU发病过程中通常受到调节并呈现出异常的变化。TGF‑β1不仅促进成纤维细胞增殖和迁移，还在调节炎症反应和纤维化过程中发挥重要作用。相关研究证实，TGF‑β1的补充能够改善糖尿病小鼠的伤口愈合^{［14，15］}。TGF‑β1在炎症反应中起着双重作用。一方面，它能够抑制炎症细胞的活性，减轻局部炎症反应；另一方面，TGF‑β1也促进成纤维细胞的活化和胶原合成，从而促进伤口愈合。在DFU的愈合过程中，TGF‑β1的表达与炎症因子的水平密切相关。高糖环境下，TGF‑β1的信号通路可能受到抑制，导致炎症因子如IL‑6和TNF‑α的过度表达，加重伤口的炎症反应，延缓愈合进程^{［16，17］}。Smad3是TGF‑β信号通路中的关键效应因子，其激活通常依赖于TGF‑β与其受体结合后引发的磷酸化过程。Smad3的磷酸化使其能够与Smad4形成复合物，并转移至细胞核中，调控多种基因的转录。这一过程在多种生理和病理状态下发挥重要作用，包括细胞增殖、分化及纤维化等^{［18，19］}。在DFU的背景下，Smad3的激活可能通过调节细胞外基质（ECM）的重塑和炎症反应来影响伤口愈合过程^［20］。因此，HIF‑1α、TGF‑β1和Smad3信号通路之间的交叉调控在多种生理和病理过程中具有重要意义。HIF‑1α调控多种基因的表达，不仅可以直接影响TGF‑β1的表达，还能通过调节相关的转录因子和信号通路增强TGF‑β1的功能。TGF‑β1则通过其受体激活Smad3，从而促进成纤维细胞的增殖和迁移。这种相互作用在DFU的病理机制中尤为重要，因为糖尿病患者常常伴随缺氧状态，HIF‑1α的上调可能加剧TGF‑β1的作用，导致成纤维细胞过度增殖和迁移，影响伤口愈合的过程^［21］。因此，针对这一信号通路的干预可能为糖尿病足溃疡的治疗提供新的思路。

顾步汤作为临床治疗DFU的经典方剂，方中黄芪、当归、人参补益气血，金银花、石斛、蒲公英、紫花地丁清热解毒，佐以牛膝引药下行，缓解下肢疼痛，以甘草为使，既能调和诸药，又可清热解毒、缓急止痛，共奏补气活血、滋阴解毒之功。研究证实，顾步汤治疗DFU的药理机制主要体现在抗炎、促进血液循环和促进组织修复方面。首先，顾步汤能够明显降低糖尿病足患者局部的炎症反应，抑制相关炎症因子（TNF‑α和IL‑6）释放，减轻局部炎症^［22］。其次，顾步汤能够通过调节局部微环境，促进成纤维细胞增殖和迁移，促进胶原蛋白合成，这是伤口愈合的关键步骤^{［23，24］}。再次，顾步汤中的活性成分可以增强血管生成，改善局部血液供应，从而为伤口愈合提供充足的氧气和营养物质^［25］。顾步汤中的某些成分能够扩张血管，降低血液黏稠度，改善血流动力学^［26］。此外，研究表明，顾步汤可能通过刺激内皮细胞的功能，促进血管生成因子释放，从而增强新生血管形成，改善局部微循环^［27］。本研究结果显示，经顾步汤干预后，可明显降低溃疡组织中炎性细胞浸润，增加溃疡组织中胶原纤维、肉芽组织及新生毛细血管的数量，减少成纤维细胞增殖率及ROS阳性细胞率，降低成纤维细胞凋亡数量，并能提高HIF‑1α、TGF‑β1、TβR1及p‑Smad3蛋白表达水平，这与上述前人研究结果一致。

综上所述，基于前期研究证实，进一步阐释了顾步汤在改善DFU中的分子机制及其相关作用靶点。研究结果表明，顾步汤可降低DFU炎症及氧化应激水平，激活HIF‑1α/TGF‑β1/Smad3信号通路，促进成纤维细胞生成，改善溃疡组织愈合，从而达到治疗本病的目的。

作者贡献度说明：

王继雪：设计实验，文稿撰写；袁星星、夏联恒：执行细胞实验和指标检测；杨稀瑞，王思琦：负责统计分析；周涛，燕树勋：进行最后校审。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82205195)

国家自然科学基金(82205117)

河南省博士后科研项目(HN2024080)

河南省博士后科研项目(HN2024083)

河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ2024067)

河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ20230686)

河南省中医临床研究基地科研专项(2022JDZX127)

河南省中医临床研究基地科研专项(2022JDZX135)