ANXA2通过抑制自死亡从而改善心肌细胞缺氧/复氧损伤的实验研究

ANXA2 ameliorates hypoxia/reoxygenation injury of cardiomyocytes by inhibiting autosis

摘要

目的 自死亡作为一种自噬依赖性细胞死亡形式，在心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）中发挥“促生存”和“促死亡”的矛盾作用。基于自死亡途径，本研究旨在探讨膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）对MIRI的影响及机制。 方法 使用心肌细胞缺氧再复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤模型模拟MIRI，构建靶向干预ANXA2的shRNA（shANXA2），采用CCK‑8法检测细胞活力，通过共聚焦显微镜观察自噬小体、自噬溶酶体比例，使用Western blot检测自死亡相关蛋白表达。 结果 ANXA2在心肌细胞H/R损伤后表达明显升高，下调ANXA2表达后转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）核内表达增加，自噬小体比例降低，溶酶体比例升高，细胞活力恢复。Western blot结果显示，下调ANXA2可降低ANXA2、p62和LC3Ⅱ的蛋白水平，上调TFEB核内表达。 结论 ANXA2通过抑制TFEB的表达和核易位，影响自噬通量和自死亡发生，加剧心肌细胞H/R损伤。下调ANXA2可促进自噬通量，减少自死亡发生，从而减轻MIRI。本研究为ANXA2作为治疗MIRI的潜在靶点提供了实验依据。

Abstract

Objective Autosis， as a form of autophagy dependent cell death， plays a contradictory role in promoting survival and promoting death in myocardial ischemia‑reperfusion injury （MIRI）. The aim of this study was to investigate the effect of annexin A2 （ANXA2） on MIRI and its mechanism by means of autosis. Methods Cell hypoxia/reoxygenation （H/R） injury model was used to simulate MIRI， shRNA （shANXA2） targeting intervention was constructed， cell activity was detected by CCK‑8， the ratio of autophagosome to autophagolysosome was observed by confocal microscopy， and autosis related protein expression was detected by Western blot. Results The expression of ANXA2 was significantly increased in cardiomyocytes after H/R injury， the expression of transcription factor EB （TFEB） was increased after downregulating ANXA2 expression， the proportion of autophagosomes was decreased， the proportion of lysosomes was increased， and cell viability was restored. Western blot results showed that down‑regulation of ANXA2 decreased the levels of ANXA2， P62 and LC3II， and up‑regulated the expression of TFEB. Conclusions ANXA2 inhibits the expression of TFEB and nuclear translocation， affects autophagy flux and the occurrence of autosis， and aggravates the H/R injury of cardiomyocytes. Down‑regulation of ANXA2 promotes autophagy flux and reduces the occurrence of autosis， thereby alleviating MIRI. This study provides experimental evidence for ANXA2 as a potential target for the treatment of MIRI.

Graphical abstract

关键词

自死亡 / 心肌缺血再灌注损伤 / 膜联蛋白A2（ANXA2） / 转录因子EB（TFEB） / 自噬通量

Key words

Autosis / Myocardial ischemia‑reperfusion injury / Annexin A2 （ANXA2） / Transcription factor EB （TFEB） / Autophagic flux

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI），作为急性心肌梗死（acute myocardial infraction，AMI）患者接受再灌注治疗时面临的主要病理生理障碍，明显影响临床治疗效果，其机制涉及组织水肿、心肌功能抑制（即心肌顿抑）、心电活动异常、炎症反应激活及氧化应激加剧等多个方面^［1，2］。在MIRI过程中，自噬现象呈现出双刃剑效应，既具有促进细胞存活的积极作用，也存在加剧细胞死亡的现象。在MIRI初期，自噬通过降解细胞内组分生成氨基酸和ATP，为细胞提供必要的生存条件；而在再灌注晚期，自噬过度激活导致大量自噬小体产生，进而触发细胞死亡，这一过程被形象地称为“自死亡”^［3］。既往研究表明，抑制或促进细胞自噬能在一定程度上减轻MIRI的损伤。然而，如何精确调控自噬过程，以最小化“自死亡”事件的发生，同时最大化地发挥自噬的细胞保护作用，仍是当前临床上所面临的主要挑战^［4‑6］。

近年来，膜联蛋白A2（annexin A2，ANXA2）作为新的研究热点，被揭示在细胞质中能锚定并调控溶酶体基因生发转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）的活性，阻止其被激活后进入细胞核并进一步影响自噬、溶酶体功能及细胞存活相关基因的转录调控^［7］。本研究拟采用心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型模拟MIRI，通过构建针对性的shRNA干预ANXA2的表达水平，深入探究ANXA2对MIRI中自死亡的影响及其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 ANXA2重组干扰质粒构建

ANXA2重组干扰质粒（shANXA2）和阴性对照质粒（Scramble）购于上海吉凯基因公司。设计正反干扰非编码小RNA序列，可通过RNA干扰来抑制ANXA2基因的表达。

1.2 实验分组

1.2.1 心肌细胞H/R模型构建

利用安宁包和缺氧箱建立细胞H/R模型。处理细胞后，用PBS清洗并换入无血清低糖培养基，放入安宁包缺氧箱。缺氧箱中的安宁包吸收氧气，维持0.1%的O₂、5%的CO₂和pH稳定。缺氧指示剂变色后，迅速放入细胞板/皿，37 ℃孵育4 h。取出后换完全培养基，再培养12 h。对照组正常培养16 h。模型建立后收集细胞。

1.2.2 细胞实验分组

提取C57BL/6乳鼠原代心肌细胞，并进行处置。Control组：正常培养基孵育6 h；H/R组：缺氧2 h，复氧4 h；H/R+Scramble组：阴性质粒转染心肌细胞+缺氧2 h，复氧4 h；H/R+shANXA2组：shANXA2转染心肌细胞+缺氧2 h，复氧4 h。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 心肌细胞活力检测

将心肌细胞以5×10³/孔的密度接种于96孔板中，每组做5个复孔，每孔加入100 μL的完全培养基进行培养，按上述方法进行病毒感染和H/R模型建立。复氧结束后，向每孔缓慢加入10 μL CCK‑8试剂，置于培养箱中孵育2~4 h后，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.3.2 共聚焦显微镜观察自噬小体、自噬溶酶体

使用mRFP‑GFP‑LC3腺相关病毒以MOI 20感染原代心肌细胞2 h后换液，继续培养24~48 h，然后进行实验操作。mRFP标记LC3，追踪其分布。GFP对酸性环境敏感，自噬体与溶酶体融合后，GFP荧光减弱，仅检测到红色荧光，指示自噬溶酶体形成。红色斑点代表自噬溶酶体，黄色斑点代表自噬体。使用ImageJ软件定量分析绿色斑点、红色斑点以及黄色斑点的数量。

1.3.3 蛋白表达检测

采用Western blot法检测心肌组织中相关蛋白的表达^［8］。根据目的蛋白的分子量大小，配置合适浓度SDS‑PAGE凝胶，经电泳、转膜后置于含5%脱脂奶粉的TBST液中进行封闭，一抗4℃孵育过夜，洗膜，二抗继续孵育2 h，再次洗膜，ECL显色。以β‑actin为内参计算上述蛋白的相对表达量。

1.4 统计学处理

使用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，使用单因素方差分析比较多组间差异，进一步使用最小显著差异法比较两组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 检测ANXA2在心肌细胞H/R损伤中的变化

使用CCK‑8试剂盒检测心肌细胞活力发现，与Control组相比，H/R组的心肌细胞活力明显下降，并伴随着ANXA2的蛋白表达明显升高（P<0.05）。使用shANXA2质粒靶向抑制ANXA2表达可见，与H/R+Scramble组相比，H/R+shANXA2组中ANXA2表达明显降低，且心肌细胞活力明显升高（P<0.05），见图1A、B。

2.2 下调ANXA2对心肌细胞H/R损伤诱导的自噬通量的影响

使用共聚焦显微镜观察各组mRFP‑GFP‑LC3荧光表达情况，红色荧光表示自噬溶酶体，黄色荧光表示自噬小体。与Control组相比，H/R组中尽管自噬溶酶体数量有所增多，但自噬溶酶体/自噬小体比值明显降低（P<0.05），提示自噬通量受阻。与H/R+Scramble组相比，抑制ANXA2的表达可明显增加自噬溶酶体数量，同时明显提高了自噬溶酶体/自噬小体比值（P<0.05）。以上结果显示，H/R损伤可上调ANXA2表达并阻断自噬通量，而下调ANXA2表达则可明显促进自噬通量，见图2A、B。

2.3 下调ANXA2对心肌细胞H/R损伤中自死亡的影响

检测各组心肌细胞中自死亡相关蛋白表达情况。H/R组与Control组相比，H/R组细胞质中的ANXA2、P62、LC3Ⅱ的蛋白表达升高，TFEB的蛋白表达降低（P<0.05），而与H/R+Scramble组相比，H/R+shANXA2组的细胞质中ANXA2、P62、LC3Ⅱ的蛋白表达降低，TFEB的蛋白表达升高（P<0.05）。以上结果显示，下调ANXA2可有效减轻由H/R诱导自噬通量受阻所致的自死亡，见图3A~E。

2.4 下调ANXA2促进TFEB转位入核

既往研究表明ANXA2可调控TFEB的核转位，因此分离细胞核蛋白检测n‑TFEB在细胞核内的表达量。与Control组相比，H/R组中n‑TFEB表达量明显降低（P<0.05），而与H/R+Scramble组相比，H/R+shANXA2组中n‑TFEB表达量则明显升高（P<0.05）。该结果表明，在H/R损伤过程中TFEB入核量明显减少，而下调ANXA2可明显增加TFEB的核转位，见图4A、B。

3 讨论

本研究发现，在心肌细胞经历H/R损伤时，ANXA2的表达水平明显上调，而TFEB的核内定位则明显减少。通过特异性下调ANXA2的表达，发现TFEB在细胞核内的表达量明显增加。利用共聚焦显微镜技术，发现H/R损伤过程中自噬小体的数量及占比明显上升，同时溶酶体的比例相应下降，导致细胞活力明显降低。然而，当ANXA2的表达被下调后，溶酶体的数量及比例明显回升，自噬小体的比例则大幅下降，细胞活力亦得到恢复，从而减轻H/R所带来的心肌细胞损伤。

自噬通量，即自噬过程从自噬泡的初始形成，历经自噬体的组装，自噬体与溶酶体的融合，直至底物的最终降解与回收利用的完整序列，是评估自噬动态变化及活性的客观指标^［9］。本研究使用mRFP‑GFP‑LC双荧光标记技术，系统性地检测了ANXA2下调在心肌细胞H/R损伤期间对自噬通量的影响。实验结果显示，心肌细胞经历H/R损伤后，自噬小体数量明显上升，而溶酶体数量则呈现明显下降趋势，提示心肌细胞的自噬通量受阻。通过下调ANXA2的蛋白表达水平，发现上述表型变化得到明显逆转，自噬流受阻状况得到有效缓解。进一步提示溶酶体‑自噬途径在自噬小体的降解及消化过程中扮演着核心角色，对于深入理解MIRI的发病机理及进展具有深远的科学意义。

本研究进一步通过Western blot检测各组心肌细胞中的ANXA2、P62、LC3Ⅱ、TFEB的蛋白表达水平发现，H/R+shANXA2组与H/R+Scramble组相比，ANXA2、P62、LC3Ⅱ蛋白表达降低，TFEB蛋白表达升高。这些结果表明，下调ANXA2能有效促进自噬通量，减少自死亡发生，从而减轻心肌细胞损伤。因此，本研究证实了ANXA2可通过抑制TFEB的表达和核转位，从而影响自噬通量和自死亡过程，最终加剧了心肌细胞H/R损伤。因此，以ANXA2为干预靶点可能是减轻MIRI的有效策略。

自死亡作为一种依赖于自噬的细胞死亡方式，与MIRI密切相关。在缺血/再灌注（I/R）过程中，心脏的自噬活动明显增强，可能导致心肌细胞内自噬体的异常累积和降解受阻，进而引发自死亡^［10］。TFEB作为关键的调控因子，能调控与自噬和溶酶体功能相关的基因表达^［11］。先前的研究存在争议，Nah等^［12］发现再灌注期间过表达TFEB会加剧自死亡，而Song等^［13］则报道称抑制TFEB的m6A修饰可上调其mRNA水平和蛋白的表达，同时能促进TFEB的核转位并增强自噬流活性。因此，如何合理的干预TFEB，从而减轻MIRI仍是目前需要解决的科学问题。

ANXA2作为一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，参与了包括炎症、凋亡、自噬及斑块形成在内的多种关键病理生理过程^{［14，15］}。过表达ANXA2可促进自噬体的形成，并影响自噬体与溶酶体的融合，从而调控自噬流和自死亡^［16］。Wang等^［17］的研究表明，ANXA2能靶向调控TFEB的细胞内定位和活性，从而影响溶酶体相关基因的表达。本研究结果发现，下调ANXA2的表达可恢复TFEB的蛋白表达水平，而非促进TFEB的过表达，这可能与ANXA2与TFEB结合能力减弱后TFEB核转位增加有关。TFEB的核内定位可促进多种溶酶体相关基因的转录，以维持其自身表达和溶酶体功能。已有研究证实，在神经元细胞中，ANXA2在脑I/R损伤和氧糖剥夺/复氧刺激下迅速升高，而敲除ANXA2则可明显抑制NF‑κB介导的促炎因子分泌，并明显减轻脑I/R损伤^［18］。然而，ANXA2在MIRI中的表达变化和作用机制有待深入研究。本研究通过构建心肌细胞H/R损伤模型模拟MIRI，发现ANXA2在MIRI中高表达，下调ANXA2表达可促进TFEB蛋白表达及核转位，进而增加自噬通量并抑制自死亡，最终减轻MIRI。

综上所述，本研究证实了ANXA2可通过抑制TFEB的表达和核转位，从而影响自噬通量和自死亡发生，最终加剧心肌细胞H/R损伤。因此，ANXA2可能是合理干预TFEB并治疗MIRI的有效靶点。

作者贡献度说明：

许卫攀：研究的构思与设计、论文的质量控制；刘滴：研究的实施、论文的修订与审校、对文章整体负责；金道群：研究的可行性分析；钟可文：资料的收集、整理与统计学分析；李柳青：论文的撰写。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

参考文献

[1] 国家心血管病中心， 中国心血管健康与疾病报告编写组. 中国心血管健康与疾病报告2023概要［J］. 中国循环杂志， 2024， 39（7）： 625‑660.

[2] National Center for Cardiovascular Diseases， The Writing Committee of the Report on Cardiovascular Health and Diseases in China. Report on cardiovascular health and diseases in China 2023： An updated summary［J］. Chin Circ J， 2024， 39（7）： 625‑660.

[3] Heusch G. Myocardial ischaemia‑reperfusion injury and cardioprotection in perspective［J］. Nat Rev Cardiol， 2020， 17（12）： 773‑789.

[4] Nah J， Zablocki D， Sadoshima J. Autosis： A new target to prevent cell death［J］. JACC Basic Transl Sci， 2020， 5（8）： 857‑869.

[5] Kong L， Xiong F， Sun N， et al. CaMKIIδ inhibition protects against myocardial ischemia/reperfusion injury： Role of Beclin‑1‑dependent autophagy［J］. Eur J Pharmacol， 2020， 886： 173539.

[6] Liu D， Wu H， Li Y， et al. Cellular FADD‑like IL‑1β‑ converting enzyme‑inhibitory protein attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via suppressing apoptosis and autophagy simultaneously［J］. Nutr Metab Cardiovasc Dis， 2021， 31（6）： 1916‑1928.

[7] Gu S， Tan J， Li Q， et al. Downregulation of LAPTM4B contributes to the impairment of the autophagic flux via unopposed activation of mTORC1 signaling during myocardial ischemia/reperfusion injury［J］. Circ Res， 2020， 127（7）： e148‑e165.

[8] Shen K， Miao J， Gao Q， et al. Annexin A2 plays a key role in protecting against cisplatin‑induced AKI through β‑catenin/TFEB pathway［J］. Cell Death Discov， 2022， 8（1）：430.

[9] 许卫攀， 徐航， 刘滴， 等. PCSK9通过溶酶体稳态‑自噬途径调控心肌缺氧再复氧损伤［J］. 海南医学院学报， 2024， 30（21）： 1601‑1606.

[10] Xu WP， Xu H， Liu D， et al. PCSK9 regulates myocardial hypoxic‑reoxygenation injury through lysosomal homeostasis/autophagy pathway［J］. J Hainan Med Univ， 2024， 30（21）： 1601‑1606.

[11] Zhang X， Lyu X， Zhou J， et al. Autophagic flux detection： Significance and methods involved［J］. Adv Exp Med Biol， 2021， 1208：131‑173.

[12] Nah J， Sung EA， Zhai P， et al. Tfeb‑mediated transcriptional regulation of autophagy induces autosis during ischemia/reperfusion in the heart［J］. Cells， 2022， 11（2）： 258.

[13] Chen F， Zhan J， Yan X， et al. FGF21 alleviates microvascular damage following limb ischemia/reperfusion injury by TFEB‑mediated autophagy enhancement and anti‑oxidative response［J］. Signal Transduct Target Ther， 2022， 7（1）： 349.

[14] Nah J， Zhai P， Huang C， et al. Upregulation of Rubicon promotes autosis during myocardial ischemia/reperfusion injury［J］. J Clin Invest， 2020， 130（6）： 2978‑2991.

[15] Song H， Feng X， Zhang H， et al. METTL3 and ALKBH5 oppositely regulate m⁶A modification of TFEB mRNA， which dictates the fate of hypoxia/reoxygenation‑ treated cardiomyocytes［J］. Autophagy， 2019， 15（8）： 1419‑1437.

[16] Koh M， Lim H， Jin H， et al. ANXA2 （annexin A2） is crucial to ATG7‑mediated autophagy， leading to tumor aggressiveness in triple‑negative breast cancer cells［J］. Autophagy， 2024， 20（3）： 659‑674.

[17] Zhang C， Zhou T， Chen Z， et al. Coupling of integrin α5 to annexin A2 by flow drives endothelial activation［J］. Circ Res， 2020， 127（8）： 1074‑1090.

[18] Pan B， Pan Y， Wang S， et al. ANXA2 and Rac1 negatively regulates autophagy and osteogenic differentiation in osteosarcoma cells to confer CDDP resistance［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2023， 676： 198‑206.

[19] Wang K， Zhang T， Lei Y， et al. Identification of ANXA2 （annexin A2） as a specific bleomycin target to induce pulmonary fibrosis by impeding TFEB‑mediated autophagic flux［J］. Autophagy， 2018， 14（2）： 269‑282.

[20] Tian X， Yang W， Jiang W， et al. Multi‑omics profiling identifies microglial annexin A2 as a key mediator of NF‑κB pro‑inflammatory signaling in ischemic reperfusion injury［J］. Mol Cell Proteomics， 2024， 23（2）： 100723.

基金资助

湖北省自然科学基金面上项目(2022CFB159)

湖北省卫生健康委科研资助(WJ2023F061)

湖北理工学院校级科研项目(22xjz6Q)

黄石市中心医院科研项目(ZX2023M02)