基于网络药理学和体外实验探究斑蝥酸钠抗舌癌的作用机制

Exploring the mechanism of sodium cantharidate against tongue cancer based on network pharmacology and in vitro experiments

摘要

目的 运用网络药理学剖析斑蝥酸钠抗舌癌的潜在机制，并通过体外实验初步验证其对舌鳞癌细胞的作用机制。 方法 借助TCMSP、PubChem数据库和Swiss Target Prediction平台，结合OMIM、GeneCards和DisGeNET数据库，筛选斑蝥酸钠与舌癌交集靶点。构建两者的共同靶点网络图。通过拓扑网络分析明确核心作用靶点。利用DAVID数据库进行GO功能富集和KEGG通路富集分析揭示斑蝥酸钠的作用通路。体外实验人舌鳞癌细胞系SCC‑25随机分为0、5、10、15、20、30 μmol/L斑蝥酸钠组，采用CCK8、克隆形成、划痕实验和流式细胞术评估斑蝥酸钠对SCC‑25细胞增殖、克隆形成、迁移和凋亡的影响；再次随机分为空白对照（Control）组、PI3K激动剂（740Y‑P）组、斑蝥酸钠（SCA）组、斑蝥酸钠+PI3K激动剂（SCA+740Y‑P）组。通过Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白及PCNA、Bcl‑2、Bax蛋白的表达。 结果 网络药理学分析显示斑蝥酸钠抗舌癌共有68个核心靶点，主要富集在癌症、PI3K/AKT等信号通路上。体外细胞实验结果显示，与0 μmol/L斑蝥酸钠组相比，5、10、15、20、30 μmol/L组SCC‑25细胞活力逐渐下降（P<0.01），5、10、15 μmol/L组SCC‑25细胞克隆形成及迁移能力下降，细胞凋亡率升高（P<0.05）。SCA组、SCA+740Y‑P组p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白比值及PCNA、Bcl‑2蛋白表达分别低于Control组、740Y‑P组（P<0.05），Bax蛋白表达分别高于Control组、740Y‑P组（P<0.000 1）。 结论 斑蝥酸钠可能通过抑制SCC‑25细胞中PI3K/AKT信号通路而抑制SCC‑25细胞增殖、迁移能力，并诱导细胞凋亡。

Abstract

Objective To analyze the potential mechanism of sodium cantharidate against tongue cancer using network pharmacology and preliminarily verify its effect pathway on tongue squamous cell carcinoma cells through in vitro experiments. Methods By using the TCMSP， PubChem databases and Swiss Target Prediction platform， combined with the OMIM， GeneCards and DisGeNET databases， the targets related to sodium cantharidate and tongue cancer were screened. And the common target network diagram of the two was constructed. The core action targets were identified through topological network analysis. And the DAVID database was used for GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis to reveal the action pathway of sodium cantharidate. In vitro experiments， human tongue squamous cell carcinoma SCC‑25 were randomly divided into the 0， 5， 10， 15， 20， and 30 μmol/L group. The effects of sodium cantharidate on the proliferation， colony formation， migration and apoptosis of SCC‑25 cells were evaluated by CCK8， clone formation， scratch assay and flow cytometry. Additionally， human tongue squamous cell carcinoma SCC‑25 were randomly divided into the Control group， the PI3K agonist （740Y‑P） group， the sodium cantharidate（SCA）group， and the sodium cantharidate + PI3K agonist（SCA+740Y‑P）group. Western blot was performed to detect the expression of proteins related to the PI3K/AKT signaling pathway， PCNA， Bcl‑2， and Bax proteins. Results Network pharmacological analysis showed that sodium cantharidate had a total of 68 core targets for treating tongue cancer， which were mainly enriched in cancer， PI3K/AKT and other signaling pathways. The results of in vitro cell experiments showed that compared to sodium cantharidate in the 0 μmol/L group， the viability of SCC‑25 cells in the 5， 10， 15， 20 and 30 μmol/L groups gradually decreased （P<0.01）， and the clonal formation and migration ability of SCC‑25 cells in 5， 10 and 15 μmol/L groups were decreased， and the apoptosis rate was increased （P<0.05）. The ratio of p‑PI3K/PI3K and p‑AKT/AKT proteins， and the protein expressions of PCNA and Bcl‑2 in SCA group and SCA + 740Y‑P group were lower than those in the control group and 740Y‑P group （P<0.05）， respectively. And the expression of Bax protein was higher than that in the Control group and 740Y‑P group （P<0.000 1）， respectively. Conclusion Sodium cantharidate may inhibit the proliferative and migratory capacities of SCC‑25 cells by suppressing the PI3K/AKT signaling pathway， while concurrently inducing apoptosis.

Graphical abstract

关键词

网络药理学 / 斑蝥酸钠 / 舌鳞癌 / 体外实验

Key words

Network pharmacology / Sodium cantharidate / Tongue squamous cell carcinoma / In vitro experiments

口腔鳞状细胞癌是指发生在口腔黏膜组织的恶性肿瘤，约占头颈恶性肿瘤的90%^［1］，通常会造成患者面型不对称、言语不清等异常改变。而舌鳞癌（tongue squamous cell carcinoma， TSCC）是口腔鳞癌中发生率最高的肿瘤之一^［2］，由于舌具有丰富的血供，加上其频繁的运动，这不仅加快了舌癌的进展速度，还增加了早期转移的风险，致使患者5年生存率较低^［3，4］。目前的治疗方式主要为手术切除，辅以放疗、化疗在内的综合治疗。但这些治疗存在明显的副作用，如影响发音和吞咽等关键功能，从而影响患者的总生存期^［5］，并可能导致复发和转移^［6］。因此，积极探索新的治疗药物，对于改善舌癌患者的预后，提高生存率以及阻止肿瘤扩散具有重要意义。中药活性成分在肿瘤治疗领域具有独特的优势，作为天然化合物，具备多靶点、多效应、副作用小及治疗效果强等特点^［7，8］，因此，挖掘中药治疗肿瘤及深入研究作用机制具有重要意义。

斑蝥素是芫菁科昆虫斑蝥体内分泌的一种萜类化合物，是主要的抗癌有效成分^［9］。同时，研究发现斑蝥素具有严重的毒副作用，对消化系统、泌尿系统等有强烈的刺激作用^［10］，这些副作用限制了其在临床上的应用。随着研究的不断深入，多种斑蝥素类衍生物相继问世。斑蝥酸钠（sodium cantharidate，SCA）是斑蝥素通过与氢氧化钠共同加热生成的衍生物^［11］，其不仅保留了斑蝥素的抗肿瘤活性，且毒副作用明显降低，已被广泛应用于多种肿瘤细胞的研究^{［12，13］}。但其在舌癌方面的研究罕见报道。基于此，本研究通过网络药理学分析和体外细胞实验，着重探讨斑蝥酸钠对舌鳞癌细胞生物学行为的影响及可能的作用机制，旨在为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人舌鳞癌细胞系SCC‑25购自美国模式培养物集存库（American type culture collection， ATCC）。

1.2 主要试剂

斑蝥酸钠注射液（批准文号：国药准字H52020601，贵州神奇药业有限公司）；胎牛血清（批号：2428321，以色列BI公司）；DMEM‑F12培养基（批号：6124281，美国Gibco公司）；0.25%EDTA的胰蛋白酶（批号：8123677，美国Gibco公司）；青‑链霉素（批号：234137，美国Gibco公司）；Cell Counting Kit‑8试剂盒（货号：MA0218‑2，大连美仑生物技术有限公司）；β‑actin抗体（货号：HA722023，批号：H680667024，华安生物科技有限公司）；AKT抗体（货号：10176‑2‑AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；p‑AKT抗体（货号：PC0876S，Abmart公司）；p‑PI3K抗体（货号：60225‑1‑lg，武汉三鹰生物技术有限公司）；PI3K抗体（货号：T40115，Abmart公司）；PCNA抗体（货号：10205‑2‑AP，武汉三鹰生物技术有限公司）；Bcl‑2抗体（货号：ET1702‑53，华安生物科技有限公司）；Bax抗体（货号：ER0907，华安生物科技有限公司）；Goat Anti‑Rabbit IgG HRP（货号：HA1001，批号：H651665001，华安生物科技有限公司）；PI3K激动剂（740Y‑P）（货号：1236188‑16‑1，MCE公司）；ECL化学发光试剂盒（货号：MA0186‑1，批号：MA0186‑1‑Aug‑08l，大连美仑生物技术有限公司）；Annexin V‑FITC/PI凋亡检测试剂盒（货号：AP101，批号：A406414，中国联科生物）。

1.3 仪器

超净工作台（新加坡ESCO公司，型号：ACB‑4E1）、倒置显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：CKX53）、二氧化碳培养箱（美国Thermo公司，型号：BB150）、微量移液器（德国Eppendorf公司）、垂直蛋白电泳仪（美国BIO‑RAD公司，型号：Mini PROTEAN^®Tetra Cell）、蛋白转印设备（美国BIO‑RAD公司，型号：Mini Trans‑Blot^®Cell）、高速冷冻离心机（美国Thermo公司，型号：Fresco 21）、多功能酶标仪（美国Beckman公司，型号：DTX880）、流式细胞仪（美国BD公司，型号：BD FACSVerse™ Flow Cytometer， Cat No.651154）、4 ℃和-20 ℃冰箱（青岛海尔公司，型号：BCD‑190WDPT）、-80 ℃超低温冰箱（青岛海尔公司，型号：DW‑86L338J）。

1.4 基于网络药理学探讨斑蝥酸钠对舌鳞癌的机制预测

1.4.1 查找斑蝥酸钠作用靶点

通过TCMSP数据库（http:∥old.tcmsp‑e.com/）、PubChem数据库（https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找斑蝥酸钠的活性结构，结合Swiss Target Prediction平台确定药物靶点。并通过UniProt数据库（https:∥www.uniprot.org/）将这些靶点转换为对应的基因名称。

1.4.2 斑蝥酸钠抗舌癌作用靶点预测

在OMIM（https:∥www.omim.org/）、GeneCards（https:∥www.genecards.org/）和DisGeNET（https:∥www.disgenet.org/）3个疾病数据库以“tongue cancer”为关键词检索舌癌相关靶点。利用Venny2.1.0平台，将斑蝥酸钠靶点和舌癌靶点合并取交集，得到斑蝥酸钠治疗舌癌的潜在靶点信息。

1.4.3 构建斑蝥酸钠抗舌癌作用靶点的蛋白质相互作用网络

将“1.4.2”获得的交集靶点上传至STRING在线分析平台（https:∥string‑db.org/），选择多蛋白复合物模式（multiple proteins）进行网络建模，参数设置如下：研究对象限定为“Homo sapiens”，相互作用置信度（confidence）阈值设置为≥0.95，其余参数为默认值。完成网络构建后，导出包含节点属性及互作关系的TSV文件。将TSV文件导入Cytoscape3.10.2软件进行可视化分析。根据度（Degree）值排名筛选出斑蝥酸钠抗舌癌的核心靶点。

1.4.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

采用DAVID6.8数据库（https：//davidbioinformatics.nih.gov/）对药物‑疾病交集靶点进行GO功能富集与KEGG通路富集分析，系统性解析斑蝥酸钠抗舌癌的潜在作用机制。GO富集分析从生物学过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）3大功能维度揭示靶点参与的病理生理活动、阐释靶点的生化活性特征及明确靶蛋白的亚细胞定位。筛选P<0.05的条目。利用GraphPad Prism9.5.1软件构建富集条目分布柱状图，同时采用R软件完成KEGG通路富集气泡图的可视化呈现。

1.5 体外细胞实验探讨斑蝥酸钠抗舌鳞癌的作用机制

1.5.1 SCC‑25细胞培养

将人舌鳞癌SCC‑25细胞接种在T25培养瓶内，加入4 mL含10%胎牛血清和含1%青、链霉素混合液的DMEM/F12培养基，放于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。当细胞生长至覆盖培养瓶的80%~90%面积时，用PBS轻轻清洗细胞2次，用0.25%含EDTA胰蛋白酶消化液1 mL消化2 min，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入2 mL完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min后，去除上清液并重悬计数。根据后续实验调整至所需的细胞密度。

1.5.2 CCK8实验

取生长状态良好的SCC‑25细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液，调整细胞密度为3 000个/孔，接种于96孔板中，放入37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h后，细胞贴壁。分别加入终浓度为0、5、10、15、20、30 μmol/L的斑蝥酸钠，继续放入培养箱内培养24 h后，分别于每孔加入10 μL CCK8溶液，于细胞培养箱内孵育2 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），实验重复3次，并计算细胞存活率，存活率（%）=（实验孔吸光度-空白孔吸光度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.5.3 平板克隆形成实验

调整SCC‑25细胞密度为800个/孔，接种至6孔板中，轻摇使细胞均匀分布。放入37 ℃、5% CO₂细胞培养箱，细胞贴壁后分别加入终浓度为0、5、10、15 μmol/L的斑蝥酸钠，继续培养24 h后弃旧液，PBS溶液轻轻清洗2次，每孔加入2 mL完全培养基，继续培养2周，每3天更换1次培养基，直至肉眼可见克隆形成时终止培养，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色15 min，PBS轻轻洗涤3次后置于通风处晾干，拍照并计数。

1.5.4 划痕实验

将对数生长期SCC‑25细胞以2×10⁶个细胞/孔均匀接种至6孔板中，在37 ℃、5% CO₂环境下培养至细胞单层覆盖率达90%以上。用200 μL无菌移液器吸头沿培养板纵轴方向均匀划出直线划痕，随后用PBS轻柔漂洗3次以清除划下的细胞碎片，分别加入斑蝥酸钠终浓度为0、5、10、15 μmol/L的不含血清的DMEM/F12培养基。分别在划痕后0、24 h时相同视野下显微成像，观察各组细胞迁移情况，拍照记录，用ImageJ软件处理图像。

1.5.5 流式细胞术实验

将SCC‑25以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，贴壁后分别加入终浓度0、5、10、15 μmol/L斑蝥酸钠处理24 h。收集培养上清、PBS清洗液及细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，预冷PBS洗涤2次。用500 μL结合缓冲液重悬细胞，依次加入5 μL Annexin V‑FITC和10 μL PI染色，室温避光孵育5 min。流式细胞仪检测，采用FlowJo 10.8.1软件对细胞凋亡进行分析。

1.5.6 Western blot实验

细胞分组及给药：将SCC‑25细胞随机分为空白对照（Control）组、740Y‑P组、斑蝥酸钠（SCA）组、斑蝥酸钠+740Y‑P（SCA+740Y‑P）组，根据CCK8实验结果确定斑蝥酸钠给药浓度为其半数抑制浓度（IC₅₀）值，通过查阅文献［14］及前期预实验确定740Y‑P给药浓度为30 μmol/L，SCA+740Y‑P组先提前使用740Y‑P干预1 h，然后再加入斑蝥酸钠。将各组细胞置于37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱内继续培养24 h后，收集细胞进行蛋白免疫印记实验。

将收集的各组细胞加入200 μL细胞裂解液及2 μL磷酸酶抑制剂A和2 μL磷酸酶抑制剂B，于4 ℃冰上裂解30 min，12 000 r/min离心15min，取上清，使用BCA试剂盒测定每个样本蛋白浓度。取20 μg蛋白加入蛋白上样缓冲液，100 ℃恒温金属浴煮沸变性10 min，10% SDS‑PAGE，80 V电泳，待蛋白marker条带分开时，将电压调至120 V，待目的蛋白条带分开时转膜400 mA，35 min，5% BSA封闭液室温封闭15 min。一抗：PI3K（1∶1 500）、p‑PI3K（1∶2 000）、AKT（1∶4 000）、p‑AKT（1∶1 500）、PCNA（1：10 000）、Bcl‑2（1∶2 000）、Bax（1∶5 000）、β‑actin（1∶100 000）4 ℃孵育过夜，1×TBST室温洗3次，10 min/次；二抗：Goat anti‑Rabbit（1∶50 000）室温孵育1 h，1×TBST室温洗3次，10 min/次；利用ECL化学发光法显影，ImageJ软件进行灰度分析。以β‑actin作为内参对照。蛋白相对表达量以目标蛋白灰度值与β‑actin灰度值的比值计算。

1.6 统计学处理

运用GraphPad Prism9.5.1进行实验数据统计分析。计量资料以\overline{x}\pm s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 斑蝥酸钠抗舌癌潜在靶点

从TCMSP、PubChem数据库中获取斑蝥酸钠103个靶点。从GeneCards、OMIM、DisGeNET 3个疾病数据库筛选出舌癌5 887个靶点，将斑蝥酸钠与舌癌靶点进行交集，得到68个共有非重复靶点。结果见图1。

2.1.2 斑蝥酸钠抗舌癌PPI网络图

将“2.1.1”中斑蝥酸钠与舌癌交集的靶基因导入STRING数据库得到68个节点和504条连线，节点代表靶点，剔除游离节点，保存数据为TSV文件。将TSV文件导入Cytoscape 3.10.1软件进行可视化分析，根据度值排名，排在前6的核心靶点依次为AKT1、CTNNB1、CASP3、GSK3B、ESR1、HSP90AB1，提示这些靶点可能是斑蝥酸钠抗舌癌的潜在核心靶点，结果见图2，圆形越大，颜色越深，代表该靶点在网络节点中越重要。

2.1.3 斑蝥酸钠抗舌癌GO功能富集和KEGG通路富集分析

将68个预测靶基因导入Metascape系统进行GO功能富集分析，分别获得了273条BP，主要包括磷酸化、细胞凋亡等；涉及77条MF，主要为酶结合、蛋白丝氨酸激酶活性、锌离子结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白激酶等。得出49条CC，主要包括细胞质、磷脂酰肌醇、细胞液、核被膜、核质、染色体及端粒、蛋白核酸复合体等。以P值为筛选条件（从小到大），选取前10个BP、CC、MF会制可视化条形图，见图3。斑蝥酸钠在抗舌癌的过程中参与KEGG富集的133条信号通路，依据P值大小选取排名前20的通路绘制KEGG通路气泡图，见图4，主要涉及癌症通路、前列腺癌、PI3K/AKT信号通路等。所以选择PI3K/AKT信号通路相关指标进行后续研究。

2.2 细胞实验结果

2.2.1 SCA对SCC‑25细胞活力的影响

为了探究SCA对SCC‑25细胞生长活力的影响，通过CCK8实验检测不同浓度SCA作用于SCC‑25细胞24 h后的生长抑制效果。与0 μmol/L（未处理组）相比，5、10、15、20、30 μmol/L组SCC‑25细胞存活率均降低，且随药物浓度的升高，细胞活力明显下降，呈浓度依赖性，见图5A。此外，通过药物剂量效应曲线分析，SCA对SCC‑25细胞作用24 h的IC₅₀为11.05 μmol/L，见图5B，IC₅₀值用于后续Western blot实验研究。

2.2.2 SCA对SCC‑25细胞克隆增殖能力的影响

通过平板克隆形成实验探究不同浓度SCA对SCC‑25细胞克隆增殖的影响。细胞单克隆集落形成大小随SCA浓度增加呈逐渐变小趋势，见图6A。与0 μmol/L（未处理组）比较，各实验组SCC‑25细胞克隆形成能力明显被抑制，且随药物浓度增加，克隆形成能力明显降低，见图6B、C，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2.3 SCA对SCC‑25细胞形态及迁移能力的影响

通过倒置显微镜观察及划痕实验测定SCA作用SCC‑25细胞24 h后细胞形态的改变及对细胞迁移能力的影响。随SCA药物浓度的增加，SCC‑25细胞形态逐渐萎缩，变圆，细胞贴壁能力减弱，部分细胞漂浮，见图7A；与未处理组相比，5、10、15 μmol/L组细胞的迁移能力明显下降（P<0.05），见图7B、C，差异具有统计学意义。

2.2.4 SCA对SCC‑25细胞凋亡的影响

为了探究SCA对SCC‑25细胞凋亡的影响，通过流式细胞术测定SCA作用于SCC‑25细胞24 h后细胞凋亡变化情况。与未处理组相比，5、10、15 μmol/L组细胞凋亡比例明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05），见图8。

2.2.5 SCA对SCC‑25细胞PI3K/AKT信号通路、增殖及凋亡相关蛋白的影响

通过Western blot实验评估PI3K、p‑PI3K、AKT、p‑AKT、PCNA、Bcl‑2、Bax蛋白表达水平。与Control组比较，SCA组p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白比值及PCNA、Bcl‑2蛋白表达降低（P<0.01），Bax蛋白表达升高（P<0.000 1），740Y‑P组p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白比值及PCNA、Bcl‑2蛋白表达升高（P<0.05），Bax蛋白表达降低（P<0.001）；与740Y‑P组比较，SCA+740Y‑P组p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT蛋白比值及PCNA、Bcl‑2蛋白表达降低（P<0.001），Bax蛋白表达升高（P<0.000 1）。见图9。

3 讨论

舌癌是一种常见的口腔癌类型，其发病率在全球范围内呈上升趋势，且发病逐渐年轻化。目前，舌癌的发病机制尚未完全明确，给临床治疗带来了诸多困难。尽管手术治疗是早期舌癌患者的主要治疗手段，但对于晚期患者，尤其是失去手术机会的患者，迫切需要新的治疗策略来提高生存率。中医在癌症治疗领域的应用历史悠久，其疗效在各种癌症中得到广泛认可^{［15，16］}，这为舌癌的治疗提供了新的方向和思路。斑蝥酸钠作为一种具有潜力的抗肿瘤药物，已被多项研究证实可通过抑制多种肿瘤信号通路发挥抗肿瘤作用^{［17，18］}，并且在肝癌的临床治疗中展现出明确的疗效和良好的安全性^［19］。而斑蝥酸钠抗舌癌的研究罕见。基于此，本项研究旨在深入探讨斑蝥酸钠对舌鳞状细胞癌的作用机制。

首先，通过运用网络药理学方法，对SCA抗TSCC的潜在机制进行系统分析。通过整合多个数据库资源，收集并整理了5 887个与TSCC相关的靶点以及103个与SCA相关的靶点，进一步筛选出68个交集靶点进行后续分析。这一步骤为后续深入研究SCA抗TSCC的机制提供了全面的数据基础。接着，通过构建PPI网络，以揭示这些靶点之间的相互作用关系。为进一步探究SCA抗TSCC的潜在信号通路，进行KEGG通路富集分析。结果表明，PI3K/AKT信号通路可能是SCA发挥抗TSCC作用的重要途径，这一结果与之前的研究报道相符^{［13，19］}。

无限增殖和转移是恶性肿瘤基本特点之一，它是肿瘤生长的前提，与肿瘤发生、发展密切相关^［20］。在本次研究中，通过CCK8检测不同浓度SCA对SCC‑25细胞活力的影响。结果显示，细胞存活率随药物浓度增加逐渐降低，并呈浓度依赖性。通过平板克隆形成实验检测SCA对SCC‑25细胞增殖的影响。结果显示，SCA浓度越高，细胞克隆集落形成数量越少，细胞增殖受到明显抑制。同时划痕实验检测发现SCA能有效抑制SCC‑25细胞迁移能力。

细胞凋亡，即程序性细胞死亡，发生在多种生理环境中，其作用是清除有害、受损或不需要的细胞。细胞凋亡失调不仅导致肿瘤发生和进展，还导致肿瘤对治疗耐药^［21］。癌前病变中DNA损伤导致的细胞凋亡诱导可以去除潜在的有害细胞，从而阻止肿瘤生长^［22］。因此，通过诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症有效策略之一。本次研究通过流式细胞术检测结果显示，随着SCA浓度升高，SCC‑25细胞凋亡比例逐渐增加，提示SCA可能通过诱导SCC‑25细胞凋亡发挥抗舌癌作用。

PI3K/AKT通路是一个重要的细胞内信号传导途径，它在多种生物学过程中起着核心作用。PI3K由一个p110催化亚基和一个p85调节亚基组成，其中p110负责催化活性，而p85则负责调节p110的活性^［23］。PI3K的激活通常是由细胞表面受体（如酪氨酸激酶受体）的激活引起^［24］。AKT是PI3K下游的直接效应分子，包含PH结构域、激酶结构域和羧基末端调节结构域。其中，PH结构域能够特异性地结合PIP3，使得AKT从细胞质转移到细胞膜上，在细胞膜上AKT的2个关键位点Thr308和Ser473在3‑磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1等激酶的作用下，相继被磷酸化，从而获得完全激活的状态^［25］。研究发现PI3K/AKT信号通路激活可促进细胞存活、抑制细胞凋亡，并刺激细胞迁移和侵袭^{［26，27］}。因此，使该通路失活可能是治疗肿瘤的有效策略之一。本研究通过Western blot检测发现SCA能明显下调SCC‑25细胞内p‑PI3K/PI3K、p‑AKT/AKT、PCNA、Bcl‑2蛋白表达水平，并上调Bax蛋白表达水平，提示SCA可能通过抑制PI3K/AKT信号通路而抑制SCC‑25细胞增殖，诱导细胞凋亡。

综上所述，本研究通过网络药理学分析和细胞实验验证，明确了SCA抗TSCC的核心靶点及信号通路。通过细胞实验从细胞功能和蛋白表达水平证实了SCA可能的作用机制，验证了SCA可有效抑制人舌鳞癌SCC‑25细胞的增殖、迁移，诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。为SCA在舌癌治疗中的应用提供了理论依据，使SCA有望成为一种具有广阔前景的抗TSCC多靶点药物，为晚期舌癌患者带来新的希望。未来，本课题将进一步深入研究SCA的具体作用机制，为其临床应用提供更坚实的理论基础。

作者贡献度说明：

路娜：负责实验设计、实验操作、统计数据及分析、论文撰写；周可：项目负责人，指导论文写作、提供经费支持；马洪：负责文章修改及校对。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

贵州省卫生健康委科学技术基金项目(gzwkj2023‑444)

贵州医科大学口腔医学院横向课题项目(GYKQ2022HX03)